绿色木霉AS3.3711的葡聚糖内切酶Ⅴ基因的克隆与表达

采用RT PCR方法克隆到绿色木霉 (Trichodermaviride)AS3 371 1的葡聚糖内切酶Ⅴ (EGⅤ )的cDNA基因。测序后构建到酿酒酵母诱导型表达载体pYES2上 ,转化酿酒酵母 ,同时研究了超声波处理对酵母完整细胞转化的影响。转化子用 2 %的 β D 半乳糖进行诱导 ,用Northern杂交和CMC糖化力法分别对目的基因的转录和表达产物的葡聚糖内切酶活性进行检测。结果表明 ,EGⅤ的cDNA基因开放阅读框长度为 74 1bp ,编码 2 4 7个氨基酸 ,推测的蛋白质分子量为 2 4 99kDa。超声波处理 6 0s的酿酒酵母的转化率最高 ,在相同条件下是未处理组的 2倍。酶活检测显示该基因能在酿酒酵母中表达并分泌到胞外。发酵液中的酶活在培养 6 0小时达到最高 0 0 4 6U/ml。最适酶解温度为 6 0℃ ,最适pH值为 5 4。     

黑曲霉内切聚半乳糖醛酸酶A基因在大肠杆菌中的表达及产物酶学性质研究

采用Trizol法提取黑曲霉(Aspergillus niger JL-15)的总RNA,RT-PCR扩增到黑曲霉内切聚半乳糖醛酸酶A基因(pgaA),pgaA全长1113bp,编码370个氨基酸残基.pgaA经EcoRI和NotI双酶切,定向插入到表达载体pET-32a(+)中,并转化Escherichia coli Rosetta-gami B(DE3),重组子经IPTG诱导,其表达产物(rePGA)果胶酶活性最高为637.0U/mg.酶学性质研究表明,rePGA的最适温度为60℃,热稳定性较差,最适pH为pH 5.0;Ca2+对其活性具有显著促进作用,而Fe3+和Mg2+对其活性具有显著抑制作用;SDS-PGAE结果表明,rePGA的相对分子质量约为40 500Da;rePGA的米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)分别为4.05mg/mL和39.37μmol/(mL.min),rePGA能快速降低果胶溶液的粘度,符合其内切作用模式特点.     

雌核发育银鲫四种孵化酶基因全长cDNA的克隆及其特征分析

用抑制性差减杂交结合SMART cDNA合成和RACE-PCR技术，克隆得到雌核发育银鲫(Carassius auratus gibelio)4种孵化酶基因的全长eDNA。4种孵化酶基因分别被命名为GHEl、GHE2、GHE3、GHE4。序列分析表明，4种孵化酶基因cDNA的开放阅读框均为795bp，都编码265个氨基酸。它们推断的编码氨基酸序列同源性在79．6～95．1％之间。种系分析表明，GHEl、GHE2、GHE3、GHE4的进化地位位于日本鳗鲡(Anguilla japonica)孵化酶和青鳉(Oryzias latipes)孵化酶之间。不同发育时期胚胎的RT-PCR分析表明，银鲫GHEl、GHE2、GHE3、GHE4 4种孵化酶基因从尾芽期到幼苗期都检测到表达，且GHE3和GHE4在神经胚期也检测到表达。各种组织的RT-PCR表明，它们在成鱼组织中不表达。     

内含子对人凝血因子Ⅸ活体表达的增强作用

为了研究内含子在活体水平对凝血因子Ⅸ的表达增强作用，首先采用lacZ为报告基因，建立了阳离子脂质体SA介导的活体基因转移方法。将带有凝血因子Ⅸ（hFⅨ）cDNA的质粒pCMVIX和带有hFⅨcDNA及其内含子的小基因（minigene）的质粒pCMVi'Ⅸ用SA脂质体包裹，分别经尾静脉注射到Balb／c鼠体内，pCMVIX注射后未在血浆中检测到hFⅨ蛋白；而pCMVi'Ⅸ注射后在Balb／c鼠血浆中检测到hFⅨ蛋白，最高达到10．1ng／ml，持续28天。pCMVi'Ⅸ经二次注射，FⅨ表达水平最高达到43.9ng／ml，持续40天后仍可检测到hFⅨ基因的表达，结果表明，内含子在活体水平对凝血因子Ⅸ的表达有显著的增强作用。     

乙肝表面抗原S2S基因在蓝藻Synechococcus sp.PCC7942中的表达研究

用PCR法将乙肝表面抗原基因S2S片段从乙肝病毒中扩增得到,将其插入到蓝藻热休克表达载体pEUTMT1中,构建成表达重组质粒pES2ST1.将蓝藻Synechococcus sp.PCC7942的总染色体与质粒pES2ST1同时进行EcoRI和SacI双酶切,再连接构建成为系列含有蓝藻染色体DNA同源片段的供体表达质粒.经转化筛选得到蓝藻Synechococcus sp.PCC7942转化藻株.PCR和Southern 杂交证明目的基因已经整合到宿主的染色体中.转化藻通过热诱导后,Northern-blot结果呈阳性,用化学发光检测技术可以检测到微量目的蛋白的表达,检测含量约为0.78～0.64ng/ml,目的蛋白约为可溶性蛋白的1.1×10-6～1.5×10-6.     

苏云金芽孢杆菌cry1Aα核心毒素基因转化烟草及其杀虫活性

将苏云金芽孢杆菌cry1Aα的C端编码区截短，获得编码N端609个氨基酸约1.8kb的核心毒素基因，将其构建到植物表达载体转化烟草，研究直接表达的活性ICP核心毒素被昆虫取食后的杀虫效果。T1代种子发芽的抗生素抗性分离和PCR检测证实cry1Aα核心毒素基因整合到了烟草基因组，Western杂交检测表明转化烟草能够正常表达大小为75．6kD的核心毒素蛋白。生物测定结果表明，转化烟草对初孵棉铃虫平均有高于60％的致死率，对初孵甜菜夜蛾平均达到70％的致死率，最高致死率均可达到90％以上，并对昆虫的生长发育有明显的抑制作用。     

兰花圆球茎基因枪转化后的GUS基因表达

利用花榔菜花叶病毒３５Ｓ启动子引导的葡糖醛酸糖苷酸基因检测基因枪法转化兰花圆球茎组织的瞬间表达效率。发现在基因枪轰击时在ＤＮＡ－金粉悬液中加入０．１ｍｏｌ／Ｌ的生长激素ＮＡＡ，轰击前预培养时使用０．１ｍｏｌ／Ｌ甘露醇处理，每个培养皿轰击压力为１１００ｐｓｉ下，ＧＵＳ基因在兰花圆球茎组织中的瞬间表达效率最高。     

中国人IL－9cDNA的亚克隆及其高效表达

在完成了ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ的克隆及序列测定的基础上，为实现ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ在原核细胞中的表达，重新合成了上游引物（在酶切位，久后加上ＡＴＧ）。以ｐｕｃ１９－ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ为模板进行了ＰＣＲ扩增，特异产物经ＥｃｏＲＩ酶切、回收后与经ｓｍａｌＩ、ＥｃｏＲＩ酶切的ｐＢｖ２２０载体连接，转化大肠杆菌。转化子质粒用０．８％ａｇａｒｏｓｅ电泳粗筛，经ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌ酶切后得到了３个阳性克隆。３个阳性克隆经热诱导后，在ＰａＰ＿Ｌ启动子作用下，获得了天然ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ的高效表达，表达量分别达到可溶性总蛋白的３７．３％、４３．８２％、５４．５２％。     

嗜冷杆菌EastSeaG5-1415脂肪酶基因的克隆和序列测定

从东海深海底泥中筛选到一株产低温碱性脂肪酶的海洋细菌EastSeaG5-1415,经鉴定为嗜冷杆菌Psychrobacter glacincola。将其染色体DNA用Sau3AI部分酶切后,低熔点琼脂糖回收2～10kb的。DNA片段,用Klenow大片段酶半补齐,与用Sal I酶切半补齐的质粒pUC19连接后,转化E．coli．JM109构建基因文库。用平板测活法从基因文库初步筛选到两株产碱性脂肪酶的阳性克隆,采用ELISA反应进一步鉴定。序列测定分析表明,两个重组质粒中都包含长度为951bp的碱性脂肪酶基因的完整开放阅读框架(ORF)和上游基因调控序列。此片段编码有317个氨基酸组成的酶,计算分子量为35000 Dal。通过Southem杂交证实了此片段来自于嗜冷杆菌Psychrobacter glacincola EastSeaG5-1415基因细。     

人乳铁蛋白基因山羊乳腺特异性表达载体的构建

人乳铁蛋白（human lactoferrin，hLf）是一种铁结合性糖蛋白，具有多种重要的生理功能，因其巨大的经济价值和使用价值而引起广泛关注。目前已在小鼠、奶牛、昆虫、烟草等系统中表达了重组的人乳铁蛋白。但生产的hLf远远不能满足市场需求，鉴于乳腺反应器的优越性，所以应用基因工程大量生产乳腺特异性表达的hLf具有重要的实际意义。本研究先将hLf进行分子克隆，然后经限制性内切酶PmeI切割和胶回收获得hLf片断，与此同时，将真核表达载体pBCI用限制性内切酶XhoI消化并进行末端修饰，然后将其与hLf片断进行连接，最后将连接产物转化大肠杆菌并筛选阳性重组子。经PCR鉴定和限制性内切酶分析，结果表明成功构建了含有山羊乳腺细胞特异性表达启动子β-casein promoter的人乳铁蛋白基因真核表达载体pBC I-hLf，这就为hLf在乳腺组织中的特异性表达奠定了基础。。     

以融合蛋白形式在E·Coli中表达人神经生长因子

将人神经生长因子基因（hNGF）克隆到pMalC2质粒中，构建了表达产物为麦芽糖结合蛋白（MBP）与hNGF的融合蛋白重组质粒。经由内切酶再水解及DNA序列测定等分析表明，重组质粒含hNGF基因（360bP），该质粒在E·Coli中的表达产物为融合蛋白MBP－hNGF（55kd），光密度扫描表明，其表达量约为30％。     

人骨形态发生蛋白－1（hBMP－1）成熟肽的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用ＰＣＲ方法从ＢＭＰ－１的ｃＤＮＡ中克隆了ＢＭＰ－１成熟肽的编码基因，删除了ＢＭＰ－１前体分子Ｎ端的信号肽序列和Ｃ端的其他序列。用ＨｉｎｄⅢ消化１．３Ｋｂ的ＰＣＲ产物，将０．８４和０．４６Ｋｂ两片段分别克隆到ｐＵＣ载体中进ＤＮＡ序列分析。分别酶切回收ＥｃｏＲ－ＨｉｎｄⅢ和ＨｉｎｄⅢ－ＢａｍＨⅠ两目的基因片段，与大肠杆菌表达载体ｐＢＶ－２２０进行退火连接，使插入基因受控于Ｐ＿ＲＰ＿Ｌ启动子。将含有ＢＭＰ－１成熟肽编码基因重组表达质粒ｐＢＶＢＭＰ－１转化大肠杆菌宿主细胞进行温度诱导表达。结果表明，经４２℃热诱导后，大肠杆菌能以包涵体形式表达ＢＭＰ－１成熟肽，其分子量约为５２ｋＤａ。     

乙肝病毒融合表面抗原SA—28基因在酵母中的表达

利用基因工程技术，先将乙肝病毒表面抗原Ｓ－ｐｒｅＳ１融合基因ＳＡ－２８置于酵母杂合启动子ＡＤＨ２－ＳＵＣ２的控制下，然后将ＳＡ－２８基因的表达单元插入高稳定质粒ｐＨＣｌ１的ＢａｍＨＩ位点，构建成表达质粒ＹＦＤ１５０和ＹＦＤ１５０－ｏ并将其转化酿酒酵母Ｙ１９。对转化子表达ＳＡ－２８基因的研究表明：表达受葡萄糖浓度调控；表达产物具有Ｓ和ｐｒｅＳ１双重抗原性，并形成密度为１．２０－１．２２ｇ／ｍｌ的颗粒     

条纹斑竹鲨鱼再生肝组织cDNA质粒文库的构建和鉴定

建立了鲨鱼肝脏的部分切除模型,获得了再生2 4h的鲨鱼肝组织,分离了再生肝组织的总RNA ,纯化了mRNA ,利用含BamHI酶切位点的Oligo(dT) 16 为引物合成cDNA第一链,通过末端转移酶在cDNA第一链3’末端加入Oligo(dC)尾,进而以Oligo(dT) 16 和含HindIII酶切位点的Oligo(dG) 10 为引物,通过LD PCR (long distance PCR)方法合成双链cDNA ,将双链cDNA经BamHI和HindIII双酶切,通过T4 DNA连接酶连接到经相同酶切的pUC19载体后构建成cDNA文库。对文库质量的分析结果表明,通过本方法构建的鲨鱼再生肝组织cDNA文库容量至少为4 .92×10 5个/ μgdscDNA ,重组率达96 .7%。对随机提取30个克隆的质粒进行分析,获得了其中2 5个插入片段的序列,未见重复序列,经与GenBank和dbEST数据库比对分析发现新基因在其中占较大的比例(76 % )。鲨鱼再生肝组织cDNA文库的成功构建为进一步通过差异显示技术筛选、克隆肝再生过程中差异表达的相关功能基因奠定了一个良好的基础。     

南极产低温几丁质酶菌株的16S rDNA序列分析及其发酵条件及酶学性质研究

从南极深海沉积物中筛选到一株产低温几丁质酶的菌株AC444,经细菌形态观察及16S rDNA序列分析,该菌株属于假交替单胞菌属（pseudoalteromonas）,其最适与最高生长温度分别为15℃和30℃,属于兼性嗜冷菌。AC444菌株能利用多种碳源产酶,在含胶体几丁质和蛋白胨的培养基中产酶最高,达13．47U,最适产酶温度为20℃。酶的最适反应pH为7．0,最适作用温度为35℃,属中性低温酶。     

产纤维素酶真菌RX-3的筛选鉴定及产酶条件优化

筛选获得一株高产纤维素酶的真菌并进行产酶优化及酶学性质探究,可为纤维素酶在废纸造纸中的应用提供参考。利用刚果红鉴定法筛选若干株产纤维素酶的菌株,以DNS显色法测定菌株CMCase酶活。选取产酶能力最强即酶活最高的菌株对其进行产酶条件优化。最后,收集菌株产生的粗酶液探究其酶学特性。实验结果表明：真菌RX-3的产酶能力最强,经鉴定为曲霉属中的黑曲霉;真菌RX-3的最佳产酶条件是,麦麸和蛋白胨分别为RX-3的碳源和氮源、接种量为2%、最适pH环境为4。真菌RX-3所产纤维素酶的酶学特性是,最适反应时间为25 min,最适反应温度为50 ℃,底物与酶液最适比为3:1,Fe2+和Mn2+对酶活性起促进作用,Zn2+、Mg2+和Cu2+对酶活性起抑制作用。     

路邓葡萄球菌单宁酶基因的克隆、表达、纯化与改造

为提高路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)单宁酶(Sl-tan)的活性,该文利用化学合成方法获得Sltan基因,将该基因连接到重组表达质粒pET43.1-A,再转化到大肠杆菌感受态细胞BL21-DE3中进行表达,通过亲和层析柱纯化,以没食子酸甲酯为底物进行酶活性测定以及酶学性质分析,并基于生物信息学分析,结合定点突变技术对Sl-tan进行人工改造。结果显示,获得的重组单宁酶产量明显增高,最高可达42 mg/L发酵液;酶学性质研究显示该酶在pH 8.0,温度40℃时获得的活性最高(40 U/mg);Ala460突变为Pro460后的Sl-tan活性可提高82.5%。     

水稻白叶枯病菌受寄主诱导基因的鉴定

用一个具链霉素（Ｓｍ）抗性并含无启动子ＣＡＴ基因的广宿主启动子探针质粒ＰＩＪ３１００，用鸟枪法在ＣＡＴ基因上游的ＢａｍＨ１克隆位，或插入水稻白叶枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ），用ＢａｍＨ１完全酶切的染色体ＤＮＡ片段，将重组质粒转化大肠杆菌ＥＤ８７６７在含链霉素的ＬＢ单板上筛选转化子。得到容量为６０００个转化子的克隆群体，其中２％的克隆含有水稻白叶枯病菌启动子活性片段，在平板上表现氯霉素（Ｃｍ）抗性。在帮助质粒ＰＲＫ２０１３的帮助下，通过三亲支配，将含有水稻白叶枯病菌启动子片段的重组质粒转移进野生型的水稻白叶枯病菌中去，在含链霉素的ＰＳＡ平板上筛选１６００个接合子，其中一个在平板上表现氯霉素抗性及含有组成表达的水稻白叶枯病菌启动子。随机选取２００个平板上对氯霉素敏感的接合子，接种用氯霉素处理的水稻感病品种金南风，得到１５个比对照明显致病的克隆。用其中一个含受水稻特异诱导启动子的重组质粒为探针，在水稻白叶枯病菌野生菌基因文库中筛选到２７个阳性克隆。     

β-半乳糖苷酶基因(lacZ)在海藻裙带菜中的稳定表达

借鉴海带遗传转化模式，利用基因枪法将β-半乳糖苷酶基因(lacZ)导入裙带菜雄配子体中，一部分诱导形成营养增殖的丝状体，另一部分和雌配子体受精生成孢子体。五个月后组织化学染色结果表明5％的孢子体个体和30％的丝状体细胞表现了lacZ的稳定表达，利用PCR和PCR-Southem检测得到了预期的阳性信号。本文结果提示了利用基因枪转化方法．以雄配子体介导获得外源基因在裙带菜中稳定表达的可行性．