陕西烟草青枯病的病原鉴定

2013年7月在陕西省西乡县韩岭村烟田首次发现疑似烟草青枯病病株,为了解陕西烟草青枯病的发生危害,对陕西省不同烟区的烟草青枯病的发生情况进行全面系统调查,并对田间采集的具有典型青枯病病症的烟草茎部样本进行了病原鉴定。结果表明:陕西省烟草青枯病发生区域为陕南的汉中、安康和商洛的三个种烟区,在延安、宝鸡和咸阳的三个烟区尚未发现,发病于6月上旬,盛发于7月中旬。该病害随温度升高而病情加剧,发病早期田块死苗严重,发病率可高达24.67%,而且有蔓延扩展趋势;通过对烟草茎秆上分离的病原细菌进行形态观察、致病性测定、生理生化性状等常规细菌鉴定技术,结合细菌16S rDNA序列分析,鉴定该病原菌为青枯劳尔氏菌Ralatonia solanacearum。      

豫南烟区烟草青枯病危害调查及病原鉴定

2014年从豫南烟区信阳市罗山县、驻马店市确山县和遂平县共采集25个疑似青枯病烟草病样和10份病土,分离纯化出菌株26个,测序所得的序列与NCBI数据库中的Ralstonia solanacearum基因组序列进行Blast比对,相似度达到98%以上,对分离鉴定得到的烟草青枯病菌进行回接试验,表现出典型的青枯病症状,发病组织在TTC培养基上也同样分离得到典型的青枯菌菌落,证实病原为烟草青枯病病原。由此表明,豫南烟区确有烟草青枯病的发生。     

烟草种质资源抗青枯病筛选鉴定

参试260份烟草品种对青枯病抗性先做自然病圃初筛鉴定,从中选取表现R-LR和部份优质感病品种共n3份分菌系接种测定.结果表明,对青枯病Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型菌系反应R-LR的抗病品种有G3、反帝3号和G6等3份,这是迄今所发现抗病谱广且能抗强菌系的种质资源;抗Ⅰ、Ⅱ型菌反应R-MR,感Ⅲ型菌的品种有SPG117、OX2028和岩烟97等12份;抗Ⅰ型菌反应R-MR,感Ⅱ、Ⅲ型菌的品种有K326、K346、G80、RGll和Coker176等50份;对Ⅰ型菌反应为MS-HS的感病品种有中烟15、云烟87、春雷3号、大叶密目、大黄金和革新3号等195份,包括目前生产上的主栽品种NC89、云烟85、翠碧一号和红花大金元等.     

烟草种质抗青枯病鉴定及其抗性分类

分别于2008年、2009年在安徽省皖南烟区烟草青枯病病圃,选择国内外文献中标注为抗青枯病的部分烟草种质及安徽省尚未鉴定抗性的地方种质共138份,田间采用高密度栽培方式、随机区组设计,鉴定其青枯病抗性。结果表明:(1)以感病对照长脖黄病情指数达到100时的抗性进行划分评价,部分烟草种质的抗性与文献标注的抗性表现有差异;本试验中没有免疫烟草种质;Coker298、K346、NC86、Coker86、K399、LMAFC34、歙圆四号为高抗品种;G28等13份种质为中抗品种;其它种质在中感以上。(2)依据大田病情指数变化对烟草种质抗性分为四类:感病型、慢病型、抗病型及免疫型,并对其进行数据规范;分类结果表明免疫型种质0份,抗病型种质3份为Coker298、NC86、歙圆四号,慢病型种质有DB101等16份;其它为感病种质。     

广东省烟区烟草花叶病主要病原鉴定

为明确广东省烟草病毒病种类及其主要侵染病原,对广东2个主要烟区(韶关地区和梅州地区)进行了病毒病害调查,并对采自田间的62个花叶病样本,通过鉴别寄主、ELISA和RT-PCR法进行了病原种类鉴定。结果表明:在上述2个主要烟区,主要是花叶病危害,很少发现其他病毒种类;病原鉴定方面,在62个花叶病样本中,61.29%为单TMV侵染,20.97%为单CMV侵染,17.74%为TMV和CMV复合侵染。     

烟草内生青枯病拮抗细菌的筛选和初步鉴定

为了获得防治烟草青枯病新途径,从湖南桂阳烟草青枯病重病区采集的健株上,共分离到内生菌株160个。经对峙培养法测定,32个菌株对烟草青枯菌有拮抗作用,其中H-1、H-9和H-11有强拮抗作用,抑菌圈分别为3.0、3.0、4.5 mm。根据其形态特征和生理生化性状,初步鉴定内生菌H-1为枯草芽孢杆菌,H-9和H-11为短芽孢杆菌。     

烟草品种抗青枯病鉴定中的相关因素分析

采用烟草青枯病ｔ菌株对Ｋ７３０、红花大金元等品种分别作不同接种方法、不同菌量、不同重复和不同生育期接种试验以及与黄瓜花叶病（ＣＭＶ）交叉接种试验。结果表明，对烟草青枯病的抗性，烟草旺长初期发根灌妆种与病区田间自然鉴定结果之间呈极显著正相关，接种浓度以１０＾８ｃｆｕ／ｍｌ为宜。不同抗感品种在田间没重复鉴定中均表现不同程度的抗幅波动，但有一个相对稳定的抗性水平。根据不同生育期与ｔｌ菌株的相互作用，参试     

烟草青枯病发生与防治研究

烟草青枯病发生危害与品种、耕作类型、栽培管理、地形地势等有密切关系。试验证明，９０％乙霜青可溶性粉剂防治烟草青枯病效果显著，优于１０００万单位硫酸链霉素，其防治效果可达８０％以上。     

一种快速有效鉴定烟草苗期青枯病抗性的水培接种法

为探寻一种快速有效的烟草青枯病苗期抗性鉴定方法,以红花大金元、青梗、长脖黄和D101等4个烟草品种为材料,在水培条件下采用伤根和不伤根法进行青枯菌侵染接种,依据病情指数进行抗病性鉴定。结果显示,水培条件下采用伤根和不伤根接种法,接种后7～10 d便可判断出各品种的抗性,结果为D101中抗、长脖黄高感、红花大金元高感或感病、青梗感病,与传统盆栽伤根灌菌接种法的评价结果基本一致,而盆栽伤根灌菌接种法则需3～4周。本研究建立的水培接种法可快速、高效准确鉴定和评价烟草苗期青枯病抗性。     

湖北恩施烟区烟草青枯菌致病力分析

为有效进行恩施烟区烟草青枯病的防控,本研究采用人工接种的方法鉴定了恩施烟区烟草青枯菌的致病性。根据红花大金元、K326和岩烟97三个烟草品种病害流行下曲线面积(AUDPC)数值进行聚类分析,将恩施地区烟草青枯菌划分为强、中、弱3种致病型,表明恩施烟草青枯菌是一个由弱到强连续变化的群体。3种致病型菌株在恩施南部和北部区域均有分布,其中恩施北部区域菌株致病力稍高于南部。     

湖北地区烟草青枯菌系统发育分析

本研究采用青枯菌演化型分类框架,对来源于湖北烟区的48个烟草青枯菌进行系统发育学分析并进行序列变种鉴定,以明确该地区烟草青枯菌的菌系分化。基于青枯菌内切葡聚糖酶基因(egl)和DNA蛋白修复基因(mutS)的系统发育学分析结果表明,48个供试菌株属于青枯菌亚洲分支(演化型Ⅰ)的3个序列变种,分别为序列变种15、17和44,未发现我国已报道的烟草青枯菌序列变种34。其中序列变种17和44为优势菌系,且均来源于恩施地区;序列变种15只包含来源于十堰地区的3个菌株。本研究表明湖北地区烟草上的青枯菌存在一定程度的遗传分化。     

拮抗烟草青枯病菌的内生细菌筛选、鉴定及定殖研究

从不同烟草品种的根茎叶组织中大量分离内生细菌,通过平板拮抗试验方法,筛选出拮抗青枯菌的内生细菌菌株16个。从中选择B7、H4-2、C3、DR8、D3、B8、33共7个拮抗菌,进行16S rDNA鉴定,并构建系统发育进化树,结果表明:H4-2、C3、DR8、B8、33与芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株亲缘关系最近。利用B8菌株的抗链霉素菌株B8-5,研究其在土壤和烟草植株根、茎、叶中的定殖能力及其对烟草青枯病的防治效果。结果表明,B8-5可定殖于烟草根表土壤和体内,具有良好的宿主体内定殖与传导能力,田间对烟草青枯病的防治效果达66.64%。     

重庆地区烟草青枯病菌的生物型测定

从重庆市黔江区、酉阳县、武隆县烟田采集的烟草青枯病典型病株中,分离获得了44个菌株,进行了鞭毛染色和致病性测定,并进一步研究了菌株对双糖和己醇的利用能力以及对硝酸盐的还原作用、产气情况。结果显示:44个菌株的菌体形态均与青枯病菌菌体形态一致,且均具有致病性;这些菌株均属于生物型Ⅲ,无亚型及其它生物型。     

白肋烟栽培土壤中青枯病菌的鉴定与生化型分析

为建立一套成本低廉、简单快速的分离检测土壤青枯病菌的方法,采用半选择性培养基(PCCG)和PCR技术相结合,从白肋烟栽培土壤中分离鉴定出12个菌株,并分析了这12个菌株的ITS序列 .结果表明:分离出的12个菌株ITS序列与青枯病菌同源性最高,达到92.6％,该方法适合于土壤中青枯病菌的分离鉴定.Hayward的青枯病菌生化型鉴定结果表明,这12个菌株均为生化型Ⅲ.     

不同条件对烟草青枯雷尔氏菌生长的影响

青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）是烟草青枯病的病原菌。为有效防治青枯病,研究了不同培养条件对青枯雷尔氏菌生长的影响;并测定了在不同pH、温度以及在培养基中添加不同浓度的N、P、K、Zn²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、HCO₃^-、SO₄^2-对青枯雷尔氏菌生长的影响。结果表明,青枯雷尔氏菌在偏酸和偏碱条件下生长较好,青枯雷尔氏菌最适生长温度为25~45 ℃;高浓度的Zn²⁺和Cu²⁺能够有效抑制青枯雷尔氏菌的生长,其他因素对青枯雷尔氏菌的生长无明显作用。     

湖北恩施地区烟草青枯菌的生理分化研究

本研究对湖北恩施烟区青枯病菌（Ralstonia solanacearum）的生理小种、生化型和演化型进行了鉴定,为湖北省烟草青枯病抗性品种的选育和利用提供了理论依据。从湖北恩施地区的8个县（市）采集青枯病感病烟株,通过平板稀释分离和特性性引物检测从中分离鉴定到54个具有致病性的烟草青枯菌菌株。采用注茎接种法将供试菌株分别接种青枯菌6个鉴别寄主,确定所有的菌株均属于生理小种1;基于青枯菌对3种双糖和3种己醇利用能力的检测结果,将54个菌株鉴定为生化型Ⅲ;经青枯菌演化型PCR检测,54个菌株均能扩增得到片段大小分别为280 bp和144 bp的两条特异性条带,这说明全部分离菌株均属于青枯菌演化型Ⅰ型。     

我国主要烟草青枯病病圃青枯菌系统发育分析

为探究我国主要植烟区烟草青枯病鉴定病圃中青枯菌的系统发育,采用演化型分类框架下的序列变种分类方法,对从各烟株和土壤样品中分离得到的100株青枯菌进行系统发育分析。结果表明,所有菌株可归为4个分支,分别为序列变种15、17、34、54。其中,云南文山州广南县病圃中的菌株为序列变种17和54,福建泰宁县的菌株为序列变种34,福建三明市三元区的菌株为序列变种15和34,广东白云区的菌株为序列变种15和17,广东南雄市的菌株为序列变种15、17和34,安徽宣城市宣州区的菌株为序列变种34和54,贵州福泉的菌株为序列变种17,重庆彭水的菌株为序列变种17。本研究发现同一病圃中存在多个序列变种,某些病圃同一地块中烟株与土壤分离所得菌株序列变种不一致。     

基于致病基因靶点的PCR法特异性检测土壤青枯菌

利用分子生物学手段,以R.solanacearum染色体上的16S rDNA ITS以及毒性质粒携带的致病性相关基因fliC为靶点,分别设计5对序列特异性引物,筛选得到了特异性扩增16SrDNA ITS保守序列的引物对RaITS-1/2以及特异性扩增病菌fliC基因片段的引物对RalfliC-F/R.比较这两对引物的扩增灵敏度、稳定性和特异性可以发现,它们均能够稳定、快速、灵敏地检测青枯菌DNA,检测灵敏度可以达到10 fg DNA/μL.在此基础上成功构建了直接检测土壤青枯菌DNA的PCR检测技术体系.