利用自剪切融合蛋白在大肠杆菌中表达并纯化兔防御素

将源自兔嗜中性细胞的防御素基因NP-1插入原核表达载体pTYB2,并将重组质粒pTYB2-NP1转入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导使防御素以融合蛋白的形式表达。然后,通过亲和层析利用自剪切融合蛋白分离提纯目的蛋白。蛋白电泳检测到以二聚体形式存在的防御素,但此蛋白没有对大肠杆菌的抑菌活性。同时,对该表达纯化系统的特点和用原核生物大肠杆菌表达真核生物防御素的问题进行了分析和讨论。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)一种CXC趋化因子的克隆及其表达特征

从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选到一种CXC趋化因子。它的全长cDNA含有一个81bp的5’UTR,一个414bp的开放阅读框和一个449bp的3’UTR。开放阅读框编码了137个氨基酸残基。经过PCR扩增发现,该CXC趋化因子基因内含有4个外显子和3个内含子。RT-PCR分析表明,大菱鲆CXC趋化因子在正常脾脏和头肾中表达强烈;在胚胎的不同发育时期,大菱鲆CXC趋化因子从体节期开始才有微弱的表达。大菱鲆胚胎细胞(TEC)在用鳗弧菌感染后6h也有强烈的表达。这些结果表明该CXC趋化因子在大菱鲆免疫应答中起着重要作用。     

C端带多聚组氨酸标签的重组小鼠基质细胞衍生因子-1α原核系统的表达及分离纯化

在构建SDF-1原核表达系统的基础上，探索对其活性表达产物分离纯化的技术路线。将从小鼠骨髓组织克隆出的SDF-1a成熟肽基因插入原核表达质粒pET101／D-FOFO，用以转化大肠杆菌B1221Star^TM菌株，经SDS-PAGE进行诱导表达。SDS-PAGE和Western Blot检测证实：其表达产物在约11．6kD处有明显条带显示，其大小与预测的重组SDF-1a／His分子量一致。采用Ni^2 -Resin固相亲和层析法对由该系统表达的C端带6Xhis标签的重组SDF-1a／His进行分离纯化，纯度达92％。体外活性检测结果表明：重组小鼠SDF1a／His对T细胞有明显趋化和促生存作用；能有效诱导Jurkat细胞ERK磷酸化。     

一种抑制骨肿瘤的趋化因子被发现

由第二军医大学药学院生化药学教研室主任郭葆玉教授领导的课题组 ,经过两年多的时间 ,发现一种名为单核细胞趋化蛋白 1的趋化因子对骨肿瘤有抑制作用。该课题组对趋化蛋白 1的另一项科学实验结果通过美国默津公司ＤＮＡ芯片分析 ,发现它分别能使数十个抑制肿瘤和产生疾病的细胞因子的表达水平提高和降低。特别是对趋化蛋白受体 5 (一种伴随艾滋病毒进入细胞的辅助受体 )的细胞有抑制表达作用。一种抑制骨肿瘤的趋化因子被发现     

真鲷肿瘤坏死因子(TNFα)基因的体外重组与纯化研究

将真鲷肿瘤坏死因子(TNFα)基因的成熟肽区域克隆到表达载体pQE30中,并转化到大肠杆菌XL-blue中进行表达。转化子经载体和基因特异性引物进行PCR双向筛选,并将筛选到的阳性克隆经质粒纯化后,进行序列测定。序列测定结果显示,该基因结构正确,且准确插入到表达载体启动子的下游,获得了结构和组成正确的重组子。重、组子经IPTG诱导后,以SDS-PAGE电泳鉴定,电泳结果表明,该基因在大肠杆菌XL-blue中实现了表达。通过对诱导条件的调整,在体外获得了高效表达的重组蛋白,高效表达的重组蛋白约占菌体蛋白的25％-30％。不同诱导时间对重组蛋白影响实验显示,随诱导时间的增加,重组蛋白产量逐渐增高,经4h诱导,其表达量可以达到平台期,过长时间的诱导,对表达产量没有影响。重组蛋白经镍金属亲和层析纯化,获得了纯度较高的重组蛋白。采用交换缓冲液的方法,用Sephadex G150,对重组蛋白进行脱盐复性,使重组蛋白得到了进一步纯化。     

中期因子与自身免疫病和肿瘤的相关性研究进展

中期因子（Midkine,MK）是一种肝素结合生长/分化因子,在正常成人组织中微量表达,主要在胚胎期表达,随个体的发育阶段不同而变化,表达量逐渐减少。MK具有促进中性粒细胞和巨噬细胞浸润的功能,具有趋化活性,增强了炎症细胞的迁移。MK还与老年痴呆、糖尿病和子宫内膜异位症等自身免疫病有关,MK在几乎所有实体肿瘤中表达,血清MK水平与肿瘤大小及组织的免疫反应性强弱有关,并发现经手术治疗后血清MK水理明显下降,MK变异体的表达可能与肿瘤生成淋巴道转移有关,深入进行MK研究,对炎症性疾病、自身免疫病和肿瘤诊断提供指导,为自身免疫病和肿瘤的致病机制药物治疗研究提供新思路。     

栉孔扇贝血细胞的吞噬作用及其扫描电镜研究

用透射电镜和扫描电镜技术对栉孔扇贝血细胞的吞噬作用和表面结构进行了研究,结果表明,栉孔扇贝血细胞对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有很强的吞噬能力,注射细菌15h后,吞噬率分别达25％和27％,小颗粒（嗜中性颗粒）细胞吞噬能力最强,中颗粒（嗜碱性颗粒）细胞吞噬能力较弱,大颗粒（嗜酸性颗粒）细胞无吞噬能力,无颗粒细胞中只有少量较大的细胞具有吞噬能力。吞噬体不断与小空泡（初级溶酶体）融和形成大的吞噬体,并在其内将细菌逐步消化降解,吞噬体中的细菌也可被分散包围成多个小吞噬体后分别被降解。扫描电镜观察栉孔扇贝血细胞的圆形、椭圆形和梭形三种形状,多数血细胞容量变形形成伪足,可形成大量长的纤维状伪足的血细胞具有凝血的功能。     

人肥胖基因在大肠杆菌中的表达

肥胖基因编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。本文利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5’端的CCC转变为大肠杆菌常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆原核表达载体pT7-7,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经温度诱导,SDS-PAGE电泳可见分子量约为：16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的45％以上。表达重组蛋白经纯化,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

八肋游仆虫一种富含谷氨酸的蛋白GARP的表达与纯化

为研究游仆虫中含有三核苷酸重复序列的GARP基因编码的GARP蛋白在细胞中的功能,利用定点突变技术,将GARP基因中的TGA突变为通用半胱氨酸密码子TGT.突变后的GARP基因构建于原核表达载体pRSETc中,得到重组质粒pRSETc-GARP,将pRSETc-GARP质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,带有纯化标签的重组蛋白His6-GARP获得可溶表达,表达产物与抗His抗体在约26 kDa处有很强的交叉反应.His6-GARP蛋白在不同pH条件下通过两次阴离子交换层析和一次凝胶层析三步纯化达到电泳纯.     

人高血压相关基因(HRG-1)编码蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

为了研究一个新的人高血压相关基因HRG－1的编码蛋白在大肠杆菌中的表达及生物学活性,使用PCR的方法扩增人HRG－1基因ORF的编码序列,构建了原核表达质粒,并在大肠杆菌中诱导表达及进行体外活性鉴定,实验结果证明得到了具有生物学活性的人HRG－1原核表达蛋白,且人HRG－1原核表达蛋白具有真核表达蛋白一致的生物学活性。     

中国明对虾蜕皮抑制激素在大肠杆菌中的表达与分离纯化

采用大肠杆菌表达系统对中国明对虾蜕皮抑制激素(MIH)进行了体外重组表达研究.重组蛋白以包涵体的形式存在于菌体中.尿素-SDS-PAGE分析表明,经1mmol/L的IPTG诱导4h后,重组蛋白获得了大量表达,在分子量为13 kD处有一条与预测大小一致的特异性蛋白条带;经金属螯合柱纯化后,得到了电泳纯的融合蛋白.Western blotting检测结果表明:重组表达的融合蛋白与兔抗刀额新对虾MIH的多克隆抗体特异结合,证实该融合蛋白为中国明对虾MIH.通过胶内酶切与LC-ESI-MS分析进一步证实融合蛋白的部分肽段与日本对虾MIH一致.MIH融合蛋白的成功表达为进一步深入研究其在中国明对虾蜕皮过程分子作用机制奠定了基础.     

牙鲆生长激素基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)脑垂体总RNA中扩增出编码牙鲆生长素(GH)成熟肽基因序列。重组至融合表达载体pGEX-4T-3中,构建成牙鲆GH基因融合表达载体pGEX-gh,转化大肠杆菌BL21(DF3),筛选阳性克隆,IVIG诱导表达。经SDS-PAGE电泳显示在45kD处有特异的蛋白条带出现,该蛋白的表达量随诱导时间的延长而增加,3h达最高值,达到细胞总蛋白的18．3％。该融合蛋白在胞内主要以包涵体状态存在,经优化表达条件,成功地获得了可溶性的融合蛋白,经Glutathione Sepharase 4B凝胶纯化后用Western-blotting检测表明其为牙鲆生长激素,并通过酶联免疫吸附受体法证实其具有生物学活性。     

一种蛋白质纯化流程用于提纯大肠杆菌表达的蛋白片段

用一种新的蛋白质纯化流程提纯由大肠杆菌表达的夏氏疟原虫AMA1片段。大肠杆菌表达的片段首先用镍柱提纯，提纯后的蛋白用DTT还原，对盐酸胍透析，再对空气氧化。用RP－HPLC对片段二次提纯，通过冻干转换缓冲液。SDS－PAGE、RP－HPLC和质谱分析都显示，经这种纯化流程提纯的蛋白有很高的纯度，且二硫键已完全正确形成。提示这一蛋白质纯化流程可用于由大肠杆菌表达的低分子量寡二硫键的蛋白。     

人免疫缺陷病毒I型p24gag基因的重组与表达

将编码人Ｉ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）衣壳蛋白的ｐ２４ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建成了重组表达质粒ｐＥＴ２４，并使ｐ２４ｇａｇ基因片段在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中高效表达，产物为３０ｋＤａ的ｓ１９－ｐ２４融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的３８．４％。重组ｐ２４蛋白均与抗ｐ２４单克隆抗体及ＨＩＶ－１阳性血清发生特异性反应，具有较好的抗原性。     

人体c-Mpl分子配体蛋白XP1的表达、纯化及活性初步鉴定

TPO是近年发现的血小板生成素，它通过与其受体c-Mpl的结合刺激巨核细胞的发生，调节动物或人体血小板的生成。利用酵母双杂交系统，以人体c-Mpl受体作为诱饵蛋白，我们从人体肝脏cDNA文库筛选到另一与c-Mpl相结合的新配体，命名为XP1。将：xpl-cDNA构建到pET-28b大肠杆菌融合表达载体，经金属离子亲和层析柱和DEAE阴离子层析柱分离纯化，获得纯度为99％的His-XPI水溶性融合蛋白。表达产物利用小鼠巨核细胞集落形成单位测定活性。结果表明：xpl基因在大肠杆菌中获得高效水溶性表达；其产物对小鼠骨髓细胞巨核细胞集落形成单位有明显的刺激作用。     

LC-MS/MS methods for absolute quantification and identification of proteins associated with chimeric plant oil bodies

Oil bodies (OBs) are plant cell organelles that consist of a lipid core surrounded by a phospholipid monolayer embedded with specialized proteins such as oleosins. Recombinant proteins expressed in plants can be targeted to OBs as fusions with oleosin. This expression strategy is attractive because OBs are easily enriched and purified from other cellular components, based on their unique physicochemical properties. For recombinant OBs to be a potential therapeutic agent in biomedical applications, it is necessary to comprehensively analyze and quantify both endogenous and heterologously expressed OB proteins. In this study, a mass spectrometry (MS)-based method was developed to accurately quantify an OB-targeted heterologously expressed fusion protein that has potential as a therapeutic agent. The effect of the chimeric oleosin expression upon the OB proteome in transgenic plants was also investigated, and the identification of new potential OB residents was pursued through a variety of liquid chromatography (LC)-MS/MS approaches. The results showed that the accumulation of the fusion protein on OBs was low. Moreover, no significant differences in the accumulation of OB proteins were revealed between transgenic and wild-type seeds. The identification of five new putative components of OB proteome was also reported.     

行走前后对地板抗滑性的主观评量分析

目的调查行走前后地板抗滑性主观评量的影响因素及二者之间的关系。方法设计了4因子实验。实验因子包含地板粗糙度、地板表面情况、鞋底材质和照明情况。被试在步道待试区对地板感知抗滑性给出1(非常滑)-5(不滑)的评分;待走过实验步道后,再次对地板感知抗滑性给出评分,并对自觉滑动感(PSOS)做出评分。运用SAS分析软件对得到数据进行统计分析。结果地板粗糙度、地板表面情况和照明水平对实验前主观抗滑性存在显着的影响(P0.0001);鞋底材质、地板粗糙度和地板表面情况对实验后主观抗滑性及自觉滑动感(PSOS)存在显着的影响;地板粗糙度与实验前(r=0.38,P0.0001)与实验后(r=0.52,P0.0001)的主观抗滑性均为正相关;实验后的主观抗滑性与自觉滑动感为高度负相关(r=-0.84,P0.0001)。结论行走前地板主观抗滑性显著的受地板粗糙度、地板表面情况、照明水平的影响;行走后地板主观抗滑性显著的受鞋底材质、地板粗糙度和地板表面情况的影响。     

真鲷肌肉生长抑素(MSTN)基因的克隆及表达分析

采用同源克隆的策略,设计了3对引物,首次分离、克隆了2820bp的真鲷肌肉生长抑素(MSTN)基因组序列,该序列在GenBank上注册(注册登录号为AY965686).经过剪接、比较,分析了真鲷MSTN基因的序列和结构特征.真鲷的MSTN基因具有3个外显子、2个内含子,整个开放阅读框编码着384个氨基酸,第1个外显子上有一个连续11个Q氨基酸的残基,C-末端具有9个保守的半胱氨基酸及一个RVRR的蛋白酶解加工位点.在第1、第2内含子和3'非翻译区上分别具有一个微卫星重复序列.RT-PCR分析表明,MSTN基因在真鲷不同组织中都有表达,但表达量具有明显的差异;MSTN在肌肉中表达量最高,其次是脑、小肠、头肾、鳃和性腺,心脏、眼睛、肝脏中只有极少量表达,脾脏中没有检测到MSTN的表达.