禽传染性支气管炎病毒脂质体核酸疫苗的制备

目的制备禽传染性支气管炎病毒脂质体核酸疫苗,并优化其制备工艺。方法采用逆向蒸发法制备禽传染性支气管炎病毒脂质体核酸疫苗,通过正交试验进行制备条件的优化,用荧光法测定脂质体的包封率。筛选制备高包封率脂质体核酸疫苗的最佳条件,测定脂质体粒径,并对疫苗免疫效果进行检测。结果制备高包封率的禽传染性支气管炎病毒脂质体核酸疫苗的工艺为:卵磷脂、胆固醇的比例为2∶1(摩尔比),转速为150r/min,温度为45℃,包封率可达80.31%。脂质体粒径平均为149nm,脂质体核酸疫苗显著提高了疫苗的免疫效果。结论按本工艺制备的禽传染性支气管炎病毒脂质体核酸疫苗包封率高,脂质体粒径均一,免疫效果良好。     

苄达赖氨酸脂质体的制备

以苄达赖氨酸、大豆卵磷脂、胆固醇为原料制备了苄达赖氨酸脂质体。以包封率为主要指标,选取药脂比、超声时间、水相pH值和孵育温度4个因素进行正交实验优化制备工艺,用紫外分光光度计测定包封率,用粒度和Zeta电位分析仪测定所制备脂质体的粒径分布及Zeta电位。确定最佳制备工艺条件为:药脂比1∶5(g∶g)、超声时间15min、水相pH值5、孵育温度60℃,在该条件下所制得的3批苄达赖氨酸脂质体的平均包封率为81.54%,平均粒径为(99.85±9.60)nm,平均Zeta电位为(-30.6±1.8)mV,体外释放实验证明释放速度慢于市售制剂。表明所制备的苄达赖氨酸脂质体包封率高、稳定性好。     

格列齐特脂质体的制备及质量评价

采用薄膜分散法制备格列齐特脂质体,以粒径和包封率为考核指标,通过单因素实验和正交实验优化制备条件,测定最优条件制备格列齐特脂质体的平均粒径和包封率。确定最优制备条件为:药脂比1∶10(g∶g)、超声时间10min、成膜温度60℃、缓冲液pH值6。所制备脂质体的平均粒径为(108.3±12.4)nm、包封率为(72.19±3.6)%、平均Zeta电位为(-40.8±2.3)mV,且在4℃下保存稳定性好。电镜照片显示,所制备脂质体圆整度好、粒径均一、无粘连。表明采用薄膜分散法制备格列齐特脂质体工艺稳定,质量可控。     

干扰素脂质体的制备及理化性质分析

目的　制备干扰素α2b脂质体 ,分析其理化性质。方法　采用旋转逆相蒸发法制备干扰素α2b脂质体 ,通过正交试验进行制备条件的优选 ,电镜观察其粒径大小 ,酶联免疫分析法测定包封率 ,并观察脂质体的稳定性。结果　干扰素α2b脂质体平均粒径为 98. 6nm ,最高包封率为 78 .2 3% ,脂质体存放于 4℃及 - 2 0℃稳定性良好。结论　本试验方法制备的脂质体包封率高 ,理化性质较稳定。     

竹红菌素脂质体的制备及其包封率测定方法的研究

采用薄膜分散-均质法制备了竹红菌素脂质体,采用TEM观察脂质体形貌,用Zeta电位及粒度分析仪检测脂质体粒径,并选择石油醚萃取法、大孔树脂柱层析法和微柱离心法分别测定竹红菌素脂质体包封率.结果表明,该脂质体呈椭球形,其粒径分布范围为118.2～578.0 nm,平均粒径为261.4 nm;大孔树脂柱层析法最适合该体系包封率的测定,脂质体包封率为42.84％,竹红菌素总回收率为91.28％.     

甘草酸二铵脂质体的处方及制备工艺

采用逆相蒸发法制备甘草酸二铵脂质体,通过均匀设计法优化脂质体处方及制备工艺,利用透射电镜观察其形态,通过HPLC测定脂质体包封率。所制得的甘草酸二铵脂质体形态呈球形,大小较均匀,粒径范围在50~100 nm,包封率36.47%,稳定性佳。     

复方石杉碱甲-虾青素脂质体的制备及评价

采用薄膜分散-探头超声法制备复方石杉碱甲-虾青素脂质体,高效液相色谱法分别测定石杉碱甲、虾青素的含量,葡聚糖凝胶柱色谱法分离脂质体与未包封的游离药,以包封率为指标,采用单因素考察和正交试验法优化脂质体制备工艺,并对其粒径、多分散系数(PDI)和形态进行综合评价。结果显示工艺验证复方脂质体中石杉碱甲平均包封率为65.35%±1.30%,虾青素平均包封率为50.42%±2.77%。粒径(156.22±3.71)nm, PDI为0.24±0.02,脂质体的粒径均一﹑包封率高﹑稳定性良好。     

盐酸伊立替康、二氢杨梅素复方脂质体的制备及其体外释放研究

目的:制备共载化疗药CPT-11及中药成分DMY的复方脂质体,对该脂质体进行质量检测,包括考察其外观形态、粒径分布、包封率、载药量等,并考察复方脂质体的体外释放能力。方法:用乙醇注入法-硫酸铵梯度法制备CPT-11-DMY复方脂质体,根据L9(34)正交试验优化药物处方,并加以验证;用紫外分光光度法测定包封率及载药量;利用动态透析法来分析CPT-11-DMY复方脂质体体外释放趋势。结果:正交实验得到的最优处方制备出的复方脂质体中CPT-11包封率为(82.58±1.48)%,载药量为(4.5±1.3)%,DMY包封率为(71.45±1.03)%,载药量为(5.7±1.1)%;平均粒径为(123.1±1.8)nm,PDI值为0.181,Zeta为(-24.3±0.51)mV;体外释放通过数学参数拟合结果表明,复方脂质体的释药行为符合weibull模型,24h内复方脂质体中CPT-11和DMY的累计释放率分别为(61.45±1.88)%和(72.67±1.07)%。结论:应用乙醇注入法结合硫酸铵梯度法成功制备复方脂质体,采用的方法简单可行,结果可靠,且包封率高。     

脂质体载药性能与卵磷脂的关系

探讨了卵磷脂对脂质体载药性能的影响。用逆相蒸发法制备阿糖胞苷脂质体,通过测定脂质体的包封率、平均粒径和药物渗漏量,考察了蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂及猪脑卵磷脂对脂质体载药性能的影响。实验结果表明,在n(PC)∶n(CHOL)=1∶1的条件下,蛋黄卵磷脂脂质体的平均粒径为2.59μm,包封率为(17.02±0.21)%,在37℃经40 h温育后,平均粒径增加0.53μm,药物渗漏量为(0.18±0.01)mg/h。平均粒径和包封率均高于大豆卵磷脂脂质体及猪脑卵磷脂脂质体,平均粒径增加值低于大豆卵磷脂脂质体及猪脑卵磷脂脂质体,渗漏速度高于猪脑卵磷脂脂质体,但低于大豆卵磷脂脂质体。对比实验证明,蛋黄卵磷脂脂质体的载药性能较好。     

达克替尼玉米醇溶蛋白纳米粒的制备与表征

研究达克替尼玉米醇溶蛋白纳米粒(DAC-ZNPs)最佳制备工艺,并对其制剂学性质进行表征。采用相分离法制备DAC-ZNPs,用正交实验法筛选处方工艺,用HPLC法测定达克替尼的含量,激光粒度仪测定纳米粒的粒径,透射电镜观察纳米粒的外观形态,用超滤法测定包封率。按最优处方工艺制备的DAC-ZNPs为球形粒子,平均粒径为(145±25)nm,粒度分布均匀,DSC结果表明药物是以无定形状态分散于纳米粒中,包封率为90.16%±1.34%,体外24 h累积释放度为52.06%。采用相分离法制备的DAC-ZNPs粒径分布均匀,药物包封率高,具有一定的缓释效果,该制备工艺流程简单、重现性好。     

干扰素脂质体的质量控制研究

目的建立稳定的干扰素脂质体质控体系。方法采用电子显微镜、粒度分析仪、气相色谱仪以及酶标仪等仪器和检测手段,对干扰素脂质体的形态、粒径、包封率、有机物的残留量以及稳定性等进行分析。结果干扰素脂质体透射电镜下观察为圆形,直径50~350nm,粒径呈正态分布,平均粒径为200~210nm,跨距为0.80~1.10,包封率达到90%以上。有机物残留量低于《中国药典》二部(2005版)规定的标准。在2~8℃下保存6个月,渗漏率不高于20%,而总活性基本不变。结论该干扰素脂质体的质控体系的检测项目比较全面,检测结果稳定,可用于产品的质量控制。     

人用狂犬病脂质体疫苗的免疫效果

目的对狂犬病脂质体疫苗进行免疫效果评价。方法用狂犬病脂质体疫苗和无佐剂疫苗分别免疫小鼠,以NIH法检测保护效力,RFFIT法检测中和抗体,流式细胞仪检测淋巴细胞表面标记,体外实验法检测淋巴细胞增殖能力,乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞活性,ELISA检测试剂盒检测免疫后小鼠IL-2和IFN水平。结果狂犬病脂质体疫苗与无佐剂疫苗相比,可提高效力2~3倍,脂质体疫苗组中和抗体水平明显高于无佐剂疫苗组,两组之间差异有显著意义。狂犬病脂质体疫苗可增强细胞免疫,小鼠CD4+/CD8+比例、淋巴细胞增殖指数、NK细胞活性、IL-2及IFN活性与无佐剂疫苗相比,差异均有显著意义。结论狂犬病脂质体疫苗可同时增强细胞免疫和体液免疫。     

白细胞介素-2脂质体的制备及其活性和稳定性的研究

利用逆相蒸发法制备出白细胞介素－2（IL－2）脂质体,其包封率为34．52±1．12％,在电镜下具有典型大单层脂体结构,大小为0．2μm左右。利用“ConA诱导T细胞微量测定法”对其活性进行了测定,结果表明IL－2脂质体,活性提高,稳定性好。     

狂犬病疫苗脂质体冻干粉的免疫原性评价

目的评价狂犬病疫苗脂质体冻干粉的免疫原性。方法将狂犬病疫苗原液稀释至15 IU/mL,制备为稀释液冻干粉(Y1组);将该稀释液冻干粉与脂质体冻干粉按5∶3的体积比混合,制成物理混合物(Y2组);同时采用冻融-冻干法将狂犬病疫苗稀释液和脂质体配制成狂犬病疫苗脂质体冻干粉(Y3组)。将各组疫苗复溶后,分别于0、3、7、14、21 d经小鼠腹腔给药,0. 5 mL/只。MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖能力,流式细胞术检测T淋巴细胞表面标记,ELISA法测定小鼠体液中狂犬病病毒抗体IgG(RV-IgG)浓度。结果与Y1组及Y2组比较,Y3组初次免疫后3 d小鼠脾细胞刺激指数(stimulatingindex,SI)值明显升高(P <0. 01);初次免疫后7、14、21、28 d,CD4^+/CD8^+值明显升高(P <0. 05),初次免疫后7、14、21 d,RV-IgG浓度明显升高(P <0. 05)。结论狂犬病疫苗脂质体冻干粉在小鼠体内具有良好的免疫原性,脂质体能提高疫苗免疫原性,延长疫苗的免疫时间,有望开发成为新一代广泛应用的疫苗佐剂。     

白介素-2佐剂狂犬病疫苗的免疫学效果

目的研究白介素-2佐剂狂犬病疫苗的免疫学效果。方法将人用纯化Vero细胞狂犬病疫苗原液与基因工程白介素-2按一定比例混合,制成白介素-2佐剂狂犬病疫苗,另将疫苗原液加氢氧化铝,制成铝佐剂狂犬病疫苗。将白介素-2佐剂疫苗、氢氧化铝佐剂疫苗和无佐剂疫苗分别于0、7d经腹腔免疫昆明小鼠,0.5ml/只,并在免疫前和免疫后4、6、10、17、2、31、45和59d,眶静脉采血,用快速免疫荧光灶抑制试验检测小鼠血清中和抗体。同时于0、7d经腹腔免疫BALB/c小鼠,0.5ml/只,第15天取脾检测淋巴细胞转化率。结果白介素-2佐剂疫苗与氢氧化铝佐剂疫苗和无佐剂疫苗淋巴细胞转化率差异均有显著意义。与铝佐剂疫苗和无佐剂疫苗相比,白介素-2佐剂疫苗诱导产生中和抗体的时间早,抗体滴度高。结论白介素-2佐剂狂犬病疫苗具有良好的免疫学效果。     

冻干茶多酚脂质体的制备及其质量

目的制备冻干茶多酚脂质体,并进行质量评价。方法采用不同种类及浓度的冻干保护剂制备冻干茶多酚脂质体,检测其包封率和有效粒径,筛选最佳冻干保护剂及其最适浓度,并对冻干茶多酚脂质体的形态、结构、粒径分布、Zeta电位和稳定性等性质进行观察。结果最佳冻干保护剂为15%(w/v)的蔗糖。所制备的冻干茶多酚脂质体再分散性良好;呈圆球形或椭球形,结构为大单室脂质体;有效粒径为(170.4±3.7)nm;Zeta电位为-60.5mV;在4℃条件下稳定性良好。结论已成功制备冻干茶多酚脂质体,其各项质量指标良好。     

狂犬病病毒抗原定量检测方法的建立

目的建立狂犬病病毒抗原的定量检测方法,用于疫苗生产过程中病毒含量的监测。方法用狂犬病病毒aG株免疫豚鼠,制备抗狂犬病病毒多克隆抗体,纯化后以辣根过氧化物酶进行标记。采用双抗体夹心ELISA法建立检测系统。以狂犬病疫苗国家参考品为定量标准,建立剂量反应曲线,确定该方法的灵敏度,并对该方法的精密性、特异性和适用性进行验证。结果制备的多克隆抗体高峰效价为1∶105,纯化后的抗血清蛋白含量为6.45mg/ml。建立的ELISA方法对狂犬病病毒抗原的最低检出量为5.3mIU/ml,最佳定量区间为10～110mIU/ml,相关系数为0.9983,精密性和特异性较好。用该方法对狂犬病疫苗进行抗原定量,与NIH法测定的疫苗效力具有一定的相关性;检测市售的不同毒株和细胞系生产的狂犬病疫苗,其结果在2.4～9.9IU/ml之间。结论已建立了狂犬病病毒抗原的定量检测方法,可对来自不同毒株和不同细胞系的狂犬病疫苗进行快速定量检测,为疫苗生产中的质量控制提供了简便的监测手段。     

狂犬病毒aG株糖蛋白在CHO细胞中的表达

目的克隆狂犬病毒aG株糖蛋白(Glycoprotein)基因,构建重组真核表达载体,在CHO细胞中表达aG株糖蛋白。方法采用RTPCR,从狂犬病毒aG株基因组RNA中扩增GP基因,并将该基因克隆至真核表达载体pCIdhfr上,以脂质体介导法转染CHOdhfr-细胞。用MTX筛选的抗性克隆经ELISA、免疫荧光及Westernblot检测GP蛋白的表达。结果克隆到狂犬病毒aG株糖蛋白全长基因,并在CHO细胞中进行表达。结论成功地在CHO细胞中表达了狂犬病毒aG株的糖蛋白,为进一步开发狂犬病毒基因工程疫苗打下基础。     

狂犬病病毒糖蛋白真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建狂犬病病毒糖蛋白基因的真核细胞表达载体,并在COS-7细胞中表达。方法培养狂犬病病毒,提取负链RNA,采用RT-PCR的方法扩增糖蛋白基因,并将该基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(A)上,通过脂质体介导的方法,转染COS-7细胞,用ELISA及间接免疫荧光法检测狂犬病病毒糖蛋白在COS-7细胞中的瞬时表达。结果成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(A)/G,转染COS-7细胞后,在其培养上清中未检测到狂犬病病毒糖蛋白的表达。间接免疫荧光试验表明,pcDNA3.1(A)/G能有效地表达狂犬病病毒糖蛋白于转染的COS-7细胞膜上。结论真核细胞表达载体pcDNA3.1(A)/G能够在COS-7细胞中表达狂犬病病毒糖蛋白,为开发狂犬病病毒糖蛋白基因工程疫苗奠定了基础。