携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体的构建

为了构建携带Herceptin-MICB融合蛋白基因的腺病毒载体,筛选出能表达该融合蛋白的重组腺病毒,检测其表达融合蛋白的情况及抗肿瘤特征.首先,通过PCR将NKG2D的配体MICB的基因片段插入含有全长抗体Herceptin基因的5型腺病毒穿梭载体pDC339-Her中,获得载体pDC339-Her-MICB与腺病毒骨架载体pBHGlox△E1,3Cr重组,然后在293细胞内进行病毒包装得到非增殖型腺病毒Ad-Her-MICB,纯化后测病毒滴度.双抗体夹心ELISA和Western blot检测融合蛋白的表达情况;间接免疫荧光实验(IFA)检测融合蛋白的特异性.酶切后DNA电泳鉴定证实载体构建成功,重组病毒经PCR鉴定携带融合蛋白基因.融合蛋白的表达量为(623.25±38.62)ng/mL;Westhern blot显示:该融合蛋白与商品化的Herceptin抗体轻链重链比较,大小一致,浓度匹配;间接免疫荧光检测(IFA)显示了融合蛋白与HER-2过表达的卵巢癌细胞株SK-OV-3结合的特异性.结果表明:腺病毒Ad-Her-MICB携带Herceptin-NKG2D配体融合蛋白基因能在体外正常表达且与商品化的Herceptin生物学特性相似,为融合蛋白的抗肿瘤治疗奠定基础.     

重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中融合可溶表达

将N-利用基质(NusA)和人骨形态发生蛋白-2成熟肽(hBMP-2m)的编码基因进行基因融合,实现了hBMP-2m在大肠杆菌中的融合可溶表达.以大肠杆菌基因组DNA为模板PCR扩增得到NusA基因,通过NdeⅠ和AflⅡ酶切位点将其置换出重组融合表达载体pDsbA-hBMP-2m中的DsbA基因,使hBMP-2m基因重组于NusA基因的下游,重组质粒转化E.coli BL21(DE3),获得工程菌.在30℃条件下,经IPTG诱导表达后,融合蛋白占细胞总蛋白的45%左右,并且主要以可溶形式存在,可溶部分达90%以上.经过简单的Ni 2+柱一步纯化即可得到纯度较高的融合蛋白.通过融合表达的方式表达出可溶性的目的蛋白,有望复性后通过肠激酶酶切得到hBMP-2m单体,进一步二聚体化得到具有生物活性的hBMP-2m.     

携带Herceptin与MICA胞外结构域融合基因的重组腺病毒的构建及鉴定

通过构建能表达抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为进一步联合NK细胞的治疗研究奠定基础.采用Overlap-PCR的方法获得Herceptin与MICA胞外结构域的融合基因,并将融合基因连接到载体pDC339上.接着再利用酶切及PCR方法鉴定载体及重组病毒基因的正确性,并通过ELISA和Westem Blot检测融合蛋白的表达情况,最后经间接免疫荧光分析(IFA)检测融合蛋白的结合特性.构建的载体酶切后经电泳鉴定证实构建成功,重组病毒DNA的PCR显示病毒携带了Herceptin的轻链基因、重链基因及MICA胞外结构域的基因;ELISA和Western Blot证实重组腺病毒成功地表达出了目的融合蛋白;IFA实验表明融合蛋白能与SK-OV-3细胞表面的Her-2受体特异性地结合.最后成功地构建了能表达具有正常结合特性的抗体Herceptin与MICA胞外结构域的融合蛋白的重组腺病毒,为之后与NK细胞的联合治疗研究奠定基础.     

人溶菌酶/乳铁蛋白双基因重组质粒在牛乳腺细胞中的表达

研究检测人溶菌酶/乳铁蛋白双基因重组质粒pEBH-IL在牛乳腺上皮细胞中的表达。采用脂质体转染技术,将pEBH-IL质粒DNA导入体外培养的牛乳腺上皮细胞中。加入G418对转染的细胞加压筛选,获得稳定转染的细胞。采用绿色荧光蛋白(EGFP)和PCR方法检测牛乳腺细胞基因组中的目的基因,并采用Westhorn Blot对重组质粒在牛乳腺细胞表达产物进行检测。试验表明:G418筛选获得稳定转染的细胞,对照组加压后第7 d细胞全部死亡,转染组第12~15 d汇片达80%左右;在荧光显微镜下观察到EGFP表达;PCR检测到目的基因;阳性细胞培养液中检测到目的蛋白的表达。结果表明:以人溶菌酶/乳铁蛋白为目的基因构建的重组质粒pEBH-IL在牛乳腺细胞中具有表达功能。     

黑曲霉ZF-34脂肪酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

为了使黑曲霉脂肪酶基因在毕赤酵母中表达并实现高密度发酵生产,采用PCR方法从黑曲霉基因组DNA中扩增出脂肪酶基因Lip A,测序结果表明Lip A基因编码区全长894 bp,编码297个氨基酸,与其他黑曲霉脂肪酶基因列序相似性高达99%。将Lip A基因连接到质粒p PIC9K上,构建了p PIC9K-LipA重组载体。将该重组载体转化到毕赤酵母GS115中,经甲醇诱导,该酶基因在酵母细胞中获得活性表达,并能将酶蛋白分泌到胞外。重组菌株GS115/p PIC9K-LipA经100 L发酵罐发酵144 h,菌体湿重高达100. 5 g/L,发酵液中酶活性达1 950 U/m L。     

人γ干扰素突变体（hIFNγ135—X14）在大肠杆菌中高效表达

利用体外重组技术,将人γ干扰素坏死因子融合蛋白（ｈＩＦＮγ１３５－Ｘ１３－ｈＴＮＦβ１４８,ｈγＴＮＦβ）的基因５′端ｈＩＦＮγ１３５－Ｘ１３编码序列取出,添上终止密码子,克隆到ｐＢＶ２２０表达载体ＰｇＰＬ串联起支子的下游,构建在人γ干扰素突变体（ｈＩＦＮγ１３５－Ｘ１４）表达质粒,在质粒构建过程中,原载体上紧接ＳＤ序列后的ＥｃｏＲ１位点的被新引人的ＸｂａＩ位点所取代,重组后的质粒,ＳＤ序列与ＡＴ     

HBV S/HEV ORF2融合基因对番茄的遗传转化

应用重组PCR技术将乙肝病毒(HBV)S基因连接在戊肝病毒(HEV)ORF2部分序列的5′端,二者通过柔性肽(Gly4Ser)2序列相连,构建成融合基因BE。将融合基因BE克隆到植物双元表达载体pBin438上,获得pBin438BE,然后用冻融法将其转入根癌农杆菌EHA105中,侵染丽春番茄子叶和下胚轴,经预培养、共培养、筛选培养、生根培养获得了5株抗卡那霉素的番茄植株。提取抗性植株基因组DNA,进行PCR及PCR-Southern检测,4株获得阳性信号。初步表明目的基因已整合到了番茄基因组中。     

CTB-InsB融合基因在大肠杆菌中的表达研究

构建了一种霍乱毒素B亚基（CTB）与人胰岛素B链（InsB）的融合基因，并克隆入表达载体pGEX-4T-1中，命名为pGEX—CTB-InsB。该融合蛋白在大肠杆菌中的表达产物以包涵体形式存在，分子量约为43kDa。包涵体经溶解和复性后，使用GSTrapFF亲和层析柱纯化得到融合蛋白。经SDS-PAGE和Western免疫印迹分析证实纯化蛋白为重组目的蛋白。     

基因工程简介

基因工程是目前国内外十分活跃的研究领域,它的特点是按照人们预先设计的蓝图,把某一目的基因的DNA和载体DNA连接起来,把它引入细菌或酵母菌(也可切除原有的具有不良作用的基因),得到一重组微生物,即工程菌。再由工程菌产生这一目的基因的产物,即在分子水平上操作,细胞水平上表达。因此,基因工程也称之为基因克隆(gene cloning)和重组DNA(recombinant DNA)技术。     

信号肽引导源基因在昆虫表达系统中的分泌表达

将杆状病来源的gp67信号肽引导的慈姑蛋白酶抑制剂(API)基因与植物来源的慈姑蛋白酶抑制剂信号肽引导的慈姑蛋白抑制剂(API)基因，分别克隆到昆虫杆状病毒转载体pBacPAK8中，通过共转染将它们分别整合到昆虫病毒表达载体Bm—BacPAK6中，将获得的重组病毒CrBK—API2和CrBK—bpAPI4分别接种家蚕(Bombyx mori)细胞、家蚕幼虫及蛹体中，慈姑蛋白酶抑制剂得到了高效表达。从家蚕细胞的表达来看，外源表达产物大多存在于细胞外的上清液中；从家蚕幼虫体内表达来看，信号肽能引导外源基因高效表达，且表达产物的90％以上能分泌到细胞外；蛹体中的表达情况与幼虫中的相似，但表达产物出了不均一的现象，从表达产物的分子量测定来看，这两种信号肽在表达过程中都没有被切除。     

小鼠β-actin基因的RT-PCR克隆与真核表达

以Trizol-异丙醇法提取小鼠肝脏总RNA,根据NCBI数据库中小鼠β-actin基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增小鼠β-actin基因编码区并测序;以pcDNA3.1-flag为载体,构建β-actin基因真核表达质粒,继而将其重组产物转染于HeLa细胞,采用Western blot印迹法鉴定重组蛋白pcDNA3.1-flag/β-actin的表达水平。结果表明:克隆获得的289 bp片段与NCBI数据库中β-actin基因序列完全吻合,并且成功构建的pcDNA3.1-flag/β-actin真核基因表达载体,其重组质粒可在HeLa细胞中有效表达约43×10~3KD融合蛋白。     

中国明对虾溶菌酶点突变基因的原核表达

为解决中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)溶菌酶成熟肽(FcLys)可溶性问题,构建了点突变基因的原核表达质粒,并进行重组表达。以已构建的带有FcLys目的基因的重组克隆质粒为模板扩增FcLys点突变(FcLysM)的基因片段,将该对虾溶菌酶成熟肽序列的N端和C端中含有几个疏水性氨基酸经点突变改为亲水性氨基酸,但不改变其活性中心和二硫键的形成。将FcLysM的基因片段与表达载体连接并转化,制得基因工程菌pET-39b(+)-FcLysM/Rosetta(DE3)。通过基因测序方法验证该重组表达质粒读码框的准确性以及FcLysM目的基因序列的正确性。该工程菌表达后在SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子质量约为43ku的融合蛋白FcLysM。进一步研究分析证明,该重组点突变蛋白的可溶性表达量高于非突变的对虾溶菌酶表达量。     

带跨膜片段的α-PEC的分子构建

通过分子设计构建一段来自人红细胞膜上的血型糖蛋白A（glycophorin A，GPA）中的跨膜片段基因，并连接到藻红蓝蛋白基因片段（pecA）的N端，将融合基因插入到表达载体pET30a进行表达。表达产物以包涵体形式存在，通过优化条件使其溶解，并与藻蓝胆素PCB在裂合并构酶PecE／PecF催化下进行体外重组，通过可逆光致变色活性大小确定包涵体溶解的最佳条件。结果表明，超声后的细胞加入终浓度8mol／L尿素，0．2％Triton X-100和一定量的PecE和PecF，透析时采用含0．2％Triton X-100的尿素梯度透析可使重组活性最高。研究为可逆光致变色生物材料在生物光电材料中的应用打下了基础。     

腺相关病毒载体的杆状病毒生产系统的构建

由于腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的非致病性及能感染多种组织类型,重组AAV载体(rAAV)在基因治疗领域备受关注.然而,如何高效生产rAAV以适应临床上对其高产量的需求一直是限制其应用的瓶颈.借助杆状病毒携带rAAV包装所需组分,通过感染昆虫细胞来生产rAAV是一种能够解决其产量瓶颈的生产方式.将AAV2的Rep、Cap基因序列以及含AAV2 ITR及EGFP表达框的序列分别构建到三个杆状病毒中,通过共感染Sf9细胞来生产rAAV,结果显示成功包装出rAAV病毒,且病毒活力较好.这种生产方式很容易放大,将为AAV载体产业化及临床应用奠定基础.     

昆虫杆状病毒表达egfp载体构建及鉴定

用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ将目的基因片段6His-11R-eGFP从载体pDC316-6His-11R-eGFP上酶切下来,并将该目的基因片段与供体载体pFastBacl连接构建供体质粒pFastBacl-6His-11R-eGFP;将其转化大肠杆菌(Escherichua coli)DH10Bac感受态细胞,经卡那霉素、四环素、庆大霉素及蓝白斑筛选得到重组杆状病毒载体pBac-6His-11R-eGFP,PCR鉴定得到单一目的基因条带.将该病毒载体转染Sf9细胞,进行病毒包装,在倒置荧光显微镜下观察蛋白表达,并以荧光定量PCR方法测定病毒滴度.     

抗菌肽基因在E．Coli JM109中的克隆表达

合成5条50～70bp的DNA片段，用“片段拼凑”的方法通过三步PCR扩增得到目的基因，天蚕素基因被克隆到PUC19载体上，再转化大肠杆菌JM109，电泳分析重组质粒，确定天蚕素基因已转化到JM10g上，摇床发酵转化子，IPTG诱导表达目的肽，最后提纯表达产物，SDS-PAGE电泳分析表明有特异性带出现，荧光色谱分析表明表达肽与目的肽组成一致，最后确定天蚕素在JM109中得到表达，抑菌圈活性实验表明，表达肽具有一定抗菌活性。     

重组Taq DNA聚合酶在大肠杆菌中的表达与纯化

从嗜热菌Thermus aquaticus中分离出的Taq DNA聚合酶由于其热稳定性，在聚合酶链式反应(PCR)中得到广泛的应用，我们根据编码Taq DNA聚合酶的基因序列，设计出一对引物，通过PCR扩增出Taq DNA聚合酶基因，并将其克隆到表达载体pET-15b中，转化大肠杆菌E．coli BL21(DE3)，经IPTG诱导后，重组Taq DNA聚合酶在大肠杆菌中实现了大量表达。经过热变性、亲和层析、阳离子交换层析获得了电泳纯的重组Taq DNA聚合酶。本研究的生产程序可作为Taq DNA聚合酶生产的一种新方法。     

HIV-1蛋白酶在大肠杆菌中的表达

分泌融合表达HIV-1蛋白酶(Protease,PR),用于对HIV蛋白酶抑制剂的筛选.利用重叠延伸PCR方法,获得使用大肠杆菌偏爱密码子的编码HIV-1蛋白酶(PR)的基因,将目的基因重组至原核表达载体pET-SP-DsbA-T,得到"pET-SP-DsbA-PRsite-PR"分泌融合表达型载体,重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3).工程菌在LB培养基中添加终浓度为0.1 mM的IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析周质蛋白.DNA测序结果证实合成的HIV-1 PR基因与设计的序列完全一致,在周质空间表达出具有自切割活性的HIV-1 PR蛋白.研究成功合成并克隆了使用大肠杆菌偏好密码子的HIV-1 PR的DNA编码序列,经表达鉴定得到具有自切割活性的HIV-1 PR蛋白.     

基于植物p53保守序列构建RNAi的DNA片段方法

构建p53基因RNA干涉DNA片段的目的,是将其应用于植物悬浮培养中的细胞周期调节．依据拟南芥p53基因与其他高等植物具有高度保守区域的特点,合成其两个区域的核苷酸片段（Ⅰ和Ⅱ）及其相应的反向片段（Ⅰ＇和Ⅱ＇）,并在Ⅱ和Ⅱ＇端部分别引入内含子两个端部核苷酸序列．在相互连接后进行PCR选择扩增,其产物再与克隆裁体连接并经过蓝白斑筛选获得重组DNA;在电泳和核苷酸测序鉴定后表明,最终得到了Ⅰ-5＇-内含子-Ⅱ＇-Ⅱ-内含子-3＇-Ⅰ＇序列的重组DNA片段该片段两端含多克隆位点,通过插入植物的表达载体进入细胞基因组,在细胞中其转录产物将形成发夹结构,经胞内酶切后可以形成短的双链RNA片段,将具有干涉p53基因表达的功能     

重组猪IFNα的构建及原核可溶性表达研究

使用原核表达系统可溶性表达猪α-干扰素,并进行纯化和鉴定。根据Gene Bank中报道的猪α-干扰素成熟肽基因序列设计引物,以猪肝脏细胞基因组DNA为模板,用PCR方法扩增猪α-干扰素成熟肽基因,并将其定向克隆到原核表达载体pET32a+中,转化大肠杆菌DH5a。阳性克隆经PCR鉴定、双酶切鉴定以及测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21进行诱导表达。对表达产物进行SDS-PAGE分析、镍柱亲和层析纯化、Western-blot鉴定。结果表明:成功构建了猪α-干扰素原核表达载体pET32a+-poIFN-α;表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约3.8×104的位置出现了目的蛋白条带,与预期相符;Western-blot鉴定显示有特异性条带出现。实现了重组猪α-干扰素的可溶性表达,获得了纯度较高的重组猪α-干扰素,为进一步研究其药物作用奠定了基础。