类泛素介导和热激响应协同提高酿酒酵母的热稳定性

通过调节类泛素和热激响应介导的酿酒酵母内部的活性蛋白质平衡,提高酵母细胞的热稳定性和乙醇发酵性能,从而达到工业生产中降低控温能耗的目的。将5个蛋白质平衡相关基因分别与调控基因FBA1p组合构建耐热元器件,并将其导入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeINVSC1,通过梯度升温培养筛选得到能赋予酵母细胞较好耐热性的类泛素元器件FBA1p-atg8和热激蛋白元器件FBA1p-hsp104;其对应的工程菌S.c-ATG8和S.c-HSP104在40℃恒定培养下,OD₆₆₀值均比对照高50%以上(84h),细胞存活率分别是对照的1.64倍和3.01倍(72h),且都具有较好的细胞壁完整性及海藻糖合成量。将atg8与hsp104组合构建成双功能耐热元器件,其工程菌S.c-ATG8-HSP104在40℃恒定发酵的生长能力、细胞活力和乙醇生产能力都明显优于S.c-ATG8与S.c-HSP104。结果表明,通过类泛素介导与热激蛋白响应协同调节胞内活性蛋白质平衡可以有效地提高酿酒酵母的热稳定性。     

大肠杆菌耐热元器件的构建及其应用

以提高大肠杆菌耐热性为目的,基于腾冲嗜热菌(Thermoanaerobacter tengcongensis MB4)热激蛋白基因T.te-HSP20构建了诱导型耐热元器件T7-T.te-HSP20和组成型耐热元器件gapA-T.te-HSP20,转入大肠杆菌(Escherichia coli)获得工程菌E.coli-TH和E.coli-GH。工程菌E.coli-TH在30℃和IPTG诱导下,目标蛋白呈可溶性表达,经50℃热激30 min后,存活率提高了3.2倍。高温发酵表明gapA-T.te-HSP20扩宽了工程菌E.coli-GH的最适生长温度的范围(37~43℃),较大程度提高了大肠杆菌的耐热性。抗逆性分析还发现工程菌E.coli-GH具备了耐热与耐丁醇的双重功能,并有一定的抗乙酸和乙醇能力。为工业梯度升温发酵生产生物基产品的高效制造、节省成本提供了新思路。     

大肠杆菌耐热元器件的构建及其应用

以提高大肠杆菌耐热性为目的,基于腾冲嗜热菌（Thermoanaerobacter tengcongensis MB4）热激蛋白基因 T.te-HSP20 构建了诱导型耐热元器件T7-T.te-HSP20 和组成型耐热元器件gapA-T.te-HSP20,转入大肠杆菌（Escherichia coli）获得工程菌 E. coli-TH 和 E. coli-GH。工程菌E. coli-TH在30℃和IPTG诱导下,目标蛋白呈可溶性表达,经50℃热激30 min后,存活率提高了3.2倍。高温发酵表明gapA-T.te-HSP20扩宽了工程菌E. coli-GH的最适生长温度的范围（37～43℃）,较大程度提高了大肠杆菌的耐热性。抗逆性分析还发现工程菌E. coli-GH具备了耐热与耐丁醇的双重功能,并有一定的抗乙酸和乙醇能力。为工业梯度升温发酵生产生物基产品的高效制造、节省成本提供了新思路。     

低甘油产率的酿酒酵母工程菌构建研究进展

酿酒酵母具有安全、遗传背景清楚、生长速度快、高糖耐受性、高乙醇产量以及高胁迫耐受性等特性,是乙醇生产较为理想的细胞工厂.甘油是酿酒酵母发酵产乙醇过程中的一种主要伴生副产物,过量表达甘油影响糖醇转化率.通过基因工程改造甘油代谢和乙醇生产途径,是降低甘油产量和提高乙醇转化率的有效策略.首先分析改造酿酒酵母细胞中甘油和乙醇代谢路径,阐明甘油在酿酒酵母中生理功能;然后,根据甘油合成途径、分解途径和NAD+/NADH代谢途径,分析低甘油产率的酿酒酵母工程菌构建的技术路径,比较各种基因改造策略对甘油合成和乙醇产率的影响;最后,针对基因整合技术、工程菌遗传稳定型以及工程菌代谢负担加重方面存在的问题,提出可供参考的解决方案,为构建酿酒酵母工程菌高效生产乙醇提供参考.     

LSM蛋白增强木糖发酵重组酵母抗逆性能的研究

木质纤维素原料预处理过程中产生的弱酸、呋喃醛类和酚类化合物等对酿酒酵母的乙醇发酵有抑制作用,提高基因重组酵母对抑制物的耐受性,是利用植物秸秆水解液生产燃料乙醇的关键技术之一。研究从前期构建的戊糖、己糖共发酵重组酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae ZU-E8基因组DNA中克隆出RNA结合蛋白LSM6,将其连入含有PADH启动子的质粒构成表达载体pR-LSM,进而转入ZU-E8宿主细胞中。通过高浓度醋酸根平板筛选,得到高抗逆性木糖发酵重组酵母ZU-910。在醋酸浓度为2 g·L-1的木糖培养基中发酵96 h后,ZU-910的木糖利用率和乙醇浓度为90.2%和26.9 g·L-1,分别是出发菌株ZU-E8的8.5和10倍,并且ZU-910对糠醛和硫酸根的耐受能力也较ZU-E8大大增强。在玉米秸秆酶解液发酵中,ZU-910的木糖利用率和乙醇产量在ZU-E8基础上增加了10.5%和7.7%.证明LSM6蛋白确实能够增强木糖发酵重组酵母的抗逆能力,提高其发酵性能。该研究成果在木质纤维素替代粮食生产乙醇的产业化进程中具有良好的应用前景。     

与膜耦合的细胞固定化串联发酵制乙醇的研究

利用植物纤维作为廉价的糖源生产燃料乙醇是解决世界能源危机的最有效途径.今研究采用海藻酸钙固定普通酿酒酵母细胞和嗜鞣管囊酵母细胞于两个串联的发酵罐内,连续发酵葡萄糖和木糖组成的糖液并与膜耦合来制取酒精.通过硅橡胶膜(PDMS)的渗透蒸发过程,将产品乙醇从发酵液中移出,减少了产物乙醇对发酵的抑制作用.实验结果表明,这套采用海藻酸钙固定酵母细胞进行连续发酵并与膜耦合的生物反应器系统,在稀释率为0.321 h-1下稳定运行,剩余葡萄糖和木糖浓度分别为0.134、4.921 g·L-1,乙醇得率为O.457 g(乙醇)·g-1(糖),是理论得率的92.64%.生产能力达到10.996 g·L-1·h-1.与其它发酵方式相比较,用海藻酸钙来固定细胞并与膜耦合的发酵过程可增大酵母细胞浓度,明显降低乙醇对酵母的抑制作用,并提高糖的转化率.     

乙醇发酵过程中酿酒酵母的磷脂组变化

磷脂分子是细胞膜的重要组成,在酵母发酵产乙醇过程中起重要作用。通过液质联用方法对两株酿酒酵母细胞（工业酵母O和实验室酵母S）的磷脂分子进行定性和定量分析,应用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘（OPLS）对O和S不同生长时期的磷脂图谱进行模式识别。结果发现,在乙醇发酵过程中,两株酵母共同的变化规律是：从延滞期进入指数期过程中,饱和短链磷脂分子增加,不饱和长链磷脂分子减少。而两株酵母的差异表现在延滞期时,具有较低生长速率的酵母PE分子含量更高。     

异源转氢酶NNT对酿酒酵母木糖代谢的影响

表达有毕赤酵母木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)的重组酿酒酵母,能代谢木糖.但是XR和XDH分别偏好辅酶NADPH和NAD⁺,造成辅酶的不平衡和副产物的积累,所以重组酿酒酵母利用木糖产生乙醇的效率很低.转氢酶可以催化辅酶NADPH和NADH之间的相互转化,因此本实验将黑曲霉的转氢酶基因NNT转入到重组酿酒酵母中,通过实验确定了NNT基因的表达蛋白在酵母细胞内定位于线粒体中,NNT基因分别用pPGK1、pCCW12和pHXT7启动子进行表达,在微好氧的木糖发酵条件下,NNT基因的导入使酿酒酵母甘油产量下降,乙醇产率提高,在由pCCW12和pHXT7表达NNT基因的重组酿酒酵母中,木糖醇产率分别下降86.3%和49.3%,乙醇产率提高16.7%和12.7%,说明转氢酶NNT的存在改善了木糖代谢的辅酶不平衡,提高了乙醇的转化率.     

木糖还原酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的定向整合

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是重要的乙醇生产菌株,但因缺少戊糖代谢途径而不能利用木糖,为了改良工业酿酒酵母利用半纤维素发酵生产乙醇的性能,利用分子生物学技术构建能够利用木糖的基因工程酵母。选取酿酒酵母染色体的rDNA重复序列作为外源基因整合位点,依此构建多拷贝染色体整合型载体pUG-LR。采用融合表达策略扩增得到含有酿酒酵母乙醇脱氢酶启动子PADH和树干毕赤酵母木糖还原酶基因xyl1的融合序列,并将其插入pUG-LR载体中,构建成含遗传霉素G418抗性标记的同源重组质粒pUG-LR-XYL1。以工业酿酒酵母ZU-01为宿主,通过优化后的电穿孔法将重组质粒导入经缓冲液处理的酵母细胞,30℃培养。通过提高YEPX复筛培养基G418浓度,得到10株生长较快的优良性状转化子。在不含G418的YEPX培养基上传代8次以上,以转化子基因组DNA为模板,进行PCR检测,均可获得目的基因片段。研究结果表明:木糖还原酶基因xyl1已定向整合于ZU-01染色体DNA上并稳定遗传,为后续构建工业酿酒酵母的木糖代谢通路、利用木糖产酒精的重组菌株奠定了基础。     

芦苇秸秆混合发酵制备乙醇的工艺优化

以芦苇秸秆为原料,用混合碱液对其进行预处理以促进秸秆纤维素糖化,再通过酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和产朊假丝酵母(Candida utilis)混合发酵制备乙醇,在单因素实验的基础上,采用Plackett-Burman(PB)实验、最陡爬坡实验和响应面实验对制备工艺进行优化.结果表明,芦...     

锌离子对自絮凝酵母乙醇耐性和絮凝颗粒大小的影响

研究了6种金属离子在合成培养基中对摇瓶培养的自絮凝酵母乙醇耐性的影响,发现锌离子对高浓度乙醇冲击下的酵母细胞活性有保护作用,并进一步研究了乙醇连续发酵过程中锌的添加对自絮凝酵母乙醇耐性的影响。发酵培养基中分别添加0.01、0.05 和 0.1 g·L^-1的硫酸锌时,自絮凝酵母颗粒平均粒度减小,同时乙醇耐性和高温耐性都得到明显提高,并且发现细胞活性的提高与酵母细胞内麦角固醇和海藻糖的增加密切相关。对酵母细胞内锌的含量的分析表明,3个添加组胞内锌的积累量基本相似,比对照组均增加了6倍。相关性分析表明,酵母胞内锌含量与酵母细胞的胁迫耐性密切相关并显著影响其胁迫耐性。各添加组的乙醇产量均有提高,其中添加0.05 g·L^-1的硫酸锌时乙醇产量最高,比对照组高8.4%。以上研究结果表明,调控连续乙醇发酵过程中培养基中锌离子浓度,是提高酵母细胞乙醇耐受性、高温度耐受性和乙醇产量的有效途径。     

SSF法培养马克斯克鲁维酵母高产细胞和乙醇的工艺初探

为开发生物能源,使用马克思克鲁维酵母发酵甜菜产生酵母细胞数及乙醇,由系列单因素试验及部分析因试验初步确定发酵条件。结果表明,马克斯克鲁维酵母自身具备纤维素酶和木质素酶活性,在额外添加0.1%纤维素酶、5 g/L氮源尿素,同时采用SSF法和分批补料,摇床速度210.7 r·min^-1,CaCO₃添加量5 g/L,高密度培养的条件下,酵母细胞数和乙醇产量可达到一个平衡的较高值。     

拟薄水铝石-海藻酸铝固定化酵母生产乙醇

在原位合成拟薄水铝石中加入酵母和海藻酸钠,搅拌并冷冻后制备固定化酵母,以甘蔗废糖蜜生产乙醇。通过复合材料固定化酵母增殖机理发现,固定化酵母数达4.1×109个/mL,批式发酵中14h消耗了90.5%的总糖;40d连续流动中,稀释率为0.100h-1时,最大载体乙醇产率为52.0g/(L.h)。SEM表征表明,该固定化酵母细胞密度高,孔道结构丰富,利于细胞的繁殖生长和物质传送。乙醇发酵过程彻底,速率快,残糖水平低,原料利用率和发酵醪乙醇质量浓度均超过传统工艺。     

重组酵母发酵半纤维素水解液生产酒精的研究

玉米秸秆中的半纤维素主要由五碳糖组成,普通的酿酒酵母不能发酵五碳糖。今利用基因重组酵母Sacchromyces cerevisiae ZU-10发酵玉米秸秆半纤维素水解液生产酒精,针对半纤维素水解液中的主要发酵抑制物,研究了硫酸根离子、乙酸、糠醛对重组酵母生长的影响,发现S.cerevisiae ZU-10细胞对SO42·,乙酸和糠醛的耐受浓度分别为5g·L·1、0.25g·L·1和0.08g·L·1。对玉米秸秆半纤维素的水解工艺进行了比较研究,结果表明,玉米秸秆采用1%H2SO4(固液比1:10),在95℃水解12h,其中的半纤维素水解率达到93%,发酵抑制物相对较少。半纤维素水解液经石灰中和、真空浓缩及离子交换处理后,可用于酒精发酵。半纤维素水解液的糖浓度与浓缩倍数及发酵抑制物浓度成正相关,对于重组酵母S.cerevisiae ZU-10,半纤维素水解液的适宜糖浓度为80g·L·1。在此浓度下,接种量1.2g·L·1(细胞干重计)、30℃、厌氧发酵96h,酒精浓度为31.05g·L·1,水解液中的木糖利用率达到95.85%。该研究结果对于促进半纤维素资源的转化利用,加速秸秆酒精的产业化进程具有重要意义。     

乙醇连续发酵-渗透汽化耦合系统发酵动力学研究

利用自制硅橡胶平板复合膜构造乙醇连续发酵-渗透汽化耦合系统,研究了系统长期运行中发酵反应动力学问题,并分析了连续发酵过程中细胞比生长率的变化。系统稳定运行了269h。由于渗透汽化的进行,发酵液中乙醇浓度控制在35—45g·L-1,酿酒酵母浓度维持在20—25g·L-1,在发酵与渗透汽化耦合阶段,乙醇产率达到3.4g·h-1L-1,是间歇发酵时的4.5倍。乙醇得率系数为0.46,乙醇的转化率达到91%。膜下游冷凝收集液的浓度可达28.2—16.5%(wt),总渗透通量达到1226—707g·m-2h-1,乙醇渗透通量为293—117g·m-2h-1,分离因子为8.5—4.9。     

酿酒酵母生物转化蛋氨酸生产S-腺苷-L-蛋氨酸

摇瓶考察筛选酿酒酵母（zjus1)培养1d后补加蛋氨酸和葡萄糖生产S－腺苷－L－蛋氨酸（SAM），并考察了酵母提取物，补加蛋氨酸浓度，葡萄糖浓度及转化pH对酵母细胞的生长和SAM产量的影响，15LB.Braun罐间歇培养及转化过程实验表明，溶氧提高利于碳源利用、细胞生长和SAM产量提高，SAM水平可达800mg/L，酵母密度DCW=15g/L，蛋氨酸转化率约30％。     

整合型酿酒酵母菌株强化发酵和特性比较

为了提高木糖异构酶基因在重组酿酒酵母体内的稳定性,并比较不同真菌来源的木糖异构酶在木糖或者葡萄糖-木糖培养基的发酵利用特性,分别构建来自Piromyces sp.E2和Orpinomyces sp.的木糖异构酶基因的整合表达载体,利用同源重组将其整合进入呼吸缺陷型菌株的18S rDNA非转录区,结果测得Orpinomyces的木糖异构酶酶活活力为0.72 U/mg,比Piromyces的木糖异构酶酶活高2.8倍。在木糖培养基中发酵获得乙醇的得率分别为0.40 g/g和0.48 g/g。且整合入Orpinomyces的木糖异构酶基因菌株能获得最高酶活和乙醇得率。     

国产与进口重组酵母乙型肝炎疫苗免疫小鼠早期细胞免疫应答的比较

目的比较国产与进口重组酵母乙型肝炎疫苗免疫小鼠早期细胞免疫应答的差异。方法取批签发合格的国产疫苗1和2(酿酒酵母)、进口疫苗1(酿酒酵母)、国产疫苗3和4(汉逊酵母)、进口疫苗2(汉逊酵母)各3批,经背部皮下免疫BALB/c小鼠,3μg/(100μl·只),于免疫后7 d,处死小鼠,无菌取脾,制备脾细胞悬液,分离脾单个核细胞(mononuclear cell,MNC)。采用酶联免疫斑点(enzyme linked immunospot assay,ELISPOT)法测定小鼠MNC体外接受HBsAg刺激后产生的抗原特异性细胞因子IFNγ、IL-2、IL-4和IL-5水平及体外接受MHCⅠ类多肽S28-39刺激后产生的IFNγ水平。结果小鼠免疫酿酒酵母乙肝疫苗后,以HBsAg刺激MNC,国产疫苗1诱导产生的IFNγ、IL-2和IL-4水平均明显高于国产疫苗2和进口疫苗1,国产疫苗1和2诱导的IL-5水平均明显高于进口疫苗1(P均0.05);以S28-39刺激MNC,3种疫苗诱导产生的IFNγ水平差异均无统计学意义(P0.05)。小鼠免疫汉逊酵母乙肝疫苗后,以HBsAg或S28-39刺激MNC,进口疫苗2诱导的IFNγ和IL-4水平均明显高于国产疫苗3(P0.05);3种汉逊酵母乙肝疫苗诱导的IL-2和IL-5水平差异均无统计学意义(P0.05)。结论国产重组酵母乙肝疫苗诱导早期细胞免疫应答能力较好。     

粪产碱杆菌D-氨基酰化酶的分离纯化及发酵条件优化

采用热激法将含粪产碱杆菌D-氨基酰化酶基因载体的质粒导入大肠杆菌,筛选重组子,对该工程菌产生的D-氨基酰化酶用Ni 2+柱进行分离纯化;通过单因素实验优化D-氨基酰化酶的发酵条件。结果表明,纯化后的D-氨基酰化酶比活力为456.71U·mg-1,纯化回收率为50%,纯化倍数为12.4倍;最佳发酵条件为:37℃通气培养至菌体浓度OD600值为0.6时,加入0.5mmol·L-1诱导剂IPTG诱导5h,在此条件下,D-氨基酰化酶酶活力为90.9U·mL-1。     

产蛋白酶菌Planomicrobium sp.L-2发酵条件的优化

通过优化从长蛸胃肠道筛选得到的产蛋白酶菌Planomicrobiumsp.L-2菌株的发酵条件,提高其产蛋白酶的活力。采用单因素实验研究发酵培养基的最佳碳源、氮源以及最佳发酵条件,采用Box-Behnken设计方法进行响应面实验设计,进一步优化培养基组成。结果表明,最佳培养基组成及发酵条件为:可溶性淀粉0.73%、蛋白胨0.68%、酵母膏0.15%、磷酸高铁0.01%、海水,培养基初始pH值8.0,接种量8%,发酵温度25℃,发酵时间3.5d。优化后,所产蛋白酶的最高酶活力为1 457U·mL-1,比优化前提高约2倍。