Genome shuffling of Zygosaccharomyces rouxii to accelerate and enhance the flavour formation of soy sauce

BACKGROUND: The purpose of this study was to achieve rapid improvement of the flavour of soy sauce by increasing the salt stress resistance of Zygosaccharomyces rouxii. Here, we describe genome shuffling to improve the salt tolerance of Z. rouxii while simultaneously enhancing and accelerating flavour formation of soy sauce. RESULTS: A mutant, S3‐2, with a stronger resistance to salt, was selected after three rounds of genome shuffling. S3‐2 not only grew well in peptone/yeast extract/dextrose medium containing a high salt content with wide range of pH, but also exhibited stronger stress resistance to potassium chloride and lithium chloride. In high‐salt liquid fermentation, S3‐2 obviously accelerated flavour formation of soy sauce, thus decreasing the total time required for development of the aroma. In addition, S3‐2 gave high amino acid nitrogen and good flavour. In particular, the ethyl acetate content was 2.38 times that in the control. S3‐2 distinctly improved the formation of 4‐hydroxy‐2 (or 5) ‐ethyl‐5 (or 2) ‐methyl‐3 (2H) ‐furanone by up to 75%. Another important flavour component, 4‐ethylguaiacol, was also detected. CONCLUSIONS: Genome shuffling was successfully used to achieve significant improvements in flavour formation. The selected strain improved the main flavour components and amino acid nitrogen, thereby enhancing the quality of soy sauce. Copyright © 2009 Society of Chemical Industry     

替代法低盐酿造酱油品质研究

目的 为降低酱油中氯化钠的含量,采用氯化钾(K组)与乙醇(乙组)替代酱油中的氯化钠,对比研究两种低盐酱油的品质和安全性。方法 通过高盐稀态一贯型发酵酿造高品质低盐酱油,测定了不同氯化钾(K组)与乙醇(乙组)低盐酱油的氨基酸态氮,总酸,食盐,呈香物质等指标。结果 与CK组相比,氯化钾与氯化钠比例为4∶6,5∶5和6∶4时能显著增加酱油中氨基酸态氮的含量;乙醇和氯化钠的浓度比例分别为3∶20,4∶19,5∶18和6∶17时会降低酱油中总酸的含量。K组和乙组成品酱油中的食盐含量均随替代比例的增大而显著降低,且乙组降低更为显著。另外,氯化钾与氯化钠比例为4∶6的酱油成品挥发性香气物质的种类最多;乙醇和氯化钠比例为5∶18的酱油成品挥发性香气物质的种类最多且含量最高。结论 适量的氯化钾和乙醇替代氯化钠进行高盐稀态发酵可以获得高品质的低盐酱油,从安全性角度则是适量氯化钾优于乙醇,本研究为低盐酱油的酿造提供了一定理论基础。     

高盐稀态酱油发酵S3—2酵母基础发酵性能的研究

鲁氏酵母（S酵母）的耐盐能力抑制了其对高盐稀态酱油风味的改善作用。S3-2酵母是本试验室以S酵母为出发菌株,利用基因组重组技术构建的一株具有高耐盐度的酵母菌株。在YPD发酵培养基中对S3-2酵母进行基础发酵性能研究的结果表明,S3-2比S酵母具有更高的耐盐能力,S酵母能生长的最大盐度为19％,而S3-2酵母在含盐量高达21％的培养基中仍能够良好生长。在含盐量为18％的YPD发酵培养基中,S3-2酵母在提高醇类物质的种类和含量,对提高高盐稀态酱油风味具有重要的意义。     

外源相容性溶质对S酵母耐盐性及酱油风味形成的研究

研究外源相容性溶质对S酵母(Zygosaccharomyces rouxii)耐盐性的影响,并探讨在高盐稀态酿造工艺中添加海藻糖对酱油风味的影响.结果表明,在酵母培养基中添加0.005mol/L海藻糖、甜菜碱和山梨醇,均可以显著改善S酵母在高盐培养基中的生长情况,缩短渗透胁迫条件下S酵母的延滞期,增加生物量,其中海藻糖的渗透保护效果最佳;添加海藻糖可使酱油的主体香味物质HEMF(4-羟基-2-乙基-5-甲基-3-呋喃酮)和乙酸乙酯的含量显著增加,同时促进S酵母合成酱油中典型风味物质4-EG (4-乙基愈创木酚).在酱油高盐稀态酿造中添加相容性溶质,如海藻糖,可有效改善酱油的风味和品质.     

产2-苯乙醇酵母的鉴定及其在酱油发酵中的应用

研究酱油中特征香气成分2-苯乙醇的合成途径并探索提高酱油发酵醪中2-苯乙醇含量,从酱油发酵醪分离得到1 株产2-苯乙醇酵母菌株922-1。通过形态观察、生理生化测试、转录间隔区序列测序和系统进化树分析鉴定922-1为Candida oceani,C. oceani 922-1可以在高含盐（18% NaCl）培养基中生长;采用唯一氮源实验证明了C. oceani 922-1主要通过艾氏途径,利用苯丙氨酸作为底物合成苯丙氨酸。C. oceani 922-1可以在酱油发酵醪中大量合成2-苯乙醇（44.70 mg/L）,添加1%苯丙氨酸可以将酱油发酵醪中2-苯乙醇质量浓度进一步提高到对照组的17.3 倍,并能一定程度改善发酵生酱油醇香和厚味,显示出C. oceani 922-1在高盐发酵调味品风味改善方面的应用前景。     

气相色谱-嗅闻/质谱联用分析酵母菌发酵酱油中香气物质

酱油香气物质的形成与酵母菌的代谢息息相关,本文旨在研究酵母菌对发酵酱油中香气物质形成与含量的影响。采用固相微萃取(SPME)结合气相色谱-嗅闻-质谱(GC-O/MS)联用技术分别对不加酵母菌、加AY酵母菌以及加入T酵母菌发酵制得酱油中的香气物质进行检测分析。结果显示:加入酵母菌的酱油中形成的各类香气物质更加丰富,其中AY型鲁氏酵母菌能够产生更多种类的酯类(11种)及醇类(12种)物质;T型鲁氏酵母菌有助于醛类(7种)物质的形成。且AY型鲁氏酵母菌在酱油酿造过程中产生的酯类(155.19 μg/L)、呋喃酮类(68.53 μg/L)、醛类(86.46 μg/L)等物质的含量更高,T型鲁氏酵母菌的产醇类(1260.64 μg/L)物质能力则更加优越。通过对酱油样品中OAV的计算,发现,AY酵母菌酿造酱油中的4-羟基-2-甲基-5-乙基-3(2H)-呋喃酮(HEMF),2/3-甲基丁醛、及苯乙醛的OAV高于其他样品的OAV值,T型鲁氏酵母菌的1-辛烯-3-醇及3-甲硫基丙醛的OAV值高于其他样品的OAV值。将OAV值与PCA结合分析,可以看出,AY型鲁氏酵母菌发酵酱油的香气优势明显,并且T型鲁氏酵母菌发酵酱油以熟土豆气味为主,并伴有蘑菇香气;AY型鲁氏酵母菌发酵酱油以甜香香气为主,并伴有麦芽香气。综上,AY型鲁氏酵母菌的整体产香优于T型鲁氏酵母菌的产香效果。     

一株产2-苯乙醇酵母的鉴定及其在酱油酿造中的应用

2-苯乙醇是酱油的特征香气成分,为研究其合成代谢途径并提高其在酱油发酵醪中的含量,从酱油发酵醪分离筛选到1株产2-苯乙醇酵母菌株30-2;通过形态观察、生理生化试验、转录间隔区（ITS）序列测序和系统进化树分析鉴定菌株30-2为接合酵母（Zygosaccharomyces sp.）;菌株30-2可以在高含盐（18% NaCl）培养基中生长,采用唯一氮源实验证明了菌株30-2主要通过艾氏途径,以苯丙氨酸为底物合成2-苯乙醇。菌株30-2添加至酱油发酵醪可一定程度降低发酵液还原糖含量,2-苯乙醇合成量达到40.95 mg/L,并可以抑制发酵醪产酸,对酱油其他理化指标影响不显著（P＞0.05）;外加苯丙氨酸后2-苯乙醇含量进一步提高到对照组的14.7倍;显示出菌株30-2在高盐发酵调味品风味改善方面的应用前景。     

改善低盐固态酱油风味的研究

重点采用淋浇工艺添加耐盐酵母,研究其对低盐固态酱油风味的影响,探讨了耐盐酵母在酱汁中的生长情况及其对酱汁风味的影响、传统和淋浇工艺酱醅中风味物质的动态变化进行对比分析.结果表明,T酵母更适合在酱汁中生长;选择淋浇工艺适时添加T酵母的酱醅中乙醇含量提高T77.9%,异丁醇提高了98.7%,HEMF提高了2.3倍,酒石酸、柠檬酸和琥珀酸总含量提高了31.1%.因此,淋浇工艺合理添加耐盐酵母可显著提高低盐固态酱油的风味.     

固定化酵母细胞增加酱油香气的研究

在酱油生产中添加酵母可以有效的增加酱油的香气,实验选择不同种的酵母细胞,将其固定化后应用于酱油酿造过程中,应用单标法以2-乙基-4-羟基-5甲基-3(2H)呋喃酮(HEMF)为标准品进行气相色谱检测,结果表明固定化的莫格球拟酵母在酿造过程中产生对酱油香气有较大影响的HEMF.     

酵母抽提物协助酱油减盐后对其风味物质的影响研究

该研究通过使用酱香型酵母抽提物（YE）协助酱油减盐,并对减盐前后酱油风味物质的变化进行分析。结果表明,通过减少原油用量直接减盐20%和30%后,酱油的关键理化指标以及游离氨基酸、小分子肽和挥发性芳香成分等风味物质含量均相应损失20%和30%,酱油味也被明显稀释。而酱香型YE协助减盐20%和30%后酱油的游离氨基酸、小分子肽和挥发性芳香成分总量分别可达到减盐前的99.98%～100.78%、98.40%～99.03%和95.66%～97.13%,且酱油味得以恢复,从而实现了酱油的减盐不减味。     

Sensory lexicon and relationships among brown colour,saltiness perception and sensory liking evaluated by regular users and culinary chefs: a case of soy sauces

This study was performed to develop lexicon to describe soy sauces using regular users (consumers) vs. culinary chefs, to perform product grouping using a free-sorting task and to determine relationship among physicochemical properties (colour, %NaCl) and consumer perception of soy sauces. Both panels identified eighteen terms to describe soy sauces, of which eleven terms (light, medium and dark brown colour, weak, medium and strong saltiness, sweetness, saltiness–sweetness, tasty/umami, and soy sauce and fermented aroma) were similar. For culinary chefs, three distinctive soy sauce groups based on brown colour (light, medium and dark brown) were identified, while two groups (light and medium dark brown) for regular users. From free-sorting maps, both panels associated brown colour intensity with saltiness expectation/perception. From PCA biplots, both panels shared some similarities for sensory liking (colour, saltiness, flavour, overall liking) for soy sauces. This study suggested that brown colour intensities affected saltiness expectation/perception and were used for product grouping for soy sauces.     

高盐稀态发酵酱油工艺

对高盐稀发酵工艺各工序简要介绍，重点讨论低温制曲，酱醪发酵过程中各微生物生命活动对酱油品质和风味的影响。     

老抽酱油储存期间关键气味物质分析及其风味特征的变化

为阐明老抽酱油在不同储存期的关键气味化合物及其风味特征的变化,采用液液萃取与气相色谱-嗅闻-质谱(GC-O-MS)相结合提取并鉴定不同储存期老抽酱油中的挥发性气味化合物,并利用香味提取物稀释分析(AEDA)鉴定关键气味化合物。结果表明:在老抽酱油样品中共检测到56种气味活性物质,其中FD因子>1024的化合物分别为2-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、5-甲基-2(3H)-呋喃酮、2-乙酰基呋喃、2-乙酰基-5-甲基呋喃、1,4-丁内酯、5-甲基-2-呋喃甲醇、2-羟基-3-甲基-2-环戊烯酮、愈创木酚、麦芽酚和4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮 (HDMF),其中,2,6-二甲基吡嗪、5-甲基-2(3H)-呋喃酮、2-羟基-3-甲基-2-环戊烯酮、麦芽酚和HDMF的香气活性值>1,对老抽酱油整体香气起主要贡献作用。感官评价结果表明,老抽酱油随着储存时间的延长,烤香味和烟熏味的气味强度得分升高。该研究分析了老抽酱油的关键气味化合物以及在储存过程中气味特征变化,为老抽酱油相关风味研究提供了理论参考。     

一株戊糖片球菌在低盐固态酱油工艺中的应用

酱油发酵酱醅中筛选到一株戊糖片球菌,对该菌的生长温度、生长pH值、食盐耐受度等生长特性进行研究。采用离子交换色谱法对该菌株产有机酸的情况进行测定;将该菌株添加到低盐固态酱油后酵过程中,以不添加乳酸菌的实验组作对照,对酱油样品理化指标、经济指标进行分析,并采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法(HS-SPME-GC-MS)对酱油挥发性香气成分进行对比分析。结果表明,该乳酸菌的生长条件与酱油酱醅发酵环境相适应,其发酵产酸以乳酸和乙酸为主,与酱油中有机酸主成分相一致,将该菌株用于低盐固态酱油发酵,对酱油香气和其他指标均有不同程度的促进作用。     

Reducing the Influence of the Thermally Induced Reactions on the Determination of Aroma-Active Compounds in Soy Sauce Using SDE and GC-MS/O

A method based on simultaneous distillation extraction (SDE) coupled with gas chromatography–mass spectrometry/olfactometry (GC-MS/O) was developed for the analysis of volatile profiles in soy sauce. Its optimum operating conditions were as follows: 100 mL soy sauce plus 100 mL saturated brine; 2 h extraction using 50 mL dichloromethane. Eighty-eight volatile compounds were identified. Of these, 26 aroma-active compounds were detected by GC-O including 3-(methylthio)propanal, 2-methoxy-4-vinylphenol, 2-methoxyphenol, 2-methylbutanoic acid, 2,3-butanedione, phenylacetaldehyde, 2-ethyl-6-methylpyrazine, 3-methylbutanal, 2-methylbutanal, 3-methyl-1-butanol, and 2-methyl-1-butanol (which occurred at a high odor intensity in both high-salt liquid-state fermentation soy sauce (HLFSS) and low-salt solid-state fermentation soy sauce (LSFSS). SDE analysis of the odorless soy sauce indicated 12 volatiles (mainly Strecker aldehydes and α-dicarbonyl compounds). Thus, the proportions of these compounds (1.94–54.07 %) shown in previous GC-MS results could result from thermal degradation of non-volatile compounds in soy sauce. Especially, the contribution of 3-methylbutanal, 2-methylbutanal, phenylacetaldehyde, 3-(methylthio)propanal, and 2,3-butanedione to the aroma of soy sauce could be overestimated by conventional SDE-GC-O. With a full consideration of such limitations, this study will improve the application of SDE on aroma analysis of complex food matrix.     

菌种耦合发酵米渣生酱油的品质和抗氧化活性

以高盐稀态法酿造米渣生酱油,探究菌种耦合对其品质和抗氧化活性的影响。4组不同菌种耦合发酵的米渣生酱油品质测定结果表明其各项质量指标均达到GB 18186—2000《酿造酱油》中一级酱油的标准,其中S4生酱油(米曲霉耦合黑曲霉和鲁氏酵母发酵)游离氨基酸总量达到41.81 g/L,4种米渣生酱油的总氨基酸、必需氨基酸、呈味氨基酸和抗氧化氨基酸的质量浓度均高于同时发酵的大豆生酱油S5生酱油(米曲霉发酵)。S3生酱油(米曲霉耦合鲁氏酵母发酵)和S4生酱油的抗氧化活性普遍高于S1生酱油(米曲霉发酵)和S2生酱油(米曲霉耦合黑曲霉发酵),各结果均表明S3的抗氧化活性最强,清除羟自由基的能力达到等质量浓度VC的最高175.42倍,对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力达到VC的2.16倍。抗氧化活性受发酵温度影响明显,分别在35℃和50℃发酵时出现峰值。多菌种耦合发酵对米渣生酱油品质和抗氧化活性均有明显改善,其中鲁氏酵母发挥了明显作用。     

酱香型白酒液液微萃取-毛细管色谱骨架成分与香气重组

应用液液微萃取（LLME）、气相-质谱联用仪（GC-MS）研究酱香型白酒骨架成分。液液微萃取定量48种香气物质,确定29种骨架成分。通过52种物质香气重组,得到的模拟酒香气较为丰满,且富有层次感,呈现酱香型白酒的背景香,但未出现典型酱香。缺失实验表明酱香型白酒骨架成分中香气贡献较大的主要是酯类和醇类物质,其中：己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、1-丙醇、2-苯乙醇以及3-甲基丁醇是重要的香气物质;缺失与添加实验验证了三甲基吡嗪、糠醛、4-乙基愈创木酚和呋喃扭尔（furaneol）与酱香型白酒的典型酱香无关。     

高耐性酿酒酵母的筛选及其耐受性研究

优良的耐逆性菌株的添加能有效提高酱油生产效率和产品品质风味,该研究筛选出两株耐高温、耐高渗和耐高酸的酵母菌株用于酱油发酵。通过对酵母菌株高温热激之后稀释点板,对比各稀释度的菌落数量和形态,以及通过在高渗板和高酸板上各个菌的生长情况和在抗性培养基中菌的生长曲线测定来对比各菌株的耐受性。稀释点板实验以及生长曲线结果都显示,酿酒酵母L-19和L-38在55 ℃热激条件下以及在分别含有6%NaCl、0.6%乙酸和5%乳酸固体平板上菌落形态和大小都优于酱油酵母,而且在含有高盐和高酸的液体培养基中生长速率均高于酱油酵母。因此,成功筛选出两株具有高耐性的酿酒酵母。     

酶法制备大豆多肽及在酱油发酵中的应用

以脱脂大豆粕为原料,采用复合酶解技术制取大豆多肽酶解液,将制备的大豆多肽应用于酱油发酵前期,并从酱油理化指标、感官评价及香气分析三方面归纳其对酱油主要品质的影响。结果表明,先加中性蛋白酶（温度55 ℃,pH值为6.5,酶用量为4 500 U/g蛋白,酶解3 h）后,再加入碱性蛋白酶（温度55 ℃,pH值为9.0,酶用量为3 000 U/g蛋白,酶解1 h）。此时水解度达22%,多肽得率达10.84%。添加大豆多肽的酿造酱油色泽棕红亮,醇香、酱香浓郁,整体滋味均优于普通酿造酱油。气质联用（GC-MS）鉴定出酱油中含挥发性风味化合物40种,其中主要香气化合物为醇类69.41%、酸类23.06%、醛酮类4.45%、杂环酯类2.47%等,大豆多肽提高了酿造酱油的综合品质,滋味和香气明显优于传统发酵酱油,可用于开发功能营养型酱油。     

产4-乙基愈创木酚酵母的鉴定及其在酱油中的应用

从酱油发酵醪中分离得到1 株产4-乙基愈创木酚的酵母菌株A10-2。通过形态观察、生理生化测试、18S ITS rDNA测序和同源序列检索分析鉴定A10-2为Wickerhamiella versatilis,其能够耐受18% NaCl,可以在酱油发酵液中正常生长,并代谢合成4-乙基愈创木酚。W. versatilis A10-2以阿魏酸为前体,在阿魏酸脱羧酶的作用下脱去羧基得到中间产物4-乙烯基愈创木酚,进一步通过4-乙烯基愈创木酚还原酶催化得到4-乙基愈创木酚。W. versatilis A10-2可以利用酱油本底前体物质代谢合成一定质量浓度的4-乙基愈创木酚（0.63 mg/mL）,添加50 mg/L阿魏酸可以将酱油发酵液中4-乙基愈创木酚质量浓度提高到对照组的19.1 倍。将通过4-乙基愈创木酚强化的酱油发酵液添加到成品酱油中,可以一定程度改善酱油醇香、酱香,并缓和咸味,显示出W. versatilis A10-2在改善酱油、酱料等发酵调味品风味方面的应用前景。