毕赤酵母高效表达外源蛋白的分子水平策略

毕赤酵母表达系统具有许多优异特性,并且是目前最成功的外源蛋白表达系统之一。通过近几十年的快速发展,该系统已引起各界的广泛关注,并产生了巨大的经济和社会价值。与其他现有表达系统相比,毕赤酵母在目的蛋白翻译后修饰上有着极大优势,已被广泛应用于表达外源蛋白。但是另一方面,由于该系统受包括外源基因的特性、菌种、表达环境和发酵技术等多种因素的影响,,其在不同外源蛋白的表达上也表现出很大差异。该文着眼于分子水平上的基因转录、蛋白质加工、蛋白质降解以及转运分泌4个模块,介绍了利用毕赤酵母表达系统通过优化密码子、高拷贝数外源基因、引导肽筛选、敲除蛋白酶基因、共表达促折叠因子等途径提高外源蛋白表达效率的相关策略,并简要展望了该系统的发展前景,以期为构建高效毕赤酵母细胞工厂提供指导。     

巴斯德毕赤酵母外源蛋白表达研究

经过近二十年的不断发展,巴斯德毕赤酵母表达系统目前已经被广泛的应用于外源基因的表达,并且获得巨大的成功。与其他表达系统相比而言,巴斯德毕赤酵母表达系统对营养物质要求低、基因组结构简单、可进行高密度发酵,这些优点在很大程度上促进外源基因的表达。但是,巴斯德毕赤酵母在外源蛋白表达过程中也存在许多问题,例如只能以甲醇作为唯一碳源、产热量高等,这些因素在一定程度上限制该表达系统的进一步应用。我们对巴斯德毕赤酵母表达系统进行系统的研究与分析,以期为提高外源基因在其中的表达量提供一定的借鉴。     

共表达HAC1基因对重组毕赤酵母分泌表达葡萄糖氧化酶的影响

通过增强不可折叠蛋白质响应(UPR)信号途径以及研究不同培养温度下的影响,来提高重组葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的分泌表达。影响毕赤酵母外源蛋白表达的因素,主要为内质网中的折叠速率以及不可折叠蛋白积累造成的胞内胁迫压力。通过共表达HAC1基因对不可折叠蛋白信号通路进行调控,摇瓶中改造菌株PP-G-HAC1胞外酶活达到161 U/m L,相比于原始重组葡萄糖氧化酶菌株提高了34%。进一步研究不同温度下过量表达HAC1基因对菌株的生长和分泌外源蛋白的影响,菌株PP-G-HAC1在3 L发酵罐中28℃培养,酶活达到1 008 U/m L,胞外重组蛋白质达到14.43 g/L,相比原始菌株在相同条件下提高了3.12倍。     

cp4-epsps基因在毕赤酵母中的表达及鉴定

为建立一种新的外源蛋白安全评估方法,构建转外源基因酵母是关键步骤。本研究以来源于转基因作物的抗除草剂合成酶蛋白CP4-EPSPS为研究模板,首先通过基因优化和化学合成获得cp4-epsps基因,优化后基因密码子适用性指数(CAI)为0.85,GC含量为52%。目的基因克隆至毕赤酵母表达载体p PICZb,经鉴定筛选正确的重组载体p PICZb-EPSPS电击转化至毕赤酵母GS115,cp4-epsps基因通过同源重组方式整合至酵母基因组,PCR扩增酵母基因组筛选得到在正确位点发生同源重组的4株阳性菌株。随后,各阳性菌株分别于28℃、250~300 r/min培养,0.5%甲醇诱导4 d后,提取各组菌株总蛋白,采用SDS-PAGE和western blotting鉴定CP4-EPSPS表达的正确性。CP4-EPSPS单克隆抗体及载体标签C-MYC单克隆抗体的western blotting结果一致显示cp4-epsps基因在毕赤酵母GS115中成功获得表达,大小约50 ku。本实验成功构建了转cp4-epsps基因的毕赤酵母基因工程菌,为下一步开展转基因作物CP4-EPSPS成份的安全评价奠定基础。     

外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是目前应用最为广泛的蛋白表达系统之一,已成功表达了数百种外源蛋白。但不同外源蛋白的表达量差异较大,能够实现工业化生产的蛋白表达体系并不多,如何提高目的蛋白在该系统中的表达量有着重要的理论和现实意义。该文从发酵工艺方面对影响外源蛋白表达的各种因素做了具体阐述,主要包括培养基的选择与优化、发酵过程参数的控制、分泌型蛋白酶的降解抑制以及诱导型毕赤酵母的甲醇流加机制,旨在提高外源蛋白表达量。     

源于 GAP 启动子的毕赤酵母组成型表达系统的研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统是目前应用非常广泛的外源基因真核表达系统。与源于醇氧化酶启动子(pAOX1)的诱导型表达系统相比, 源于三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP)的毕赤酵母组成型表达系统在表达外源蛋白时不需使用甲醇, 表达时间短, 并且在高密度发酵时采用连续发酵模式, 因此成为近年研究的热点。本文分别从pGAP表达载体的构建、碳源、基因拷贝数、信号序列、高密度发酵等方面对该表达系统进行了综述, 以期为其在蛋白生产中的深入研究和应用提供参考。     

源于GAP启动子的毕赤酵母组成型表达系统的研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统是目前应用非常广泛的外源基因真核表达系统。与源于醇氧化酶启动子(pAOX1)的诱导型表达系统相比,源于三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP)的毕赤酵母组成型表达系统在表达外源蛋白时不需使用甲醇,表达时间短,并且在高密度发酵时采用连续发酵模式,因此成为近年研究的热点。本文分别从pGAP表达载体的构建、碳源、基因拷贝数、信号序列、高密度发酵等方面对该表达系统进行了综述,以期为其在蛋白生产中的深入研究和应用提供参考。     

朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶在毕赤酵母GS115中的异源表达

目的构建毕赤酵母基因工程菌,以实现朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶的异源高效表达。方法人工合成朱黄青霉HI-4的α-1,6-葡聚糖酶基因ZHdex,克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,电转入毕赤酵母GS115。甲醇诱导目的蛋白表达。结果成功在毕赤酵母GS115中对ZHdex基因进行表达,SDS-PAGE表明重组毕赤酵母在66×103附近有目的蛋白表达,与理论值一致。在摇瓶水平,甲醇诱导培养120 h后,α-1,6-葡聚糖酶的最高酶活达28.79 U/mL,蛋白质浓度为0.56 mg/mL。结论获得一株重组毕赤酵母GS115-ZHdex,其产物具备α-1,6-葡聚糖酶活性,成功地实现朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶的异源高效表达。     

低温诱导对毕赤酵母表达重组外源蛋白的影响

毕赤酵母表达系统是近年发展较为突出的表达系统之一.大量研究表明,低温诱导在毕赤酵母发酵过程中对促进细胞物质及能量代谢,提高胞内醇氧化酶活力及能量水平,降低细胞死亡率及蛋白酶作用有明显影响;此外,外源蛋白表达过程中的聚集与降解作用也与诱导温度有关.该文从诱导温度角度对重组毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展进行了综述.     

阶段控温提高透明质酸酶在毕赤酵母中的表达

透明质酸酶(Hyalurondiase,HAase)是一种具有医药作用的水解酶,为了提高HAase在重组毕赤酵母中的分泌表达量,对重组毕赤酵母诱导阶段的温度进行了优化。研究发现,降低诱导温度可以提高HAase的产量,其中两阶段控制温度诱导策略效果最为显著。诱导阶段0~60 h温度控制在25℃,60~96 h温度控制在22℃,HAase酶活最高为1.18×106U/m L,是诱导温度为30℃时(4.53×105 U/m L)的2.6倍。此外,采用两阶段控制温度诱导策略有利于细胞活性的提高和AOX1启动子的表达。两阶段控制温度诱导策略还可以应用到其他酵母表型中,为毕赤酵母高效表达外源蛋白质提供一种新思路。     

基于组合优化策略在毕赤酵母中高效表达杜邦嗜热菌脂肪酶北大核心CSCD

杜邦嗜热菌脂肪酶(LIP1)是一种在洗涤行业、生物柴油制备、油脂改性等领域具有良好应用潜力的碱性脂肪酶,然而其天然产量极低,难以满足产业化需求。采用组合优化策略筛选出高效表达LIP1的毕赤酵母重组菌株。首先,构建毕赤酵母密码子偏好性优化的LIP1基因,通过高浓度G418抗性平板和BMMY-罗丹明B定性平板筛选出脂肪酶活性较高的重组菌株;其次,利用信号肽优化和分子伴侣共表达优化筛选得到一株高效表达的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1,采用碱滴定法测定其酶活,采用比色法测定其底物特异性。结果表明,经组合优化策略筛选出的菌株在摇瓶和5 L发酵罐中发酵最高分泌酶活分别达到1 136 U/mL和12 150 U/mL。底物特异性结果显示重组脂肪酶LIP1最适底物为C8链长的对硝基苯酚酯。综上所述,基于组合优化策略实现了LIP1在毕赤酵母中的高效表达,为未来LIP1的产业化奠定基础。     

一种通过过表达毕赤酵母翻译相关因子提高重组蛋白胞内表达的策略

本研究为筛选对毕赤酵母重组蛋白表达有促进作用的翻译相关因子,扩增了毕赤酵母中包括核糖体蛋白翻译起始因子、翻译延伸因子、氨酰-tRNA合成酶、核糖体生物合成因子、核糖体分子伴侣五类翻译相关因子(共28个)的基因片段,并将上述基因片段与质粒pPICZA进行同源重组,进一步获得重组载体后分别转化至以增强型绿色荧光蛋白eGFP为报告蛋白的毕赤酵母中。之后通过测量计算120h内28个过表达翻译相关因子菌株的荧光蛋白表达量,筛选对毕赤酵母重组蛋白表达有潜在促进作用的因子,进一步以红色荧光蛋白mRFP为报告蛋白进行验证。结果表明:本研究共筛选到了6个对毕赤酵母重组蛋白胞内表达有促进作用的翻译相关因子eIF4A、eEF1A、eEF3、Ded81、Bcy1、Ssb。其中eIF4A、eEF1A、eEF3、Ded81、Bcy1、Ssb的eGFP单位菌体表达量分别增加了18.40%、18.80%、29.50%、28.45%、21.60%,mRFP单位菌体表达量分别增加了20.00%、8.00%、19.00%、5.40%、15.40%。Bcy1使得eGFP表达菌株生物量增加20.00%,mRFP表达菌株生物量增加30.90%。为从翻译层面提高毕赤酵母重组蛋白表达提供了思路。     

Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system

The Pichia pastoris expression system is being used successfully for the production of various recombinant heterologous proteins. Recent developments with respect to the Pichia expression system have had an impact on not only the expression levels that can be achieved, but also the bioactivity of various heterologous proteins. We review here some of these recent developments, as well as strategies for reducing proteolytic degradation of the expressed recombinant protein at cultivation, cellular and protein levels. The problems associated with post-translational modifications performed on recombinant proteins by P. pastoris are discussed, including the effects on bioactivity and function of these proteins, and some engineering strategies for minimizing unwanted glycosylations. We pay particular attention to the importance of optimizing the physicochemical environment for efficient and maximal recombinant protein production in bioreactors and the role of process control in optimizing protein production is reviewed. Finally, future aspects of the use of the P. pastoris expression system are discussed with regard to the production of complex membrane proteins, such as G protein-coupled receptors, and the industrial and clinical importance of these proteins.     

The effect of ethanol and acetate on protein expression in Pichia pastoris

Pichia pastoris is an excellent host for high-level heterologous gene expression, but there is still much interest in improving the productivity of recombinant protein production. P. pastoris produces a small amount of ethanol as a by-product during the glycerol fed-batch phase and the mixed-feed induction phase (glycerol-methanol) of high cell density fermentations, regardless of the phenotype (Mut+, Mut(s), or Mut-). We have nvestigated ethanol repression of the AOX1 promoter using strains, GS115 (Mut+) and MC100-3 (Mut-), expressing an AOX1-lacZ fusion. The addition of 10 mg l(-1) ethanol at the start of methanol induction delayed beta-galactosidase production and methanol utilization for four hours in shake flask experiments. When ethanol and acetate were added together, all of the ethanol was converted to acetate, which also represses the AOX1 promoter. The effects of ethanol and acetate on protein expression in P. pastoris at shake flask and fermentor conditions are discussed.     

基于自联想神经网络的毕赤酵母发酵过程两阶段故障诊断

在毕赤酵母表达人血清白蛋白-人白介素-2融合蛋白(IL-2-HSA)过程中,诱导期甲醇浓度和pH值直接影响了IL-2-HSA表达量的高低和发酵过程的稳定。为了准确有效的控制这两个参数,本论文基于毕赤酵母诱导期的生理学特性和过程参数特征,提出了基于自联想神经网络的毕赤酵母表达IL-2-HSA过程的诱导期两阶段故障诊断。研究结果表明该诊断系统能够在线快速准确地诊断出毕赤酵母诱导期的各种故障。当系统提示出现故障时,离线分析,对比最优的pH值和甲醇质量浓度变化曲线,确定故障类型,采取相应措施。     

有机磷农药降解酶基因Oph2的克隆及甲基对硫磷降解效果研究

摘要：目的 挖掘可高效表达农残降解酶的基因,并构建含有该表达基因的工程菌,以此提供一种高效去除有机磷农残的新方法。方法 利用基因克隆获得高效表达农残降解酶基因Oph2,采用基因工程手段将其转化至毕赤酵母表达系统,对毕赤酵母的发酵产物进行SDS-PAGE定性研究和酶活定量研究,最后通过与目标底物甲基对硫磷反应,分析工程菌表达降解酶对有机磷农残的去除效果。结果 本研究成功克隆得到了高效表达有机磷降解酶基因Oph2,基因全长1000bp,编码256个氨基酸,酶蛋白分子量为37KD,并利用表达载体pPIC9K成功将其转化至毕赤酵母GS115。构建的工程菌GS115-pPIC9K-Oph2表达有机磷降解酶活性为11.57 U/mL,对6.8 mg/L的甲基对硫磷降解效率为90%以上。结论 本研究得到的工程菌GS115-pPIC9K-Oph2可高效表达有机磷降解酶,该酶活性高,对有机磷农残降解能力强,可有效应用于有机磷农残的降解。     

棘孢青霉右旋糖酐酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

以右旋糖酐酶产生菌棘孢青霉F1001基因组为模板反转录合成右旋糖酐酶的cDNA（dex）,基因全长1 866 bp,根据毕赤酵母密码子偏好性优化dex序列获得优化右旋糖酐酶基因（opt-dex）,分别构建dex-pPICZαA和opt-dex-pPICZαA重组质粒,电击转入毕赤酵母X33中构建重组子。通过蓝色右旋糖酐T-2000平板以及摇瓶发酵筛选获得产右旋糖酐酶的重组酵母菌株。重组酶的酶学性质分析显示,重组酶分子质量65?kDa、最适pH?5.0、最适温度35?℃,专一作用于α-1,6糖苷键。在摇瓶水平上对重组毕赤酵母表达条件进行优化,优化培养条件为培养温度25?℃、初始pH?5.0、每24?h甲醇添加量1%（体积分数）、每24?h山梨醇添加量5?g/L、吐温-80添加量4?g/L、摇瓶装液量50?mL/500?mL锥形瓶,优化后的重组右旋糖酐酶分泌表达酶活力提高到240.74?U/mL。重组酵母X33是一株适合外源表达棘孢青霉右旋糖酐酶基因的工程菌,该重组酶可替代棘孢青霉右旋糖酐酶直接应用于工业生产催化制备右旋糖酐。     

粗糙脉孢菌漆酶基因的克隆及在毕赤酵母中的初步表达

采用连续延伸PCR方法克隆到粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）漆酶基因，并将其克隆到表达载体pPIC9k，重组质粒经线性化、电激转化Pichia pastoris KM71，部分阳性克隆的PCR结果表明：漆酶基因已整合到巴斯德毕赤酵母染色体上，重组菌经甲醇诱导后3～5d产漆酶量最高，为2-3U／mL。