新分离5株狂犬病病毒街毒株N和G基因的序列分析

目的分析我国新分离的5株狂犬病病毒(RV)街毒株基因序列及分子流行病学状况。方法采用RT-PCR法从疑似狂犬的犬脑组织内获得N和G基因cDNA的全序列并进行测序,将所得结果与已发表的国内外代表性毒株相应基因进行核苷酸和推导氨基酸序列比较。结果5株均含有完整N基因序列,3株含有完整G基因序列。与国内外发表的部分毒株比较,5株街毒N基因的核苷酸同源性在98.1%～99.9%之间,推导氨基酸同源性在99.5%～100%之间。将5株街毒与人用疫苗株3aG、PV株的N基因进行比较,核苷酸同源性在86.2%～86.7%之间,氨基酸同源性在95.1%～95.5%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在89.4%～89.6%之间,氨基酸同源性在98.2%～98.6%之间。3株街毒G基因的核苷酸同源性在98.5%～99.4%之间,推导氨基酸同源性在99.6%～100%之间。将3株街毒与人用疫苗株aG、PV和兽用疫苗株ERA的G基因进行比较,核苷酸同源性在82.8%～83.1%之间,氨基酸同源性在88.0%～90.1%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在86.7%～87.1%之间,氨基酸同源性均为92.0%。结论新分离街毒株基因未发生较大变异,与CTN的同源性高于与aG株和PV株。     

狂犬病病毒CVS-11株全基因序列测定及分析

目的对狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11株进行全基因序列测定,并就主要抗原位点与我国现用狂犬病疫苗生产毒株进行比较,评价CVS-11株作为抗狂犬病病毒中和抗体检测毒株的适用性。方法将CVS-11全基因组RNA分成8段进行RT-PCR扩增,分别将产物克隆入pGEM-TEasy载体中,测定全序列;用DNAStar软件包中的相应软件对基因全序列进行分析,并与5株生产用狂犬病病毒(CTN-1、aG、FluryLEP、PM和PV)进行基因比对分析和主要抗原位点比较。结果 CVS-11株基因组全长11927bp,其结构基因排列与已知其他狂犬病病毒相同,但G和M基因的非编码区偏长。CVS-11株与我国现用疫苗株的序列同源性在84.3%～99.5%之间。以相对保守的N基因作进化树分析,CVS-11株与PM株同源性最高,与CTN-1和aG株的亲缘关系较其他疫苗株远。各毒株G蛋白抗原位点存在一定的氨基酸差异。结论 CVS-11株与我国现用疫苗株具有较高的同源性;CVS-11株与不同疫苗株G蛋白抗原位点的差异可能对不同疫苗免疫效果评价产生不同程度的影响。     

浙江新分离狂犬病病毒街毒株与国内外疫苗株G基因的比较分析

目的对浙江新近分离的2株狂犬病病毒街毒株的G基因进行遗传学分析,并比较其与国内外使用的狂犬病疫苗株间的差异。方法以直接免疫荧光法和双抗体夹心ELISA法检测伤人犬脑组织,乳鼠接种分离病毒,RT-PCR扩增G基因片段,直接测序后进行遗传学分析。结果在2份伤人犬脑组织(编号LH和ZJCA1)中均检出狂犬病病毒,与其他浙江街毒株相比,G基因核苷酸和氨基酸序列同源性均为98.7%～99.2%。与当前国内外使用的多种疫苗株相比,与CTN疫苗株同源性最高,G基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.5%～86.1%和86.8%～94.1%。结论浙江新分离的2株狂犬病病毒街毒株属于基因1型,与当前使用的多种疫苗株相比,与CTN疫苗株属于同一分支,二者的亲缘关系最近。     

中国狂犬病毒疫苗株CTN-1-V三个代次的GP基因序列分析

目的分析三个代次CTN-1-V病毒株糖蛋白(GP)基因部分序列,并与代表性街毒株进行比较。方法利用RTPCR反应,从感染了CTN-1-V病毒的小鼠脑内获得GPcDNA的部分片段,并进行序列测定。结果三个代次的CTN-1-V病毒株GPcDNA序列的690个核苷酸与代表性狂犬病毒GP核苷酸相应序列同源性为83.2%～96.8%,氨基酸序列同源性为90.0%～97.4%。CTN1V株三代之间的核苷酸序列几乎相同。结论CTN1V株在传代过程中GP基因结构基本稳定,与中国流行的代表性街毒株的同源性高于aG株和PV株。     

我国流行的4株狂犬病街毒株G基因序列及分子流行病学研究

目的探讨我国流行的狂犬病毒(RV)基因差异,评价现有疫苗的适用性。方法通过RT-PCR并对其产物测序后获得4株RV街毒株的G基因序列以及G与M和L基因的区间序列。利用计算机分析软件比较4株RV与已经发表的毒株的核苷酸和推导的氨基酸序列。结果糖蛋白(GP)完整的编码基因序列长度为1575 bp。GP氨基酸序列同源性明显高于相应的核苷酸序列(除Mokola外),4株街毒与CTN的同源性高于aG株。GP不同区段比较显示,膜外区同源性高于膜内区。G-M区间核苷酸序列长度为5 bp;除广西4外,其余毒株100％同源。GL区间核苷酸序列长度为2,4 bp,越1与肥东同源性为100％。结论4株RV均属于基因I型。广西的毒株之间存在不同的来源。街毒与疫苗株之间基因存在差异。4株RV与SAD-B19进化途径相近,与PV株相差较远。越1与肥东株亲缘关系极近,可能是由同一毒株演化而来。     

狂犬病病毒4aG株G蛋白基因的克隆及其生物信息学分析

目的克隆狂犬病病毒(Rabies virus,RV)4aG株G蛋白基因,并与其他疫苗毒株G蛋白基因序列进行比较,为我国狂犬病疫苗的研制提供理论依据。方法从RV 4aG株中扩增G蛋白基因,并进行序列测定,利用生物信息学软件绘制系统进化树,预测G蛋白功能位点、二级结构和B细胞抗原表位,并与其他疫苗毒株进行比较。结果克隆的4aG株G蛋白基因序列与GenBank中登录的序列一致。进化树分析显示,4aG株与CVS株的进化关系较远;4aG、4aGV18、CVS、PV及RC-HL毒株跨膜区域在第460～479氨基酸之间,其他毒株在459～478氨基酸之间;PV株有5个糖基化位点,RV-97株有3个糖基化位点,其他毒株均有4个糖基化位点;G蛋白抗原表位位于氨基酸100～300及480～520之间;不同毒株G蛋白抗原位点区域有所不同,与CVS株比较,PV株抗原表位与其最为接近,4aG、4aGV18、CTN-1-31及Flury-HEP株与其抗原表位较为接近。结论4aG株G蛋白功能位点和抗原表位与CVS株相差较大,但其在Vero细胞上传代稳定,可用于制备Vero细胞纯化疫苗。     

狂犬病病毒aG株糖蛋白遗传稳定性及生物信息学分析

目的研究狂犬病病毒(rabies virus,RV)aG株糖蛋白(glycoprotein,GP)的遗传稳定性,并对GP基因组进行序列测定及生物信息学分析。方法采用RT-PCR法扩增6代次aG株RV(4aGV4、4aGV5、4aGV7、4aGV11、4a-GV15、4aGV18)G区基因,分别将产物克隆入pGEM-T载体中,测定序列并进行拼接;测定6代次aG株RV的滴度、荧光滴度和毒力;应用DNAStar和Mega4.0软件包中的相应软件对基因组序列进行分析,并与我国近期分离且具有地域代表性的RV街毒株进行基因同源性分析。结果 6代次aG株RV GP基因保持高度稳定,未出现核苷酸突变位点;6代次aG株RV的滴度有所不同,但其毒力指标基本一致;RV aG株与我国街毒流行株GP抗原区具有较高的同源性,且膜外区同源性远高于跨膜区及膜内区;aG株RV第147位关键位点氨基酸与街毒流行株该位点不同,其余各关键抗原位点在各毒株间均高度同源;6代次aG株RV关键毒力位点均未出现氨基酸突变,传代稳定,aG株RV与各街毒流行株关键毒力位点均高度同源;aG株病毒信号肽结构与我国多株流行株高度同源,而其GP则与法国巴斯德原株PV2061株及分离自美国的HEP-Flury株高度同源,与我国流行街毒株亦具有较高的同源性。结论 RV aG株GP遗传稳定,且与我国近期分离的街毒株高度同源,本研究为完善该毒株的质量控制及全面评价其在我国的适用性提供了实验依据。     

我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析

目的测定我国人用狂犬病疫苗株4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白G基因序列,并对其进行生物信息学分析。方法 RT-PCR扩增3株病毒糖蛋白G基因,分别克隆至pGEM-T载体中,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,进行测序。应用DNAstar MegAlign软件分析3株病毒糖蛋白的同源性,AntheProt 5.0及DNAstar Protean软件分析3株病毒糖蛋白的结构及潜在B细胞抗原表位的差异。结果 4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒均属基因Ⅰ型狂犬病病毒;其糖蛋白G区基因同源性为76.0%～88.4%,G区ORF基因同源性为84.4%～91.5%,氨基酸序列同源性为90.5%～92.2%;3株病毒糖蛋白前19位氨基酸中均存在潜在信号肽结构,其中第19位氨基酸为三者潜在信号肽断裂位点,第17位氨基酸为4aGV株病毒糖蛋白潜在信号肽断裂位点;3株病毒糖蛋白分别在第463～476、464～475及463～475位氨基酸存在潜在可折叠螺旋的疏水性区域,为明显跨膜区域;4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白氨基酸残基均富含潜在α螺旋、β折叠及卷曲结构,其比例分别为30%、31%、39%,28%、30%、41%和29%、30%、41%,易发生扭曲、折叠,形成丰富的二级结构;3株病毒糖蛋白潜在B细胞抗原表位位置与数量相似。结论已对3株人用狂犬病疫苗株G基因进行了全面生物信息学分析,为完善我国人用狂犬病疫苗生产用毒种的质控标准提供了支持。     

狂犬病病毒糖蛋白抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的建立可快速检测狂犬病病毒(rabies virus,RabV)糖蛋白抗原含量的双抗体夹心ELISA方法,并进行验证及初步应用。方法用抗RabV糖蛋白基因工程抗体建立双抗体夹心ELISA法,检测RabV糖蛋白抗原含量。对建立的方法进行特异性、线性、准确性、板内与板间精密性、灵敏度验证,对不同厂家(毒株分别为aG、PV、CTN、PM)生产的狂犬病疫苗与不同工艺阶段的狂犬病疫苗样品进行适用性检测。结果捕获抗体与酶标抗体最佳稀释度分别为1∶2 000和1∶4 000,最佳封闭剂为1. 5%BSA。该方法与其他人用疫苗和辅料成分无交叉反应;线性范围在0. 003 2~0. 103 1 IU/mL之间,R2> 0. 98;准确性验证的回收率在97. 0%~110. 1%之间;精密性验证的板内变异系数<8. 6%,板间变异系数<13. 9%;检测不同厂家的狂犬病疫苗和不同工艺阶段的疫苗样品呈良好的剂量依赖效应。结论建立了适用于人用狂犬病疫苗糖蛋白抗原含量检测的双抗体夹心ELISA方法,符合定量检测的需求,可用于aG、PV、CTN、PM等不同毒株生产的狂犬病疫苗检测;也可用于病毒收获液、浓缩液、灭活液及原液等不同工艺阶段样品检测。     

CTN株疫苗对中国狂犬病病毒街毒代表株的保护性

目的研究人用狂犬病病毒CTN株疫苗对中国狂犬病病毒街毒代表株的保护性,为评估该疫苗的适用性提供依据。方法用CTN株疫苗免疫昆明小鼠,用3株具有代表性的街毒株CQ92、HN06、J和标准攻击毒株CVS经脑内和肌肉攻击,以未免疫小鼠进行脑内和肌肉攻击为对照,观察CTN株疫苗的保护效果。结果原倍和5倍稀释的疫苗免疫的小鼠经3株街毒肌肉攻击后,均得到100%的保护,与对照组比较,差异均有极显著意义;经3株街毒脑内攻击后,原倍疫苗免疫的小鼠均得到100%的保护,5倍稀释的疫苗免疫的小鼠对3株街毒CQ92、HN06、J的保护率分别为85%、75%和77.8%,与对照组比较,差异均有极显著意义。结论CTN株疫苗总体上能有效预防我国目前狂犬病的流行。     

四价重组A群链球菌多肽疫苗基因序列的合成及克隆

目的设计针对可引起风湿热的A群链球菌M1、3、6、18四个血清型的重组多肽疫苗,合成并克隆该重组多肽疫苗的核苷酸序列。方法从美国疾病预防和控制中心(CDC)数据库获得A群链球菌1、3、6、18四个血清型M蛋白型特异性序列,根据文献报道并结合生物信息学的方法,筛选每一个血清型的特异性序列中与人体组织蛋白无同源性的区段,将其按1-3-6-18型的顺序串连,在串联序列的C-端加上一个四个血清型所共有的与人体组织蛋白无交叉表位、且具有一定免疫原性的保守序列J14。对设计的多肽疫苗的氨基酸序列进行与人体组织蛋白的BlastP比对、亲水性分析、二级结构分析、空间结构分析以及B细胞表位预测。采用DNAWORK2.0在线软件设计一组寡核苷酸引物,OverlapPCR方法合成该多肽疫苗的核苷酸序列,并在5′端和3′端分别引入BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点,将该序列双酶切后克隆至pUC18载体上,并测序。结果软件分析显示,设计的多肽疫苗与人体组织蛋白无同源性,有较好的亲水性,二级结构与空间结构均与天然M蛋白相似,在每一个血清型的区段都可能存在B细胞表位。成功扩增出了该多肽疫苗的DNA序列,并获得了一个与设计序列完全一致的重组克隆载体。结论已成功设计了一种四价重组A群链球菌多肽疫苗,为其重组表达和免疫原性的研究奠定了基础。     

赤子爱胜蚓蛋白磷酸酶2A类似激活剂样蛋白cDNA和氨基酸序列分析

目的分析赤子爱胜蚓蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)类似激活剂样蛋白的cDNA和氨基酸序列。方法从赤子爱胜蚓cDNA文库中随机测序得到目标cDNA序列,应用DNAMAN、NCBI ORF finder、BLAST、Conserved Domains、GOR、SWISS-MODEL、PDB等基因和蛋白质分析软件进行该目标基因测序及氨基酸序列分析。结果赤子爱胜蚓PP2A类似激活剂样蛋白cDNA序列长547 bp,编码87个氨基酸残基;与该蛋白基因序列相似度较高的多是不同物种中PP2A类似激活剂蛋白基因序列,其中与Crassostrea virginica serine/threonine-protein phosphatase 2A activator-like mRNA核苷酸相似度为67%;与该蛋白氨基酸序列相似度较高的多是不同物种中的PP2A类似激活剂蛋白氨基酸序列,其中与serine/threonine-protein phosphatase 2A activator(Crassostrea gigas)氨基酸相似度为70%;目标序列中存在一段PTPA超家族保守结构域,蛋白质二级结构以α螺旋以及无规则卷曲为主,三级预测结果与二级结构一致。结论本实验分析的赤子爱胜蚓PP2A类似激活剂样蛋白与牡蛎PP2A类似激活剂蛋白及存在于所有真核生物中且高度保守的PTPA同源度较高,可能具有特异性激活肿瘤抑制因子PP2A的间接抑制肿瘤作用。     

33株柯萨奇病毒A组16型分离株的全基因序列分析

目的对2008～2010年北京和青岛地区流行的33株柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus A16,CA16)分离株的全基因序列进行分析。方法收集2008～2010年北京和青岛地区CA16感染患者咽拭子标本,采用Vero细胞对病毒进行分离,并经噬斑纯化。提取病毒RNA,采用RT-PCR法分段扩增CA16全长基因,经序列测定和拼接后,利用DNAStar和MEGA5.10软件分析全基因序列。结果经病毒分离和噬斑纯化,共获得33株CA16分离株;33个分离株之间的核苷酸序列同源性大于90.9%,与CA16国际标准株G10各区段的核苷酸序列同源性为72.7%～89.0%,氨基酸序列同源性为79.3%～100.0%;与近年中国分离的CA16 SZ/HK08-7株同源性较高,全基因组同源性大于91.5%,各区段核苷酸序列同源性均大于83.7%;在基于VP1序列的种系进化树中,BJWG16、BJWG17、BJWG20等23个分离株属于C1亚型,其余10个分离株属于C3亚型。结论 2008～2010年北京和青岛地区流行的33株CA16分离株均为C基因型。本研究对我国CA16分子流行病学、毒力位点的研究以及疫苗株的选择具有重要意义。