高产人参发根系的建立及发根中皂苷Rb1的分离纯化

利用发根农杆菌A4菌株在2年生人参根外植体上直接诱导产生人参发根。对16个人参发根系比生长速率及人参总皂苷含量进行测定,得到3个具有较高比生长速率和人参皂苷含量的发根系。其中发根系R9923具有最高的比生长速率,在连续培养4周后生长量比最初提高了28.8倍。研究R9923发根系的生长曲线和皂苷含量变化规律发现,随着发根生物量的增加,发根中皂苷含量积累得也越多。利用HPLC法测定了R9923发根系中单体皂苷Rg1、Re、Rb1的含量。生长4周的人参发根总皂苷含量达15.2 mg/g,其中人参皂苷Rb1的含量为68.3%,比3年生栽培人参中Rb1含量高1.3倍,可以用于大规模培养。用硅胶柱层析法从人参发根总皂苷中分离提纯人参皂苷Rb1,当洗脱剂中氯仿∶甲醇=7.5∶2.5(体积比)时洗脱效果较好。用硅胶柱法提取的皂苷Rb1纯度为89.95%,得率为72.7%。     

RP-HPLC测定人参茎叶总皂苷及不同部位浸膏中Rb_3的质量分数

采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定人参不同部位浸膏及人参茎叶总皂苷中人参皂苷Rb3的质量分数。色谱柱,Nava-Pak-C18(3.9mm×150mm,4μm);流动相,V(甲醇)∶V(水)∶V(磷酸)=65∶35∶1;检测波长,203nm;体积流量,1.0mL/min;采用外标法测定人参皂苷Rb3质量分数。结果表明,人参皂苷Rb3在0.8～20.0μg呈良好的线性关系(R=0.999 9),平均加样回收率为100.3%。     

3种人参中的皂苷的组成

研究了市销人参、西洋参和三七参根部中总皂苷的含量及组成。采用正丁醇萃取法提取总皂苷发现:总皂苷在人参主根、须根中的质量分数分别为4.0%、6.1%;在西洋参主根、须根中的质量分数分别为4.1%、6.3%;在三七参主根、须根中的质量分数分别为8.2%、1.7%。人参、西洋参须根中总皂苷的质量分数均高于主根,是其1.5倍;而三七参主根中总皂苷的质量分数高于须根,是其3倍。TLC和HPLC检测结果表明,人参中各种皂苷的质量分数差别不大,主根、须根的w(PPD)/w(PPT)分别为37∶58、66∶33,人参中含有特征皂苷Rf,其质量分数为5%~8%,人参中还含有微量R1。西洋参中Re、Rb1含量较高,占总皂苷的40%~50%,主根、须根的w(PPD)/w(PPT)分别为50∶43、58∶39,西洋参中不含有R1和Rf皂苷。三七参中Rg1、Rb1的质量分数较高,占总皂苷的70%,其主根、须根总皂苷组成相似,三七参中含有特征皂苷R1,其质量分数为9%~11%。     

金铁锁毛状根悬浮培养动力学

通过测定金铁锁毛状根在不同培养阶段的生物量、皂苷含量以及培养基中碳源、氮源、磷源的消耗,研究悬浮培养毛状根的生长、营养消耗与次级代谢产物积累之间的规律。结果表明,金铁锁毛状根悬浮培养周期约为32d,生物量和皂苷质量分数分别达到12.33g/L(DW)和0.97%;毛状根生长与皂苷积累关系为半生长偶联型,分别在22和30d达到峰值0.36g/(L·d)和1.00mg/(L·d)。在培养的第22天,培养基中碳源和磷源的质量浓度最低,毛状根的生物量则达到最大值;氮源在毛状根生长处于静止期时(0~4d)迅速消耗,至20d(对数生长期)时消耗完毕。结果提示,通过补料方式可以延长毛状根悬浮培养的生长周期。     

金铁锁多倍体毛状根的诱导及性质

研究了秋水仙素对金铁锁毛状根多倍化、多倍化后毛状根生长和皂苷积累的变化。结果表明,秋水仙素对金铁锁毛状根的作用效果具有浓度和时间依赖性,其中,经1.25mmol/L的秋水仙素处理24h的金铁锁毛状根根尖存活率最高,达到60%;加倍后细胞核体积明显增加,侧根分支比普通毛状根多,根毛密度也比普通毛状根大。培养35d后的生物量是普通毛状根的1.48倍(干重);多倍体毛状根和普通毛状根在皂苷质量分数方面差别不大,但在同等培养条件下,多倍体毛状根的皂苷总产量较高,达到普通毛状根的1.45倍。结果提示,染色体多倍化是一种提高毛状根质量和皂苷产量的潜在重要技术。     

GS0202菌产人参皂苷-β-葡萄糖苷酶条件及其酶的反应条件

为提高Arthrobacter chlorophenolicus GS0202菌所产人参皂苷-β-葡萄糖苷酶水解人参皂苷Rb1生成人参皂苷Rg3的能力,采用单因素研究方法,对菌体发酵条件,及其所产酶的酶反应条件进行了研究。结果表明,菌体发酵的最适培养基组成为胰蛋白胨10 g,酵母粉5 g,氯化钠10 g,水1 L;诱导物为人参总皂苷,其加入量为3.2 mg/mL,培养温度为28℃;酶反应的最适条件为25℃,pH 4,底物质量浓度为3 mg/mL。     

Arthrobacter sp.3胞外酶转化人参二醇类皂苷生成Rg_3的反应条件

人参稀有皂苷Rg3是具有较高抗癌活性的人参皂苷单体,但在人参中的含量极低。采用新筛选的细菌Arthrobacter sp.3产胞外酶转化人参二醇类皂苷(PPD)生成人参皂苷Rg3,为大量制备人参皂苷Rg3提供了方法。实验结果表明,该细菌产生的人参皂苷酶为胞外酶,通过薄层层析法(TLC)分析得到,最佳发酵诱导物为0.1 mg/mL的PPD,最适反应条件为反应温度40℃、反应时间24 h、底物质量浓度0.1 mg/mL。经HPLC检测,在此条件下反应,产物中Rg3的质量分数为21%。     

两种林下参各部位皂苷的组成成分

对两种林下参的芦头、主根、须根等各部位皂苷组成与分布进行研究。利用正丁醇萃取法提取总皂苷,桓仁产的15年林下参的芦头、主根、须根的总皂苷质量分数分别为7.68%、3.47%、6.48%;抚松产的25年林下参的芦头、主根、须根的总皂苷质量分数分别为6.67%、2.88%、4.93%;两种林下参芦头中总皂苷质量分数是主根总皂苷质量分数的2倍。经TLC和HPLC检测,25年林下参芦头与主根中Rb1、Rg1、Re质量分数较高,分别占总皂苷的54%、52%,须根中Rb1、Rc、Rg1、Re质量分数较高,占总皂苷的52%;15年林下参芦头中Rb1、Rg1、Re质量分数较高,占总皂苷的48%,主根和须根中Re、Rb1、Rc质量分数较高,分别占总皂苷的40%、45%。从两种林下参中检测到8种高活性稀有皂苷20(S)-Rg2、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、20(R)-Rg3、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2、Rh3。林下参各部位中人参主要皂苷及主根中稀有皂苷的质量分数,随生长年限增加而增加,但芦头和须根中稀有皂苷含量,随生长年限增加而减少。     

人参皂苷Rf的分离提纯

以人参根须为原料,采用甲醇浸提法提取人参根须中总皂苷,再用硅胶柱层析法对总皂苷进行分离,得到较纯净的人参皂苷单体Rf.结果表明,500 g人参根须中提取得到总皂苷20.5 g,提取率为4.10%.总皂苷中主要含Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd等成分.20.5 g人参根须总皂苷经硅胶柱层析法分离,得到较纯人...     

GS0202菌产人参皂苷-β-葡萄糖苷酶条件及其酶的反应条件

为提高Arthrobacter chlorophenolicus GS0202菌所产人参皂苷-β-葡萄糖苷酶水解人参皂苷Rb1生成人参皂苷Rg3的能力,采用单因素研究方法,对菌体发酵条件,及其所产酶的酶反应条件进行了研究.结果表明,菌体发酵的最适培养基组成为胰蛋白胨10 g,酵母粉 5 g,氯化钠10 g,水1 L;诱导物为人参总皂苷,其加入量为3.2 mg/mL,培养温度为28 ℃;酶反应的最适条件为25 ℃,pH 4,底物质量浓度为3 mg/mL.     

移山参、园参各部位中皂苷组成和比例的研究

研究了移山参、园参不同部位中的皂苷成分及比例关系。结果表明,移山参、园参中须根总皂苷含量最高,芦头其次,主根最低.移山参芦头、主根、须根总皂苷含量分别为9.30%、3.38%、16.63%;园参分别为7.50%、2.06%、8.64%.高效液相色谱测定结果显示,移山参各部位中人参皂苷Re含量最高,并检测出含有C-K、Rh1和Rh2等人参稀有皂苷;园参中Rb类皂苷含量最高.     

移山参、园参各部位中皂苷组成和比例的研究

研究了移山参、园参不同部位中的皂苷成分及比例关系。结果表明，移山参、园参中须根总皂苷含量最高，芦头其次，主根最低．移山参芦头、主根、须根总皂苷含量分别为9．30％、3．38％、16．63％；园参分别为7．50％、2．06％、8．64％．高效液相色谱测定结果显示，移山参各部位中人参皂苷Re含量最高，并检测出含有C-K、Rh1和Rh2等人参稀有皂苷；园参中Rb类皂苷含量最高．     

敦化人参各部位皂苷组分的比较

采用薄层层析、高效液相色谱检测等方法,对敦化产四年白参参头、主根和须根部位皂苷的组成和含量进行测定.研究结果表明,白参各部位中皂苷组成区别不大,参头、主根和须根部位中均含有原人参二醇型皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rd和原人参三醇型皂苷Rg1、Re、Rf,其中人参参头部位皂苷含量最高,须根部分次之,主根部分最低.总皂苷质量...     

外源激素对黄芩毛状根生长及黄芩苷合成的影响

考察了外源激素对黄芩毛状根生长和黄芩苷生物合成的影响．在1／2MS培养基中添加NAA、6-BA和2,4-D,与黄芩毛状根共培养,采用HPLC法测黄芩苷含量．实验结果表明,NAA可同时促进毛状根的生长和黄芩苷合成,培养基中添加0．4mg／LNAA可使黄芩苷产量提高25．74％;6-BA对黄芩苷合成具有明显的促进作用,其质量浓度为0．2mg／L时,黄芩苷产量比对照提高了24．75％,但对毛状根的生长有抑制作用;2,4-D则完全抑制毛状根生长．本研究为进一步筛选适宜的黄芩毛状根培养系统并调控次生代谢产物的研究奠定了基础．     

抑制齐墩果烷型人参皂苷合成支路对达玛烷型人参皂苷生产能力的影响

表达反义βAS的5个人参发根系在液体培养条件下生长30天后,齐墩果烷型人参皂苷R0含量比对照实验组均有所降低,幅度分别达13%～40%;达玛烷型人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf和Rg1含量在5个发根系中均有所增加,其中发根系A19的上述单体皂苷含量总和比对照实验组提高了30%;培养过程中达玛烷型人参皂苷含量呈逐渐增加趋势。5个发根系的βAS酶活性比对照实验组均有所下降,最多下降30%,DAS酶活性被上调,尤其发根系A19的酶活性比对照实验组提高了20%;化学分析结果显示,5个发根系人参皂苷前体物2,3-氧化角鲨烯的含量比对照实验组均有所提高。     

乳酸菌对人参皂苷Rb1的生物转化研究

从酸奶、酸菜汁、辣白菜、水果中分离得到5种乳酸菌(L1-L5),并利用分离得到的乳酸菌进行人参皂苷Rb1的生物转化.结果表明,除了菌株L2外,其他4种乳酸菌均能将人参皂苷Rb1转化为稀有人参皂苷F2或C-K.经鉴定,菌株L1为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum),菌株L5为植物乳球菌(Lactococcus plantarum),其他3种均为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum).     

酶法生产稀有人参皂甙及其产物成分的分析

通过实验研究从人参提取人参皂甙 ,用硅胶柱法分离人参二醇类皂甙。酶法改变人参二醇皂甙糖基 ,生产稀有人参皂甙 ,并分离提纯了其酶反应产物。结果表明 :酶反应产物中主要成分为人参皂甙Rh2 ,副产物为人参皂甙Rg3、Rg5、Rh1、Rh3、人参二醇类皂甙元 ;经硅胶柱分离酶解产物得到单体。也探讨了酶法产生各种稀有人参皂甙的机理 ,二醇类皂甙失去第 2 0碳上的糖基时 ,也会失去水分子 :Rh2生成的同时Rh2失去水分子变成Rh3皂甙 ;Rg3生成的同时 ,Rg3失去水分子变成Rg5皂甙