肉及肉制品中沙门氏菌活细胞的PCR检测研究

将荧光染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结合,通过对PMA的曝光时间、浓度进行优化,确定PMA-PCR区别死活细胞的最佳条件,并制作活细胞定量标准曲线,建立肉及肉制品中沙门氏菌活细胞的PMA-PCR检测方法。结果表明：使插入死细胞DNA中的PMA活化并且光解溶液中游离PMA的最佳曝光时间为15min;不抑制沙门氏菌活细胞DNA扩增的最大PMA质量浓度为10μg/mL;完全抑制热致死细胞DNA扩增的最小PMA质量浓度为4μg/mL。经PMA处理,含有不同比例的沙门氏菌热致死细胞和活细胞的混合液中活的沙门氏菌能够通过PCR被选择性的检测,最小检测限为20CFU/PCR。而且,经研究发现在20～2×105CFU/PCR范围内,电泳条带相对荧光强度与活细胞数的对数具有线性关系。采集30份肉及肉制品样品,利用PMA-PCR方法检测出两份生肉样品中存在沙门氏菌,经过6h的富集培养后的活菌浓度分别为2.5×103CFU/mL和3.4×103CFU/mL。     

应用基因芯片技术检测肉及肉制品中5种致病菌

建立一种运用多重聚合酶链式反应(PCR)结合基因芯片技术检测大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌5种食源性致病菌的快速、准确、灵敏的方法。分别选取编码大肠埃希氏菌的slt基因、沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、志贺氏菌ipaH基因和单核细胞增生李斯特菌inlA基因,并以细菌16S rDNA基因作为阳性对照,设计引物和探针,进行多重PCR扩增,产物与含特异性探针的芯片杂交。结果表明：该基因芯片可同时特异性地检测5种致病菌,多重PCR检测灵敏度为20pg,而DNA芯片检测灵敏度可达2pg;用所制备的基因芯片检测实际肉及肉制品样品,准确率高于传统培养法。所建立的基因芯片检测方法特异性好、灵敏度高,可为食源性致病菌的检测提供理想手段。     

环介导等温扩增技术检测肉及肉制品中沙门氏菌

建立用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测肉及肉制品中沙门氏菌的方法。利用靶基因的6 个区段设计4 条引物,应用具有链置换活性的Bst DNA 聚合酶,能够在恒温(65℃左右)条件下特异、高效、快速地扩增待测物的DNA。针对沙门氏菌的特异基因invA 基因设计两对LAMP 引物,建立LAMP 检测沙门氏菌的新方法,并对肉及肉制品中的沙门氏菌进行检测。结果表明：建立LAMP 技术检测肉及肉制品中沙门氏菌的方法,该方法能够特异检测沙门氏菌,且灵敏性可达10-9CFU/mL,对48 份样品检测,该方法检出率为91.6%、敏感性100%、特异性70.0%、符合率为93.8%、检出时间1.5h。     

产气荚膜梭菌肠毒素基因地高辛探针制备与检测方法建立的初步研究

产气荚膜梭菌（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ,ＣＰ）是人类和家畜重要的厌氧性病原菌,产生肠毒素的ＣＰ是人类食物中毒病原菌。本研究用地高辛标记肠毒素基因制备探针,并建立了原位杂交检测方法,直接检测肠毒素基因（ｃｐｅ）。这是继ＰＣＲ检测方法后又一项特异性基因诊断技术。由于利用了光学显微镜观察结果,形态学上比较直观,增加了实验的准确性。与ＰＣＲ、乳胶凝集相比,原位杂交检测方法具有较高的敏     

Detection of Enterotoxigenic Escherichia coil in Foods by DNA Colony Hybridization

A DNA colony hybridization procedure was used to identify and enumerate a heat-labile toxin-producing strain of Escherichia coli (H10407) in various types of foods. Foods were seeded with H10407 cells and examined by DNA hybridization on nitrocellulose filters with ³²P- labeled heat-labile toxin gene fragments. The number of cells recovered on plate count agar and eosine methylene blue agar was compared. With nitrocellulose filters, recoveries were about 81% on plate count agar and about 76% on eosine methylene blue agar. No significant differences in recovery were observed with ten different food types.     

膜反向斑点杂交技术在结核分枝杆菌耐药突变株中的检测应用

本文通过对膜反向斑点杂交中各杂交条件的摸索,旨在建立一种快速检测katG、rpoB基因突变的膜反向斑点杂交技术.通过验证该技术成功的验证了膜反向斑点杂交技术在检测结核分枝杆菌耐药性上的应用价值.本实验首先应用PCR技术扩增结核分枝杆菌的katG、rpoB耐药基因,然后用膜反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌的耐药基因,最后...     

Comparative Study of a DNA Hybridization Method and the Conventional Culture Procedure for Detection of Salmonella in Foods

A commercial DNA hybridization assay (DNAH) for rapid detection of Salmonella in foods was compared to the conventional culture procedure. The DNAH method employed preenrichment, selective, and post-enrichment steps (44°hr) prior to performing the assay (4hr). Confirmation of positive DNAH assays was accomplished using standard culture methods for isolation of Salmonella. More than 1,600 samples were tested, representing 23 food types and including naturally contaminated, artificially inoculated, and uninoculated foods. Based on the data generated, the DNAH method was as productive as the standard culture method for detection of Salmonella in all foods and was significantly better than the culture method for certain foods.     

一种新型毛细管色谱柱在2,3,7,8-TCDD检测中的应用

本实验利用DB-Dioxin毛细管色谱柱和GC-ECD成功建立了鱼肉组织中2,3,7,8-四氯代二苯并-P-二嗯含量的检测方法。采用Bio-beadsS-X3凝胶色谱柱和多色谱纯化对样品进行前处理,以DB．Dioxin毛细管色谱柱进行分离,ECD对鱼肉组织中的2,3,7,8．TCDD进行检测。结果该方法在1．5-100pg范围内呈线性关系（R2=0．9999）,标准回收率为103．2％±3．04％,变异系数为2．95％,其最低检测限为1pg。2,3,7,8-TCDD和其衍生物及样品中的杂质分离良好。     

微生物显色法检测禽畜肉中混合抗生素残留

以微生物显色为原理,建立一种对畜禽肉中单一或配伍使用的抗生素进行联合初筛的高通量方法,并用色谱法对阳性样品进行验证。以大肠埃希氏菌（Escherichia coli,CICC 23657）作为指示菌,选取适当的抗生素残留提取方法,并通过单因素试验优化检测液配方及检测体系组成,最终实现对不同类别抗生素的联合检测。结果表明：选取柠檬酸-丙酮缓冲液进行提取,提取效率达到86%～88%,相对标准偏差为3.9%～4.3%;蛋白胨添加量为1.0 g/100 mL、溴甲酚紫指示剂添加量为2.0 mg/100 mL、pH值为7.2时,检测液显色效果较好;菌悬液初始吸光度（A600 nm）为0.4,检测液、菌液、样品提取液体积为150 μL∶50 μL∶100 μL时,检测效果最佳,对畜禽肉中喹诺酮类抗生素的检出限为60～180 μg/kg,氨基糖苷类检出限为60～140 μg/kg,喹诺酮类与氨基糖苷类配伍使用时的检出限为40～180 μg/kg;进一步用色谱法对50 份样品的初筛结果进行验证,无假阴性样品存在,说明该方法可用于畜禽肉中抗生素残留的初筛。     

鱼肉DNA提取方法比较及物种鉴定研究

本研究采用改进煮沸法(BP法)以及传统蛋白酶K法(TP法),从16种鱼肉样品中提取DNA,分析比对两种方法提取DNA的浓度、纯度、以及普通PCR和荧光PCR的效果。同时,运用BP法从70个市售鱼肉产品中提取总DNA,并采用DNA条形码技术进行物种鉴定。结果表明,BP法提取DNA耗时较短,对于大部分鱼肉样品,BP法提取的DNA浓度低于TP法,但两种方法提取的DNAA260/A280无显著差异,均满足普通PCR和荧光PCR扩增要求。另外,BP法提取的DNA可用于市售鱼肉产品DNA条形码鉴定,通过比对发现,81.43%的鱼肉产品可匹配到相似度≥98%的物种,在种水平和属水平的鉴定成功率分别为48.57%和72.86%。BP法在提取DNA过程中可缩短时间,降低提取成本,便于大批量样品的检测。     

免疫磁分离和可视化金纳米杂交探针法快速检测婴幼儿配方乳粉中的阪崎克罗诺杆菌

利用免疫磁分离和金纳米杂交探针策略,开发一种快速和灵敏的可视化检测婴幼儿配方乳粉(powdered infant formula,PIF)中阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)方法.抗体功能化的磁颗粒捕获C.sakazakii,金纳米探针对聚合酶链式反应的产物进行分析,这种探针法可以替代传统的电...     

基因芯片在肉品检测中的应用(英文)

As a new micro-analysis technique DNA chip has became one of research hot spots. This article summarized the basic concept of DNA chip technique,the application in meat product detection and discussed the advantaged and disadvantaged of DNA chip technique. It can provide theoretical principle for the application of DNA chip technique.     

磁分离结合qPCR快速检测酱卤肉中的沙门氏菌

验证噬菌体磁分离结合实时荧光定量聚合酶链式反应,快速检测方法对食品中沙门氏菌的检测效果。以一株鼠伤寒沙门氏菌的特异性噬菌体T102为分子识别元件,首先将其与羧基化磁珠偶联,制备获得噬菌体磁性颗粒（Phage T102 Magnetic Beads）复合物,利用噬菌体磁性颗粒复合物从食品中特异性分离富集沙门氏菌,然后利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测富集后的沙门氏菌。该沙门氏菌快检方法检出限为100 CFU/mL（0.1 CFU/PCR）,线性范围为1×102~1×109 CFU/mL,变异系数2.1%,特异性强,检测时间为6 h。实验选取300批食品安全抽检样品与GB 4789.4-2016标准《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》进行比对,均未检出阳性样品,结果一致。该方法可为噬菌体偶联纳米磁珠在食源性致病菌检测领域的应用提供参考依据。     

7种肉类线粒体DNA的提取及鸭源性成分检测

探讨肉类线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)提取方法,对7种生肉中的鸭肉成分进行鉴别。应用改良盐析法和柱层析法提取肉类mt DNA,紫外分光光度计检测mt DNA的浓度和纯度,设计鸭肉cyt b特异性引物,采用PCR对7种生肉中的鸭肉成分进行鉴别。结果:两种提取肉类mt DNA的方法均能保证DNA的浓度及纯度达到PCR的要求,柱层析法成本略高于改良盐析法;鸭引物可以从7种生肉中鉴别出鸭源性成分,经过多次重复试验证明了鸭肉引物的特异性,为肉制品质量监控的应用提供了实验基础。     

HDA法用于检测肉中金黄色葡萄球菌的研究

本文研究了猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌的依赖解旋酶恒温基因扩增检测方法(HDA法),以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因为目的基因,设计一对特异性引物,优化反应条件UvrD helicase、T4 gp32的浓度,通过赖解旋酶恒温基因扩增方法直接检测猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌,扩增产物通过电泳进行检测。结果表明,HDA法检测肉中金黄色葡萄球菌的特异性强,试验涉及的其它菌株未发生扩增,只有金黄色葡萄球菌得到与设计序列长度一致的216 bp基因片段,检出限为101 CFU/g,优化确定UvrD helicase、T4 gp32的终浓度分别为0.1 μg、5.0 μg,该方法用于检测猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌的灵敏度高,耗时短,为猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌的快速检测提供了新的方法,也为其它食品中金黄色葡萄球菌的快速检测奠定了基础。     

基于核酸适配体杂交链式反应比色法检测鼠伤寒沙门氏菌

该研究探讨了基于核酸适配体特异性识别机制和杂交链式反应（hybridization chain reaction,HCR）扩增策略,以金纳米粒子（gold nanoparticles,AuNPs）颜色变化为比色信号,设计了一种无标记、无酶、灵敏的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium,S. typhimurium）比色检测法。根据鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体设计引发链和两个发夹探针,核酸适配体捕获鼠伤寒沙门氏菌,触发引发链打开发夹探针,发生杂交链式反应,在实现目标菌信号放大同时,利用反应前发夹探针粘性末端以及反应后形成的杂交长链对金纳米粒子结合差异性,产生比色信号,实现鼠伤寒沙门氏菌的快速检测。通过对杂交链式反应时间、发夹探针与金纳米粒子结合时间以及发夹探针浓度等实验参数进行优化,提高实验灵敏度。在最优实验条件下,鼠伤寒沙门氏菌浓度对数值与紫外吸光比值（A630/525）在103~107 CFU/mL范围内呈现良好的线性关系,检测限为6.3×101 CFU/mL,在牛奶样品中加标回收率为90.05%~109.97%。本比色法操作方便,无需要化学修饰以及复杂仪器且实验结果可视,为鼠伤寒沙门氏菌监测提供一种新的方法。     

双抗夹心酶联免疫吸附快速检测冷鲜肉中的6 种血清型沙门氏菌

为快速检测冷鲜肉中的沙门氏菌,筛选出1 株产抗6 种沙门氏菌单克隆抗体的细胞株,运用产生的抗体建立酶联免疫吸附检测方法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）。实验采用6 种血清型致病沙门氏菌制备出混合抗原,对BALB/c小鼠及新西兰大白兔进行免疫,运用杂交瘤技术进行细胞融合,制备出抗沙门氏菌单克隆抗体以及多克隆抗体,并建立双抗夹心ELISA体系检测冷鲜肉中沙门氏菌。结果表明,成功筛选出1 株能稳定分泌抗沙门氏菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株6E7,保藏编号为CGMCC 10313以及多克隆抗体,效价分别为1∶1.28×106和1∶8.0×105 ;将多抗作为包被抗体吸附于96 孔酶标板上,并用辣根过氧化物酶标记单抗,建立双抗夹心ELISA体系;检测模拟污染肉样中沙门氏菌,其检测限为800 CFU/g;并与其他血清型沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌均无交叉反应,特异性良好。     

生物胺荧光响应膜在肉及肉制品新鲜度检测中的应用研究进展

肉和肉制品的新鲜度可以通过产品腐败过程中产生的代谢物含量进行评价。生物胺是肉及肉制品腐败过程中产生的物质之一,是监测食品新鲜度的重要指标。生物胺的传统检测方法繁琐、耗时、费力。建立快速、便捷的检测方法具有重要的现实意义和科研价值。生物胺荧光响应膜是一种由荧光材料与传感薄膜组成的固体光学传感器,能够通过传感薄膜的荧光颜色变化对生物胺进行实时检测,近年来因其灵敏度高、成本低、操作简单、响应速度快等优点被广泛应用于肉及肉制品中新鲜度的检测。本文简要概述肉及肉制品中生物胺的形成与分类以及生物胺对人体的危害,重点综述基于不同荧光响应原理构建的荧光响应膜在肉及肉制品新鲜度监测中的应用。     

固相微萃取与气质联用法分析鱼肉中气味成分

本文采用固相微萃取技术萃取鱼肉中的挥发性成分,并通过气相色谱质谱联用法来分析、鉴定鱼肉中的气味成分。经NIST质谱数据库检索和文献对照,共检出25种成分,确定20种成分,其中以羰基化合物和醇类为主。相对含量比较多的有1-辛烯-3醇、2,5-辛二酮、2,4-己二烯醇、2-壬烯醇等。