生物制氢细菌分离培养与分子鉴定技术进展

分离鉴定、培养产氢发酵细菌是提高利用高浓度有机废水制氢系统产氢能力的重要因素.首先对连续流发酵法生物制氢系统进行工程调控和生态位调整,达到产氢最佳的乙醇型发酵阶段后,设计HPB-LR培养基,用改良Hungater等3种厌氧培养技术分离培养产氢菌;采用16S rRNA/rDNA序列分析和16S-23S rDNA间隔区测序技术对分离出产氢细菌进行鉴定.     

产氢发酵细菌培养基的选择和改进

高效产氢菌株的筛选与分离是生物制氢技术应用的重要基础之一，现有培养基都存在一定缺陷．为分离到高效产氢菌株，提出LM系列培养基配方，并通过产氢发酵细菌的分离和生长实验，确定了培养基的强还原剂为半胱氨酸，PH值为6．根据培养基对厌氧菌的分离数量、种类和培养基成分的分析，选择LM—1培养基为产氢发酵细菌的分离培养基．LM—1培养基分离出的5株高效产氢发酵细菌属于4个菌属，其中拟杆菌属、克雷伯氏菌属是国际上尚未分离到的高效产氢发酵细菌．利用LM—1培养基进行高效产氢细菌分离操作，得到较好的效果。     

产氢发酵细菌培养基的选择和改进

高效产氢菌株的筛选与分离是生物制氢技术应用的重要基础之一,现有培养基都存在一定缺陷,为分离到高效产氢菌株,提出 LM 系列培养基配方,并通过产氢发酵细菌的分离和生长实验,确定了培养基的强还原剂为半胱氨酸,pH 值为6.根据培养基对厌氧菌的分离数量、种类和培养基成分的分析,选择 LM-1培养基为产氢发酵细菌的分离培养基.LM-1培养基分离出的5株高效产氢发酵细菌属于4个菌属,其中拟杆菌属、克雷伯氏菌属是国际上尚未分离到的高效产氢发酵细菌.利用 LM-1培养基进行高效产氢细菌分离操作,得到较好的效果.     

16S rDNA测序快速鉴定废水生物处理系统目标细菌

在废水生物处理系统中建立分子生物学技术快速鉴定有关微生物,具有十分重要的意义．以发酵法生物制氢系统的活性污泥分离培养的厌氧发酵细菌为研究对象,采用16S rDNA碱基测序分子生物学技术,通过生物信息学数据库NCBI将DNA序列输入、比对,可以直接鉴定从废水生物处理系统中分离培养的细菌进行种属科的系统发育学地位的判定,从而简化了细菌鉴定程序．通过16S rDNA测序技术,进行了分离产氢细菌的分子生物学鉴定,发现生物制氢厌氧活性污泥中所分离的细菌可能存在的菌属有：Lactobacillus,Clostridium,Klebsiella,Pmpionibacterium和可能新发现的1个新属Biohydrogenbacterium等5个菌属的菌种,其中新属Biohydrogenbacterium的菌种都以利用碳水化合物生产氢气为其主要特征．16S rDNA测序技术为废水生物处理系统的细菌学研究提供了方便、准确和经济的技术基础．     

混合菌种非固定化技术制氢反应器产氢效能

为了研究混合菌种非固定化技术生物制氢反应器的产氢效能，实验采用厌氧Hungate技术和MPN法，从采用混合菌种非固定化技术的生物制氢反应器厌氧活性污染中分离到210株优势发酵菌株，其中18株为产氢细菌（HPB）。实验结果表明，主要决定反应器产氢效能的因素是反应器内HPB的数量和活性。采用混合菌种非固定化技术可以充分发挥HPB的产氢活性，但是由于反应器内HPB的数量和比例不高，大大制约了混合菌种非固定技术生物制氢反应器效能的充分发挥。针对这一结论，提出采用有自絮凝能力的高效产氢细菌进行快速启动和投加高效产氢菌株的方法提高生物制氢反应器的产氢效能。     

产纤维素酶细菌的筛选及其产酶条件的研究

对从连云港地区采集的样品通过富集培养、分离纯化得到31株细菌,经刚果红染色鉴定和液体发酵获得一株产纤维素酶高的细菌,该菌为革兰氏阳性,菌体成杆状,有芽孢。摇瓶产酶试验结果表明,该菌株在培养基初始pH=8,35℃,培养30 h产纤维素酶活力最高,达70 U/mL。     

猪粪污水中NH4+与产氢光合细菌的相关关系研究

以猪粪污水提取液为基质,脱NH4+/NH3猪粪污水提取液为对照,厌氧、连续光照、30℃下恒温培养产氢光合细菌,对光合细菌生长、产氢和[NH4+]进行了动态研究.结果显示[NH4+]＞0.2 mmol/L,光合细菌生长迅速,而产氢作用几乎被完全阻止,[NH4+]＜0.02 mmol/L时,光合细菌停止生长,产氢速度最快.由此可见,通过改变基质中[NH4+]能够有效地调控光合细菌生长和产氢进程.     

一个产氢产乙酸菌互营共培养体的培养基优化

营养生态位位于产酸发酵菌和产甲烷菌之间的产氢产乙酸菌,其分离培养困难,种子资源匮乏,限制了基于强化产氢产乙酸功能作用的高效厌氧生物处理技术的开发．在前期获得对丙酸具有较强降解能力的产氢产乙酸茵互营共培养体7-m-2a的基础上,探讨了丙酸质量浓度、氮源、ca^2＋、Fe^2＋、Mg^2＋和泛酸等对其生长代谢的影响．结果表...     

产氢产乙酸菌株AX2的生长条件及产乙酸特性

产氢产乙酸菌群在参与厌氧消化过程的各类微生物菌群中起着承上启下的作用,然而,目前产氢产乙酸菌的纯培养物很少,对其生理生态习性的了解也十分有限.为增加产氢产乙酸菌资源,了解其生理生化特性,通过丙酸和丁酸混合培养基,从厌氧活性污泥中筛选到一株具有产氢产乙酸特性的葡萄球菌(Staphylococcus)AX2,对其生长条件及转化丙酸和丁酸为乙酸的能力进行研究.结果表明,菌株AX2在丁酸培养基(2.4 g/L)和丙酸培养基(2.31 g/L)中的乙酸产量可分别达到278 mg/L和222 mg/L,并在以氯化铵为无机氮源、pH为7.0、35℃等条件下具有最佳的增殖能力.菌株AX2对丙酸、丁酸有较强的乙酸转化能力.     

产聚羟基烷酸菌株的分离与鉴定

从常州西郊采土壤样品3个,进行细菌的富集及分离纯化.在产聚羟基烷酸(PHA)的培养基上筛选了6株PHA产生菌.通过形态培养特征和生理生化特性的研究,将其中4株鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)     

产氢菌株Clostridium sp.T7的快速筛选

取自潮间带的污泥分别在不同温度下（80、100、121,℃）进行热休克预处理,富集产氢菌群并测定其产氢量,利用变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析混合菌群组成.结果表明：3种热处理条件下混合菌群的产氢量都要高于对照未处理菌群.DGGE图谱表明,与80、100,℃热休克处理混合菌群相比,经121,℃热休克处理富集的混合菌群,其电泳条带最少,测序结果发现该混合菌群中包括产氢菌Clostridium sp..从该混合菌群中纯化并鉴定了1株产氢菌株Clostridiumsp.T7（登录号HM104461）.培养温度对菌株T7产氢有一定影响,温度在25～55,℃范围内菌株Clostridium sp.T7都能产氢,最适产氢温度是35,℃.     

Optimization of detecting hydrogenase activity for acidogenic fermentation of activated sludge

In order to evaluate the hydrogen-producing efficiency of anaerobic activated sludge in Anaerobic Baffled Reactor(ABR)fermentation processes,the optimal conditions for hydrogen producing hydrogenase method on methyl viologen(MV)assay was used to detect the hydrogen production activity of the activated sludge.The most favorable parameters such as 0.6 mL sodium acetate buffer(pH 5.0),100 μL lysozyme,0.2 mL sodium dibromoethane(9.0 mmol/L)and 0.7 mmol/L iron added into 1 mL activated sludge(2.66～26.64 gMLVSS/L)were found.Furthermore,reaction temperature and culture time were detected as 40 ℃ and 30 min respectively.Sodium thiosulfate and sodium sulfides were taken as the reducing agent while trichloroacetic acid as terminator.Under the MV optimal conditions,micro-toxic Dimethyl sulfoxide(DMSO)get higher security and better accuracy.The sensitivity of the detection methods(DMSO as electron carrier)was increased by more than 30%.The results show that the optimal conditions can be applied to measure hydrogenase activity correlating with its specific hydrogen production rate in a hydrogen-producing anaerobic activated sludge system.     

氧化硫硫杆菌的培养特性及低品位磷矿浸出

从安徽某煤矿的酸性矿坑水中分离出能有效浸出低品位磷矿的氧化硫硫杆菌菌株,对其形态特征和培养特性进行了初步的研究,并通过研究不同固体培养基成分对氧化硫硫杆菌分离纯化的影响,确定了适宜的分离条件：采用双层平板,即上层为涂布氧化硫硫杆菌的Starkey固体培养基平板,下层为涂布异养菌（红酵母菌）的琼脂平板,可显著提高菌落密度并缩短检出时间。考查了培养基、表面活性剂等因素对所选育的氧化硫硫杆菌的浸磷效果的影响,通过初步试验浸磷率可达到48.41%。     

金霉素对猪场废水厌氧消化抑制作用

为探明抗生素对猪场废水厌氧消化的抑制作用,以金霉素作为抑制剂,采取批次试验的方法,对厌氧消化过程的产甲烷量进行测定.试验结果表明:厌氧污泥降解模拟废水的最大容积产甲烷速率为19.6mL/(L·h);在金霉素抑制下,最大容积产甲烷速率降低了47.4%.在无抗生素的情况下,产甲烷过程是厌氧消化的限速步骤;存在10mg/L金霉素时,水解发酵和产氢产乙酸过程受到较强的抑制,视为厌氧消化的限速步骤.金霉素对猪场废水厌氧消化有较强的抑制作用,为保证厌氧处理的稳定性,应针对水解发酵和产氢产乙酸过程采取相应的强化措施.     

选育高效产氢细菌的诱变剂选择

为选育高效产酸产氢细菌,采用1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)、紫外线+亚硝酸(UV+亚硝酸)和5-溴尿嘧啶+紫外线(5-BU+UV)对产氢发酵细菌Ethanoligenens harbinense ZGX4进行诱变处理,显示出不同的诱变效应差异.NTG只得到一种类型产氢突变株;紫外线+亚硝酸法获得5种突变体类型,且出现一种自絮凝很强、产氢能力提高约50%的突变类型.5-溴尿嘧啶+紫外线法获得2种突变类型,约80%的突变株的释氢能力呈现负增长趋势.实验证明,紫外线+亚硝酸法的诱变效应最好,高产氢能力突变株显示其菌落直径增大、颜色透明的变化特征.     

产氢细菌Ethanoligenens harbinense YUAN-3基因文库构建及分析

以高效产氢细菌哈尔滨产乙醇杆菌的模式菌株YUAN-3作为出发菌株,提取细菌总DNA,经过Sau3AI的不完全酶切,将2.5～5.0kb的片段连接入用BamHI酶切的pUC19质粒,转化入E.ColiDH5α中,构建菌株YUAN-3的基因组文库,得到克隆数接近9×103个,以最相近的梭菌属已报道的基因组平均大小4.6Mb计算,概括了其99%以上的基因组,达到了建库的理论值.随机挑取200个白色菌落进行测序,经分析得到的结果大多数与已经过全序列分析的产氢细菌的假想蛋白相近,其中有49个与其他菌株功能蛋白相似性超过70%的片段,包括叶酰聚谷氨酸合成酶、DNA拓扑异构酶、乙酰转移酶等,同时获得了7个功能蛋白或基因的完整开放阅读框.     

厌氧氨氧化细菌的分子生物学鉴定

采用分子生物学方法从厌氧氨氧化污泥中提取细菌总DNA,使用特异性引物进行PCR扩增。扩增产物经过克隆、测序后,得到厌氧氨氧化菌部分16S rDNA序列(长度为838 bp)。将得到的序列构建系统发育树进行分析。结果表明,厌氧氨氧化污泥中的厌氧氨氧化细菌与Anaerobic Ammonium-Oxidizing Planctomycete(AJ131819)细菌在进化上关系最近,并将该类细菌暂命名为Anaerobic Ammonium-Oxidizing Planctomycete ASBBR Gene。     

硫酸盐还原过程中氢分压的平衡与调节

采用两相厌氧工艺系统的产酸相反应器处理硫酸盐废水,通过连续流试验考察硫酸盐还原过程中分子氢的产生和去路．试验结果表明：在硫酸盐还原过程中,分子氢的产生者是产酸菌(AB)、产氢产乙酸菌(HPA)和利用脂肪酸的硫酸盐还原菌(ESRB);分子氢的消费者主要是利用氢的硫酸盐还原菌(HSRB)、产酸菌、产氢产乙酸菌和硫酸盐还原菌之间生物链式的协同代谢关系是维持系统低氢分压的前提．同时,揭示出在微生物的协同作用下,种间氢转移的途径和反应体系中氢分压的平衡与调节规律．     

一株同步脱氮脱硫菌的分离鉴定及其代谢特征

为改善传统脱氮工艺中需要外加有机碳源从而增加运行费用的缺点,采用平板夹层培养和Hungate厌氧培养技术相结合的方法,从土壤中分离到一株能够同时利用硫化物和硝酸盐的化能自养型兼性厌氧菌3-1F.16S rDNA测序分析表明,该菌与红平红球菌的相似性达99%.菌株3-1F的代谢特征表现为接种后24 h后进入对数生长期,60 h达到生长高峰,此时,硫代硫酸盐和硝酸盐的利用率分别超过94%和75%,代谢产物以单质硫和氮气为主,含少量硫酸盐.目前,具备同步脱硫脱氮功能的红平红球菌尚未见报道,该菌株的获得为研究废水同步脱硫反硝化工艺并通过生物强化方式提高工艺的处理效能提供了微生物资源.