蛹虫草胞外多糖的提取纯化及免疫活性研究

目的提取纯化蛹虫草发酵液中的胞外多糖,初步研究其结构及免疫活性。方法乙醇沉淀多糖,用Sevag法除去蛋白质、透析法除去小分子物质,经CM-52纤维素柱层析后得纯品。用紫外光谱测定多糖纯度,用凝胶柱层析法测定相对分子质量,高效毛细管电泳和红外光谱分析其分子结构,检测胞外多糖对小鼠巨噬细胞系RAW264.7产生NO的影响。结果蛹虫草胞外多糖经脱蛋白、CM-52纤维素柱层析后可获得单一对称峰的纯多糖,相对分子质量为3.49×10^4,含羟基、糖醛结构和羰基结构,单糖基之一为甘露糖。多糖可显著刺激巨噬细胞分泌NO,具有活化免疫细胞、增强机体免疫力的作用。结论该方法可获得高纯度蛹虫草胞外多糖,并证明它对巨噬细胞有活化作用。     

蛹虫草高产胞外虫草素和虫草多糖的诱变育种

通过诱变获得高产胞外虫草素和虫草多糖的蛹虫草菌株.采用紫外线诱变(UV)、化学诱变(LiCl)、复合诱变(UV-LiCl) 3种方式对蛹虫草孢子进行诱变;发酵检测存活菌株的胞外虫草素和虫草多糖的含量.结果:以胞外虫草素为指标,3种诱变方式的最大正突变率分别为化学突变(29.2％)＞紫外突变(28.6％)＞复合诱变(26.5％);以胞外多糖为指标,最大正突变率分别为紫外诱变(35.7％)＞复合诱变(33.3％)＞化学诱变(27.0％).紫外诱变突变株Z-5-1胞外虫草素产量达0.842g/L,比出发菌株高311％;紫外诱变突变株Z-4-7胞外虫草多糖产量达5.250g/L,比出发菌株高148％.在连续培养5代后,仍具有较好的遗传稳定性.紫外诱变能获得较高的蛹虫草正突变率,同时能获得高产虫草素、虫草多糖的突变株.     

蛹虫草胞外锌多糖抗氧化能力的研究

以蛹虫草为材料通过液体深层富锌培养获得胞外富锌多糖,测定了蛹虫草胞外富锌多糖的锌含量和抗氧化性能,即清除氧自由基、羟自由基和DPPH的能力。实验结果表明:蛹虫草富锌培养基内ZnSO4浓度在150μg/mL下,可以显著提高胞外锌多糖的有机锌含量(P<0.01),使有机锌含量达到0.87mg/g,比对照提高295%。有机锌对提高胞外锌多糖清除自由基的能力有显著的促进作用(P<0.01),清除氧自由基、羟自由基和DPPH的能力分别是对照的7.05%、23.5%和17.49%;胞外锌多糖对自由基的清除能力与多糖浓度呈明显的剂量-效应关系(P<0.01)。     

蛹虫草胞外多糖的制备、结构分析及其免疫活性

本实验选择蛹虫草菌株CICC 14014液态发酵培养,提取蛹虫草胞外多糖,测定其理化性质及结构,并对其免疫活性进行研究。采用DEAE-Sephacel阴离子交换柱联合Sephadex G-200葡聚糖凝胶柱纯化蛹虫草胞外多糖;利用高效液相色谱法测定多糖分子质量,利用傅里叶变换红外光谱鉴定多糖结构;选用BALB/c小鼠构建免疫损伤模型,考察其体质量及免疫器官指数变化情况,观察其脾脏组织切片形态,计算其T、B细胞增殖率,测定其血清细胞因子及免疫球蛋白质量浓度。结果表明,蛹虫草发酵液中多糖质量浓度为3.15 mg/mL,经分离纯化后所得单一多糖分子质量为3.67 kDa,纯度可达86.13%。动物实验结果表明,蛹虫草胞外多糖可明显提高免疫器官指数,能够有效促使T细胞（低剂量时）、B细胞增殖和免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）G、IgA、IgM、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素（interleukin,IL）-6、IL-2、干扰素（interferon,IFN）-γ的分泌,免疫调节效果显著。研究结果表明蛹虫草胞外多糖可修复环磷酰胺导致的BALB/c小鼠免疫功能损伤,为开发蛹虫草发酵液资源建立了部分理论支撑。     

蛹虫草菌胞外多糖发酵动力学的研究

对蛹虫草胞外多糖的发酵过程和发酵动力学进行了研究。基于菌丝体的定义(dCx/dt=μCx)和菌丝体比生长速率μ[μ=μ(t)],得到了描述发酵过程中菌丝体生长和胞外多糖生成的数学模型,同时对实验数据与模型进行了比较,结果拟合良好,说明此模型较好地反映了蛹虫草胞外多糖的发酵过程及其动力学机制。      

蛹虫草多糖提取纯化工艺研究

为能更好地产业化开发利用蛹虫草,对蛹虫草多糖的提取纯化工艺进行研究。通过正交试验探讨了料液比、提取温度和提取时间对多糖提取率的影响,在此基础上通过分析不同的醇沉和去蛋白纯化条件,确定蛹虫草多糖的最佳制备工艺。结果表明,最佳工艺为先在液料比30∶1(V∶m)、提取温度70℃和提取时间4h下提取多糖,然后在浓缩液浓度为14%、乙醇溶液浓度为80%下进行醇沉,再调节多糖溶液的pH=3并加入4%的硫酸锌。整个工艺多糖提取率为8.97%,纯度高达68.9%,有良好的去杂纯化效果且多糖损失较小。该研究为产业化生产蛹虫草多糖提供了基础数据。     

关于蛹虫草菌多糖发酵及培养基的研究

研究了蛹虫草胞外多糖发酵过程，分析不同因素对胞外多糖得率的影响，获得了比较适宜的培养基组成和发酵条件。蛹虫草胞外多糖优化发酵培养基组成为：蔗糖12％，玉米浆2％，酵母膏2％，硝酸钾0．45％；发酵培养条件为：pH值6．5，温度20℃。此条件下蛹虫草胞外多糖得率为1．188g／100mL，菌丝体干重为1．221g／100mL。     

蛹虫草培养基多糖的提取及抗肿瘤活性研究

为综合利用蛹虫草小麦培养基,研究培养基多糖的提取和开发。在热回流水提法和超声波水提法单因素试验的基础上,采用热回流水提法正交试验筛选蛹虫草小麦培养基粗多糖最佳的提取工艺;用 MTT法检测了不同处理提纯多糖的抗肿瘤活性。结果表明热回流水提法提取培养基粗多糖效果优于超声波水提法;提取温度100 ℃、料液比1 g∶25 mL、提取3次、每次提取时间90 min,为最佳培养基粗多糖提取工艺;影响粗多糖提取效率的4个因素的主次关系是：提取温度>提取时间>提取次数>料液比;粗多糖的得率随着醇沉浓度的提高而提高。MTT试验发现质量浓度为5 mg/mL、培养时间72 h,培养基脱脂脱蛋白多糖A对HepG2肝癌细胞抑制率可达到83.02%,培养基脱脂多糖B的抑制率可达到75.39%,培养基未脱脂脱蛋白粗多糖C抑制率为30.61%,提纯多糖表现出较高的抑制率;100 ℃热回流水提蛹虫草子实体脱脂脱蛋白多糖F,质量浓度为5 mg/mL、培养72 h后,对Hepg2细胞抑制率平均值达到92.974%,与对照顺铂（SB）无显著差异,与多糖A差异显著。     

蛹虫草培养基多糖的超声波提取及抗氧化性研究

研究用超声波提取蛹虫草培养基中粗多糖的工艺条件,并比较了该多糖与蛹虫草子实体多糖的抗氧化性。结果表明:在料液比1∶30(质量比),乙醇用量15 mL,超声波功率70 W,超声时间90 min的条件下,蛹虫草培养基中多糖含量为3.30%。在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL浓度范围内蛹虫草培养基多糖与子实体多糖抗氧化能力相似,且具有一定的量效关系。红外显示两种多糖结构相同。     

阿魏侧耳胞外多糖分离纯化及其免疫活性研究

研究了阿魏侧耳( Pleurotus ferulae Lanzi)胞外多糖的分离纯化及其对巨噬细胞和脾淋巴细胞的免疫调节作用.采用醇沉、透析、冷冻干燥、DEAE-52 柱层析和 Sephadex G-100 柱层析等方法从发酵液分离纯化阿魏侧耳胞外多糖,通过高效凝胶渗透色谱法与高效液相色谱法测定其分子质量和单糖组成,以...     

蛹虫草多糖的提取及对小鼠脾细胞增殖的影响

采用超声波-微波协同法提取蛹虫草多糖,并研究其对小鼠脾细胞增殖的影响,初步评价其免疫活性。通过单因素和L18(37)正交试验研究了物料粒度、料液比、超声波功率、超声波时间、超声提取次数、提取温度、乙醇与浓缩液之比对蛹虫草多糖提取率的影响。正交试验结果表明,超声波功率、物料粒度对蛹虫草多糖的得率均呈现出显著的影响,进而确定蛹虫草多糖提取最优工艺参数:物料粒度0.150 mm,提取次数为3次,微波功率400 W,超声波功率300 W,超声波处理时间30 min,提取温度70℃,料液比1∶40(g/mL),乙醇与浓缩液之比4∶1(体积比)。在最佳条件下,可得到多糖提取率为6.28%。小鼠脾细胞增殖试验表明,在一定的剂量内,提取到的蛹虫草多糖能明显促进小鼠脾细胞的增殖,表明蛹虫草多糖具有免疫调节活性。     

蛹、米虫草多糖含量及抗氧化活性比较研究

旨在研究不同来源北虫草子实体多糖的含量差异以及分级醇沉各组分的抗氧化活性差异。通过热水浸提、分级醇沉法分别获得蛹虫草多糖(Cordyceps militaris polysaccharide,CMP)、米虫草多糖(Cordyceps oryzae polysaccharide,COP);以DPPH自由基清除率、羟基自由基(·OH)清除率和铁离子还原能力法(ferric reducing antioxidant power,FRAP)评价两种多糖的体外抗氧化活性;构建H_2O_2致PC12细胞氧化损伤模型,比较两种虫草多糖对氧化损伤的PC12细胞的保护作用。不同乙醇浓度沉淀获得的虫草多糖中,米虫草多糖提取率及含量高于蛹虫草多糖;米虫草多糖对DPPH自由基、·OH清除率分别可达66.43%、69.22%,蛹虫草多糖可达73.69%、73.50%;FRAP法测得蛹虫草多糖抗氧化能力较强。细胞试验结果表明,氧化损伤的PC12细胞经两种多糖处理后细胞存活率皆有不同程度的提升,呈浓度依赖性,蛹虫草多糖组细胞存活率最高可达90.45%,米虫草多糖组细胞存活率最高可达82.62%。以蚕蛹为培养基的蛹虫草在多糖提取率及含量方面低于以大米为培养基的米虫草,但其多糖对自由基清除能力及PC12细胞保护作用优于米虫草多糖,具有较好的抗氧化能力。     

蛹虫草多糖的提取工艺优化及其抗氧化活性研究

以蛹虫草多糖(Cordyceps militaris polysaccharides,CMP)的提取得率为指标,通过单因素和响应面法对CMP的提取工艺进行优化。采用乙醇分级法,将CMP进行乙醇分级,分别得到4种多糖组分(CMP20、CMP40、CMP60和CMP80),并对不同多糖的得率、组分含量及抗氧化活性进行比较。结果表明,CMP的最优提取条件为温度84℃、液料比33∶1(m L/g)和时间128 min。在此条件下,实际提取得率为7.83%;CMP20、CMP40、CMP60和CMP80的得率分别为7.06%、15.07%、17.83%、25.23%。其中,CMP80的得率最高,蛋白含量最低,仅为1.47%;5种多糖均具有一定的抗氧化活性,CMP60的还原力和DPPH自由基清除率均为最高,CMP80的羟自由基的清除率最高。     

蛹虫草蛋白质的碱法提取工艺

以蛹虫草子实体为原料,通过碱法提取蛹虫草的蛋白质,以蛋白质的提取率作为提取工艺的衡量指标。在单因素实验的基础上,通过Box-Behnken模型对提取工艺进行响应曲面优化,在提取温度为60℃的条件下,确定最佳提取条件为:提取时间128 min,料液比为1∶16.2(g∶mL),NaOH溶液的浓度0.14 mol/L。在此条件下验证蛋白质的得率为88.92 mg/g与预测值88.19 mg/g接近。     

蛹虫草多糖的纯化及其分子量的测定

以蛹虫草子实体为材料,对水提醇沉、硫酸锌盐去蛋白后获得蛹虫草粗多糖（CP）进行分离纯化。采用膜分离技术、DEAE．52柱层析及SephadexG-100柱层析对CP进行分离纯化,并使用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定各组分多糖分子量,以表征不同路径所得多糖的分子量分布。结果表明：CP经膜过滤、DEAE-52柱层析及SephadexG-100进一步柱层析得到多糖组分CP2-c2-s2,经HPGPC法鉴定,CP2-c2-s2为均一多糖组分,其平均分子量为20200Da。     

鸡腿菇多糖的提取及纯化研究

鸡腿菇中含有丰富的糖类,食用菌中的多糖具有提高免疫、降血糖、抗肿瘤、抗病毒等功能。微波对细胞的结构有较大作用。应用微波辅助提取手段,能够显著缩短萃取时间,较大程度地提高多糖的萃取效率。利用复合酶解（纤维素酶、半纤维素酶、中性蛋白酶）、微波辅助提取、树脂纯化技术生产纯度较高的鸡腿菇多糖。     

蛹虫草液态深层发酵的研究

采用二次饱和D 最优试验设计方法 ,在 3 0L生物反应器中进行了蛹虫草液态深层发酵。当初始温度为 2 2℃ ,pH 6 3～ 6 5 ,搅拌速度 1 80r/min ,通风量 1 2 1m3/h ,发酵 72h和 96h ,蛹虫草菌丝体 (干 )产率分别为 3 8 6g/L和 42 3g/L。用HPLC法检测腺苷和蛹虫草菌素的含量 ,72h时分别为湿菌丝体中 0 3 5 2 μg/g和 0 1 3 4μg/g ,发酵液中 0 1 79μg/mL和 0 1 0 2 μg/mL ;用比色法在41 2nm处检测虫草酸的含量 ,湿菌丝体中为 2 3 40 6mg/g,发酵液中为 6 61mg/mL。     

米糠多糖提取与纯化的研究

本文对米糠多糖的提取纯化进行了研究，确定了最适工艺，最后通过气相色谱分析得出多糖中以半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖为主，还有一定量的鼠李糖、木糖和甘露糖。     

山茱萸多糖的提取及纯化工艺研究

本实验对山茱萸中水溶性多糖的提取纯化工艺进行了研究。通过单因素试验和均匀设计试验,研究了温度、时间、料液比对多糖提取得率的影响,结果显示:提取温度是影响多糖提取得率的主要因素,最佳提取工艺为料液比1:36,温度100℃,时间180min,在此条件下,山茱萸多糖提取得率为199.36mg/g。通过乙醇沉淀、透析、DE-52柱层析对提取的山茱萸粗多糖进行纯化。纯化的山茱萸多糖经紫外光谱分析不含蛋白质和核酸,琼脂糖凝胶电泳得到单一区带,表明为分子大小均一的单一组分多糖。