骨桥蛋白反义基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞黏附能力的影响

目的探讨骨桥蛋白反义基因(ANOPN)对人乳腺癌MDA-MB-231细胞黏附能力的影响。方法构建人骨桥蛋白反义基因真核表达质粒pcDNA3.1-ANOPN,将质粒pcDNA3.1-ANOPN、空载体pcDNA3.1(+)和脂质体分别转染MDA-MB-231细胞,将转染细胞分别命名为MDA-ANOPN、MDA-vect和MDA。RT-PCR法检测转染细胞OPN基因mRNA的转录水平,MTT法检测转染细胞的黏附能力。结果重组质粒pcDNA3.1-ANOPN经双酶切、PCR及测序鉴定,证明构建正确。MDA-ANOPN细胞中OPN基因mRNA的转录水平较MDA-vect和MDA细胞明显下降,细胞的黏附能力也明显降低。结论ANOPN可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的黏附。     

重组质粒pcDNA3.1-Her2-hsp70的构建及其表达

目的构建重组表达质粒pcDNA3.1-Her2-hsp70,并筛选稳定表达Her2蛋白的细胞株。方法采用RT-PCR法扩增人乳腺癌SKBR-3细胞中Her2和hsp70基因,插入质粒pcDNA3.1中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-Her2、pcDNA3.1-hsp70,经双酶切后,回收hsp70基因,连接入质粒pcDNA3.1-Her2的N-末端,构建重组表达质粒pcDNA3.1-Her2-hsp70。将质粒pcDNA3.1和pcDNA3.1-Her2-hsp70分别转染小鼠乳腺癌4T-1细胞,采用Western blot法检测Her2蛋白的表达。结果重组表达质粒pcDNA3.1-Her2、pcDNA3.1-hsp70及pcDNA3.1-Her2-hsp70经双酶切鉴定,证明构建;转染质粒pcDNA3.1-Her2-hsp70的4T-1细胞中可见相对分子质量约65 000的Her2蛋白的表达。结论已成功构建了重组质粒pcDNA3.1-Her2、pcDNA3.1-hsp70及pcDNA3.1-Her2-hsp70,并获得了稳定表达Her2蛋白的小鼠乳腺癌4T-1细胞,为进一步探讨佐剂辅助异种抗原产生的抗肿瘤免疫效应奠定了基础。     

P4HB基因真核表达质粒的构建及在人肺腺癌A549细胞中的表达

目的构建人P4HB基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的表达。方法采用RT-PCR法从正常人肝细胞HL7702中扩增P4HB基因片段,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB,在脂质体LipofectamineTM 2000介导下转染A549细胞,通过G418加压筛选,建立稳定转染细胞系,通过qPCR和Western blot法检测转染细胞中P4HB基因mRNA的水平及蛋白的表达水平。结果重组真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB经双酶切(BamHⅠ/EcoRⅠ)和测序证实构建正确;质粒pcDNA3.1-P4HB转染的A549细胞中P4HB基因mRNA的水平为空载体转染的细胞和未转染细胞的102倍;质粒pcDNA3.1-P4HB转染的A549细胞中P4HB蛋白的表达量(1.71)较未转染的A549细胞(1.11)明显升高。结论成功构建了P4HB基因真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB,转染A549细胞后,P4HB基因在mRNA水平和蛋白水平均出现了较强的表达,表明P4HB基因已稳定转染入A549细胞中。本实验为进一步研究P4HB对人肺癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响奠定了基础。     

Kozak序列对TIMP1基因在人乳腺癌细胞MCF-7中表达的影响

目的探讨Kozak序列对基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)基因在人乳腺癌细胞MCF-7中表达的影响。方法构建pcDNA3.1-TIMP1和pcDNA3.1-TIMP1-K(含有Kozak序列)重组真核表达质粒,用FugeneHD转染试剂将重组表达质粒转染MCF-7细胞,采用荧光定量PCR和Western blot检测pcDNA3.1-TIMP1和pcDNA3.1-TIMP1-K在MCF-7细胞中表达的差异。结果重组真核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确。质粒pcDNA3.1-TIMP1-K转染细胞比空白对照细胞TIMP1基因mRNA表达量高约0.95倍,蛋白表达量高0.43倍;而质粒pcDNA3.1-TIMP1转染细胞比空白对照细胞mRNA表达量高0.37倍,蛋白表达量高0.25倍。结论质粒pcDNA3.1-TIMP1-K与pcDNA3.1-TIMP1在MCF-7细胞中mRNA和蛋白表达水平均存在差异,Kozak序列提高了TIMP1基因的表达。     

血管内皮生长因子反义基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞的生长抑制作用

目的构建反义血管内皮生长因子(VEGF165)基因真核表达载体,分析该基因对乳腺癌细胞的生长抑制作用。方法将人VEGF165cDNA反向克隆至pcDNA3真核表达载体中,构建VEGF165反义基因的真核表达载体,转染人乳腺癌细胞MCF-7,观察转染前后MCF-7细胞的VEGF165表达及细胞生长周期。结果所构建的VEGF165反义基因真核表达载体转染MCF-7细胞后,VEGF165表达下降,细胞生存率下降,G1期细胞数量增加,S期细胞数量减少,细胞增殖能力降低。结论成功构建了VEGF165反义基因表达载体,该基因对乳腺癌细胞的生长具有明显的抑制作用。     

人叉头转录因子O亚型3基因重组表达质粒的构建及鉴定

目的构建人叉头转录因子O亚型3(forkhead box class O3,FOXO3)基因重组表达质粒,并检测其在人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的表达。方法利用3对引物从人cDNA中分别扩增大小为382、829和891 bp的3个目的片段,胶回收后进行拼接,获得hFOXO3的CDS片段,与pcDNA3.1(+)载体连接,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-hFOXO3,转染人PBMC,采用Real-time PCR和Western blot分别检测hFOXO3基因mRNA水平及蛋白表达水平。结果重组表达质粒经双酶切及测序证实构建正确;转染PBMC后,pcDNA3.1(+)-hFOXO3组hFOXO3基因mRNA的水平分别为转染试剂对照组和pcDNA3.1(+)组的2 599.7和2 377.8倍,且差异均有统计学意义(P0.001);pcDNA3.1(+)-hFOXO3组hFOXO3蛋白的表达水平分别为转染试剂对照组和pcDNA3.1(+)组的2和1.8倍,且差异均有统计学意义(P0.01);而转染试剂对照组和pcDNA3.1(+)组间hFOXO3基因mRNA水平和蛋白的表达水平差异均无统计学意义(P0.05)。结论成功构建了pcDNA3.1(+)-hFOXO3重组表达质粒,其在人PBMC中能进行hFOXO3基因mRNA的转录及蛋白的表达,为进一步研究hFOXO3的生物学功能及其作用机制奠定了基础。     

人骨形态发生蛋白-7在人骨肉瘤细胞U2-OS中的表达

目的探讨人骨肉瘤细胞U2-OS表达重组人骨形态发生蛋白-7(recombinant human bone morphogenetic protein-7,rhBMP-7)的可行性。方法将hBMP-7成熟肽基因片段克隆至载体pcDNA3.1上,构建真核表达质粒pcDNA3.1-rhBMP-7。利用Lipofectamine 2000将重组质粒转染至U2-OS细胞中,采用实时荧光定量PCR及Western blot法检测细胞中hBMP-7基因mRNA和rhBMP-7的表达。结果真核组表达质粒pcDNA3.1-rhBMP-7经NdeⅠ和EcoRⅤ双酶切及测序鉴定证明构建正确。pcDNA3.1-rhBMP-7质粒转染的U2-OS细胞中hBMP-7基因mRNA和rhBMP-7的表达水平均明显高于pcDNA3.1载体转染的细胞(P0.05)。结论成功构建了hBMP-7基因的重组表达质粒,并在U2-OS细胞中成功表达,为进一步研究hBMP-7的制备方法和建立新的表达系统奠定了基础。     

Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

目的观察凋亡抑制蛋白Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响。方法将Survivin基因shRNA干扰质粒和过表达质粒pcDNA3.1-GFP-Survivin在脂质体介导下转染MCF-7细胞,并设空白对照组和脂质体对照组,转染后48 h,荧光显微镜下观察转染效率;荧光定量RT-PCR法检测转染细胞中Survivin基因mRNA的转录水平;MTT法检测转染细胞的凋亡率。结果转染MCF-7细胞后48 h,Survivin基因RNAi质粒和过表达质粒的转染效率为50%～60%;shRNA质粒转染组MCF-7细胞中Survivin基因mRNA的转录水平明显低于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显高于空白对照组和脂质体对照组(P<0.05);shRNA质粒转染组MCF-7细胞的凋亡率明显高于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显低于空白对照组和脂质体对照组(P<0.05)。结论 Survivin基因对人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡具有一定的抑制作用,可作为人乳腺癌生物治疗的候选基因。     

成纤维细胞生长因子受体基因野生型和E731K突变型真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)基因野生型和E731K突变型的真核表达载体,并进行鉴定。方法利用基因定点突变试剂盒,定点突变FGFR2基因,获得其E731K突变的突变型基因,通过设计含有XbaⅠ、XhoⅠ限制性内切酶识别序列的引物分别扩增FGFR2基因野生型和E731K突变型的cDNA,克隆至质粒pcDNA3.1-EGFP上,构建重组表达质粒pcDNA3.1-FGFR2-EGFP和pcDNA3.1-FGFR2E731K-EGFP,利用X-tremeGENE HP DNA将质粒转染至HEK293细胞,采用实时荧光定量PCR法及Western blot法检测FGFR2表达水平。结果经定点突变已获得野生型的突变型FGFR2基因,碱基序列与设计序列完全一致,cDNA第2191位碱基G突变为A。重组表达质粒pcDNA3.1-FGFR2-EGFP和pcDNA3.1-FGFR2E731K-EGFP经双酶切及测序鉴定证明构建正确。质粒转染HEK293细胞后,荧光显微镜下均可见绿色荧光蛋白表达;质粒pcDNA3.1-FGFR2-EGFP和pcDNA3.1-FGFR2E731K-EGFP转染组中FGFR2 mNRA和蛋白表达水平均明显高于质粒pcDNA3.1-EGFP转染组和空白对照组(P0.05)。结论成功构建了FGFR2基因野生型和E731K突变型的真核表达质粒,并在HEK293细胞中成功表达,为进一步研究FGFR2基因奠定了基础。     

锌指抗病毒蛋白基因真核表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的构建锌指抗病毒蛋白(zinc finger antiviral protein,ZAP)基因真核表达质粒,并在人肝癌细胞系HepG2细胞中表达。方法化学合成含第4个CCCH锌指基序的ZAP基因片段,经PCR扩增后,插入pcDNA3.1(+)载体,并在ZAP下游插入报告基因EGFP,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-ZAP/EGFP。在脂质体Genfectin介导下将重组表达质粒转染HepG2细胞,转染后24 h,荧光显微镜观察EGFP的表达;转染后48 h,RT-PCR法检测转染细胞中ZAP基因和内参GAPDH基因mRNA的转录。结果重组表达质粒pcDNA3.1(+)-ZAP/EGFP经双酶切和测序证实构建正确;转染后24 h,pcDNA3.1(+)-ZAP/EGFP质粒转染的HepG2细胞在荧光显微镜蓝色激发光下可见胞质内有较强的黄绿色荧光;转染后48 h,pcDNA3.1(+)-ZAP/EGFP质粒转染的HepG2细胞可扩增出288 bp的ZAP基因条带和100 bp的内参GAPDH基因条带。结论成功构建了含第4个CCCH锌指基序的ZAP基因真核表达质粒,并在HepG2细胞中获得表达,为下一步深入研究ZAP对肝炎病毒是否具有抗病毒作用以及利用ZAP作为抗病毒治疗的一种新手段奠定了基础。     

CXCR4在乳腺癌中的表达及乌斯他丁对其表达的影响

目的探讨趋化因子受体CXCR4在乳腺癌中的表达及其与肿瘤转移的相关性,以及乌斯他丁(UTI)对其表达的影响。方法采用流式细胞术和RT-PCR法检测22例乳腺癌患者的癌组织、癌旁组织、正常组织以及乳腺癌细胞MDA-MB-231中CXCR4在蛋白和mRNA水平的表达情况,以及UTI对MDA-MB-231细胞CXCR4表达的影响。结果在乳腺癌组织和MDA-MB-231细胞中,CXCR4在蛋白和mRNA水平的表达均显著高于癌旁组织和正常组织,且CXCR4的表达与乳腺癌的转移密切相关;UTI能下调CXCR4的表达,经UTI作用后,MDA-MB-231细胞的趋化活性降低。结论CXCR4在乳腺癌中高表达,在乳腺癌的转移中起重要作用,下调乳腺癌细胞CXCR4的表达水平可减少或抑制其转移。     

丙型肝炎病毒多表位基因核酸疫苗的构建及其免疫原性

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-CtEm,用该重组质粒免疫BALB/c小鼠,并检测其免疫原性。方法用BamHⅠ和HindⅢ双酶切含有HCVC区、E2区模拟表位和NS3~NS5区细胞表位串联基因的原核表达载体pQE30-CtEm,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),脂质体瞬时转染CHO细胞,并检测其表达。以100μg重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测其体液免疫和细胞免疫效果。结果所构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)-CtEm在CHO细胞中能获得有效表达。该质粒免疫小鼠后可诱导高水平的抗体,特异性淋巴细胞增殖反应、IFN-γ水平及CTL活性均明显高于空载体和生理盐水对照组。结论已成功构建HCV多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-CtEm,免疫小鼠后可诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答。     

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Vasostatin的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Vasostatin并检测其在真核细胞内的表达水平。方法将带有信号肽的Vasostatin基因片段克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析证明构建成功后,以脂质体介导法转染293T细胞,通过Westernblot法,检测其在293T细胞内的表达水平。结果所构建的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Va-sostatin转染293T细胞后,在其裂解的上清液中,检测到目的基因的表达。结论已成功构建了pcDNA3.1(+)-Vasostatin表达载体,并在真核细胞中表达了目的蛋白。     

[VEGF]hTERT复合调控序列介导HSV-tk自杀基因诱导肿瘤细胞的凋亡

目的构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)核心启动子及血管内皮生长因子(VEGF)增强子复合调控序列的真核表达载体,并检测在复合调控序列调控下HSV-tk自杀基因对肺癌细胞A549和肝癌细胞SMMC-7721凋亡的影响。方法构建复合调控序列[VEGF]hTERT和胸苷激酶(tk)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-[VEGF]hTERT-tk和PCMV启动子的真核对照表达载体pcDNA3.1(+)-tk,转染肺癌细胞A549和肝癌细胞SMMC-7721,G418筛选抗性克隆,给入前药丙氧鸟苷(GCV),MTT比色法测定细胞生长抑制率,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率。结果质粒pcDNA3.1(+)-[VEGF]hTERT-tk和pcDNA3.1(+)-tk经双酶切及PCR鉴定,证明构建正确。转染了带有不同启动子的真核表达载体的肿瘤细胞,在给入前药GCV后均能表现出对细胞生长的抑制作用,GCV对A549细胞的抑制率大于SMMC-7721细胞,并能引起肿瘤细胞凋亡。[VEGF]hTERT在A549细胞中的活性较在SMMC-7721中高。结论HSV-tk自杀基因在肿瘤细胞内瞬时表达即能引起靶细胞凋亡,且复合调控序列在肿瘤细胞中的活性较通用真核细胞转录启动子PCMV高,为深入进行自杀基因治疗的研究提供了一定理论依据。     

FABP7基因真核表达载体的构建及其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的构建脑脂肪酸结合蛋白(BLBP/B-FABP,FABP7)基因的真核表达载体,并检测其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。方法采用逆转录方法从星型细胞瘤组织中扩增FABP7基因,双酶切后插入线性化的pcDNA3.1载体真核启动子下游,构建重组真核表达载体,转染人乳腺癌细胞MCF-7后,采用半定量RT-PCR检测FABP7基因mRNA的表达,MTT法检测细胞的增殖活性、流式细胞术检测细胞的周期变化情况,并对细胞进行计数。结果FABP7基因重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确,转染MCF-7细胞后48、72和96h,pcDNA3.1-FABP7组的细胞数和细胞的A490值均比pcDNA3.1空质粒组明显降低,G1期细胞百分含量均明显升高。结论已成功构建了FABP7基因的真核表达载体,该载体可抑制人乳腺癌细胞MCF-7的增殖。     

肺癌抑癌基因1对鼻咽癌细胞株HNE-1增殖与侵袭能力的影响

目的探讨肺癌抑癌基因1(Tumor suppressor in lung cancer 1,TSLC1)对鼻咽癌细胞株HNE-1增殖与侵袭能力的影响。方法采用RT-PCR法从乳腺癌细胞株MCF-7中扩增TSLC1基因全长编码区序列,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-TSLC1,转染HNE-1细胞,RT-PCR及Western blot检测TSLC1基因mRNA和蛋白的表达水平。MTT和Transwell小室试验检测TSLC1基因过表达对HNE-1细胞增殖及侵袭能力的影响。结果重组表达质粒pcDNA3.1-TSLC1经双酶切及测序证明构建正确;稳定转染重组表达质粒的HNE-1细胞中TSLC1基因出现过表达;TSLC1基因过表达可显著抑制HNE-1细胞的增殖与侵袭能力。结论 TSLC1基因过表达对HNE-1细胞增殖与侵袭能力具有明显的抑制作用,为鼻咽癌的基因治疗提供了理想的分子靶点。     

微小隐孢子虫CP15/60基因在Hela细胞中的表达

目的 构建隐孢子虫CP15/60真核表达载体pcDNA3.1-15/60,观察其在Hela细胞中的表达。方法用Xho I和EcoR　I从pMD18-T-15/60中酶切得到CP 15/60基因,将其插入真核表达载体pCR3.1（+）的 XhoI和EcoRI位点,构建CP15/60真核表达载体pcDNA3.1-15/60,用脂质体介导法将其转染Hela细胞,并用G418加压筛选,用RT-PCR方法检测外源CP15/60基因的转录,ELISA法和间接免疫荧光法检测其活性。结果 酶切鉴定表明已成功构建了重组真核表达载体pcDNA3.1-15/60,外源CP15/60基因能在转染细胞中有效转录,经检测表达产物具有良好的生物活性。结论 已成功地构建了pcDNA3.1-15/60真核表达载体,并在Hela细胞中具有良好的表达。     

狂犬病病毒糖蛋白真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建狂犬病病毒糖蛋白基因的真核细胞表达载体,并在COS-7细胞中表达。方法培养狂犬病病毒,提取负链RNA,采用RT-PCR的方法扩增糖蛋白基因,并将该基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(A)上,通过脂质体介导的方法,转染COS-7细胞,用ELISA及间接免疫荧光法检测狂犬病病毒糖蛋白在COS-7细胞中的瞬时表达。结果成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(A)/G,转染COS-7细胞后,在其培养上清中未检测到狂犬病病毒糖蛋白的表达。间接免疫荧光试验表明,pcDNA3.1(A)/G能有效地表达狂犬病病毒糖蛋白于转染的COS-7细胞膜上。结论真核细胞表达载体pcDNA3.1(A)/G能够在COS-7细胞中表达狂犬病病毒糖蛋白,为开发狂犬病病毒糖蛋白基因工程疫苗奠定了基础。