里氏木霉QM9414尿嘧啶缺陷型转化体系改进和β-葡萄糖苷酶的过量表达

里氏木霉是广泛应用于纤维素酶生产的工业真菌,但高产突变株遗传操作困难,限制了菌种改良。首先利用定点整合策略敲除里氏木霉突变株QM9414的pyr4基因,成功构建尿嘧啶营养缺陷型菌株QP4,其遗传转化效率显著提高,而且产酶能力不受影响。进一步在QP4中过量表达β-葡萄糖苷酶(BGL)基因bgl1,经大量平板显色筛选获得2株BGL活力明显增强的工程菌QPB4和QPB5,其酶活分别提高10.01倍和8.26倍。利用发酵酶液对2种不同预处理的玉米芯底物进行水解糖化实验,结果显示以酸处理玉米芯为底物时QPB4和QPB5的葡萄糖得率比QP4分别提高60.98%和52.44%,而以脱木素处理玉米芯为底物时其葡萄糖得率分别提高80.01%和86.00%。研究表明改进里氏木霉高产突变株遗传转化体系可以显著促进菌株改良,提高糖化应用效果。     

外切-β-葡聚糖酶基因重组里氏木霉的筛选及其产酶性能

外切-β-葡聚糖酶是纤维素酶的重要组分之一,提高该组分的活力是增强纤维素酶协同降解性能、降低纤维素水解成本的关键。分别采用微晶纤维素琼脂平板法和滤纸崩解法,对已有的基因重组转化子进行筛选试验,获得了6个优良转化子,其滤纸崩解速率和微晶纤维素琼脂平板上的生长速率都较大。进一步在摇瓶条件下进行复筛试验,获得了外切-β-葡聚糖酶(C1)高产转化子Trichoderma reesei ZU-101,液体培养48 h,其C1酶活力可达18.24 U·ml-1,是出发菌株的2.16倍;分析结果表明:重组转化子的纤维素酶体系中内切-β-葡聚糖酶和纤维二糖酶的活力与出发菌株相比变化不大,但由于外切-β-葡聚糖酶活力得到了大幅度提高,纤维素酶的总活力(滤纸酶活力FPA)也提高了61.9%。采用纤维素酶对碱预处理玉米秸秆进行酶解试验,当酶用量为20 FPIU·(g底物)-1,水解48 h,重组转化子T.reesei ZU-101纤维素酶的酶解得率高达94.4%。本文的研究结果在可再生纤维素资源的生物转化与利用方面具有广阔的应用前景。     

厌氧真菌内切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与表达

里氏木霉(Trichoderm reesei)是重要的纤维素酶生产菌,为了显著提高其产酶性能,拟利用分子生物学技术构建高产的基因工程菌株.将前期优化后的瘤胃厌氧真菌内切-β-葡聚糖酶基因af2置于里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅰ强启动子Pcbh1(及其信号肽)和终止子Tcbh1之间,并进一步以pCAMBIA1300为载体骨架,...     

一种新型内切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与表达

刺糙青霉(Penicillium echinulatum)可产生一种耐热、耐碱的新型内切-β-葡聚糖酶(EGL1),具有重要的工业应用价值。鉴于野生型刺糙青霉的产酶水平低,将该菌的内切-β-葡聚糖酶基因经过密码子优化后,在里氏木霉(Trichoderma reesei)中进行重组与表达,采用里氏木霉强启动子Pcbh1(纤维二糖水解酶Ⅰ)及其信号肽,以pCAMBIA1300为载体骨架构建重组质粒pCB-PET,并采用根瘤农杆菌介导转化技术将重组质粒pCB-PET导入里氏木霉的分生孢子中,在潮霉素抗性平板上筛选获得5个优良的重组转化子。将5个转化子重复传代培养10个批次后,分别提取染色体DNA进行PCR验证,均可检测到目的基因Egl1n(密码子优化后的Egl1)条带,说明该基因已稳定地整合到里氏木霉基因组中。采用SDS-PAGE蛋白电泳对转化子培养液进行检测,获得了与目的基因表达产物相符的蛋白条带(约41 kDa),表明Egl1n已在重组里氏木霉中成功实现了胞外表达。重组转化子在30℃,摇瓶转速200 r×min~(-1)条件下培养48 h,取发酵上清液在pH 8.0,60℃条件下,测得内切-β-葡聚糖酶活力为382.6 U×mL~(-1),是出发菌株的22.5倍。酶学性质研究结果表明:该酶耐热性能较好,在70℃以下性能稳定,其最适催化温度为60℃;该酶在pH 5.0~10.5稳定性较好、具有明显的催化活性,其最适pH为8.0,属于碱性纤维素酶。从而成功地实现了刺糙青霉内切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与胞外表达,有关研究结果在里氏木霉纤维素酶的定向进化及其工业化应用中具有重要的促进作用。     

固定化β-葡萄糖苷酶转化糖苷型异黄酮的研究

利用固定化β-葡萄糖苷酶把糖苷型异黄酮水解成苷元型异黄酮,可以提高大豆异黄酮的生理活性.用海藻酸钙包埋富含β-葡萄糖苷酶的黑曲霉孢子,可以方便有效地固定β-葡萄糖苷酶.研究考察了不同底物浓度,pH和温度对固定化β-葡萄糖苷酶酶解作用的影响,以及重复分批酶解条件下固定化酶的稳定性.当固定化酶珠体积占反应总体积的5%,糖苷型异黄酮浓度为1.2mg·mL-1,作用24 h,酶解效果良好.其中,大豆苷比染料木苷易于被酶解.固定化酶适宜的pH范围为3～5,最适pH值为4.8.耐热性比固定化前有所增加,在70℃以下酶较稳定.重复分批酶解糖苷型异黄酮,连续7批的转化率均可保持在90%以上.该研究结果在大豆异黄酮的生物转化方面具有潜在的应用前景.     

重组里氏木霉液体深层发酵产中性内切-β-葡聚糖酶

中性内切-β-葡聚糖酶在纺织、食品和造纸等领域中应用广泛。研究采用一株重组里氏木霉(Trichoderma reesei)生产中性内切-β-葡聚糖酶,发酵液经SDS-PAGE检测,显示了来自特异腐质霉(Humicola insolens)内切-β-葡聚糖酶的蛋白条带(约52 kDa)。对重组里氏木霉的发酵性能进行了研究,表明碳源对内切-β-葡聚糖酶的形成有重要影响,当采用乳糖与微晶纤维素的复合碳源时,酶活力和产率都可明显提高。利用玉米浆粉作为氮源,其适宜浓度为12 g·L-1。培养基初始pH值对发酵酶活力及产率有一定影响,适宜的初始pH值为5.0。在2 m3的发酵罐进行产酶试验,发酵96 h酶活可高达8012 U·mL-1。酶学性质研究表明:该酶在50℃以下稳定,在45~55℃有明显的催化作用,其最适催化温度为50℃。在pH 5.0~7.0稳定性较好,并且有明显的催化作用,其最适催化pH值为6.0。生物整理实验结果显示重组里氏木霉所产酶液用于牛仔布水洗时反染较少,水洗效果良好。     

β-葡萄糖苷酶的研究进展

β-葡萄糖苷酶具有非还原性的特点,其在纤维素降解和改善食品风味方面具有重要价值,在对其性质及应用情况分析的基础上使得其得到更好的应用.就β-葡萄糖苷酶的研究进展进行综述.     

里氏木霉LW1产纤维素酶的酶学性质

研究了里氏木霉LW1所产纤维素酶的主要酶学性质。结果表明,该纤维素酶的最适温度为50℃,最适pH值为4.8;在30～50℃,pH 4.0～6.0范围内有较高的稳定性;90℃处理15 min,酶粉的CMC酶活和FPA酶活保存率分别为38.66%和52.68%;Ca2+、K+、Na+、Mg2+离子对酶活有激活作用,Mn2+、Zn2+、Cu2+离子有抑制作用。     

外切-β-葡聚糖酶基因重组里氏木霉的筛选及其产酶性能

外切-b-葡聚糖酶是纤维素酶的重要组分之一,提高该组分的活力是增强纤维素酶协同降解性能、降低纤维素水解成本的关键。分别采用微晶纤维素琼脂平板法和滤纸崩解法,对已有的基因重组转化子进行筛选试验,获得了6个优良转化子,其滤纸崩解速率和微晶纤维素琼脂平板上的生长速率都较大。进一步在摇瓶条件下进行复筛试验,获得了外切-β-葡聚糖酶（C₁）高产转化子Trichoderma reesei ZU-101,液体培养48 h,其C₁酶活力可达18.24 U·ml^-1,是出发菌株的2.16倍;分析结果表明：重组转化子的纤维素酶体系中内切-b-葡聚糖酶和纤维二糖酶的活力与出发菌株相比变化不大,但由于外切-b-葡聚糖酶活力得到了大幅度提高,纤维素酶的总活力（滤纸酶活力FPA）也提高了61.9%。采用纤维素酶对碱预处理玉米秸秆进行酶解试验,当酶用量为20 FPIU·（g底物）^-1,水解48 h,重组转化子T.reesei ZU-101纤维素酶的酶解得率高达94.4%。本文的研究结果在可再生纤维素资源的生物转化与利用方面具有广阔的应用前景。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的研究进展

系统介绍了近年来黑曲霉β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.2)的酶解特征、酶学性质、催化机制、活性中心、生物学功能及应用技术等方面的研究进展,并展望了其应用前景。     

中性内切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与表达

中性内切-β-葡聚糖酶在棉织物生物整理方面具有重要的应用价值,研究首先从特异腐质霉(Humicola insolens)菌株中克隆到一个中性内切-β-葡聚糖酶基因,将该基因置于里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶I强启动子Pcbh1(及其信号肽)和终止子Tcbh1之间,并以pCAMBIA1300为载体骨架构建重组质粒pCB-PHT。采用根瘤农杆菌介导转化技术将重组质粒pCB-PHT导入里氏木霉的分生孢子中,进一步筛选得到八个重组里氏木霉转化子。摇瓶发酵培养72 h时,发酵液的中性内切-β-葡聚糖酶活力最高可达到98.8 IU mL 1左右,是出发菌株的5.1倍。研究成功地实现了外源中性内切-β-葡聚糖酶在丝状真菌里氏木霉中的重组与胞外表达,有关研究结果将在牛仔布水洗工业中发挥出重要作用。     

重组里氏木霉产漆酶及其对2,4,5-三氯酚的高效降解

漆酶-介体系统在有机污染物治理方面具有较高应用潜能。2,4,5-三氯酚是一种检出率较高的氯酚类污染物,毒性强且难以自然降解,对环境和人类健康危害严重。以水稻秸秆作为底物,对重组里氏木霉进行固态发酵,第12 d滤纸酶活力及漆酶活力分别可达116.96和10.15IU×g~(-1),秸秆失重率可达54.73%。利用所产漆酶对土壤污染物2,4,5-三氯酚进行降解试验,探究了5种介体(香草醛、丁香醛、丁香酸、HBT、ABTS)对降解反应的影响,发现天然介体丁香醛可有效促进漆酶降解2,4,5-三氯酚,降解率为86.42%。随后对漆酶-丁香醛催化系统进行优化,考察了不同漆酶用量、丁香醛用量、pH和温度对降解2,4,5-三氯酚反应的影响。在适宜反应条件:漆酶用量0.2 IU×m L~(-1),丁香醛用量0.2mmol×L~(-1),pH 4.6,60℃,反应180 min后2,4,5-三氯酚降解率达到90.11%。这一研究结果对于秸秆综合利用及漆酶-天然介体系统在2,4,5-三氯酚等土壤有机污染物高效治理方面具有重要的促进作用。     

固定化β-葡萄糖苷酶双相体系中水解大豆异黄酮

采用共价交联的方法将β-葡萄糖苷酶固定到球形壳聚糖上,并对固定化酶的性质进行表征,得出固定化酶的最佳反应条件：pH=5,温度40℃。据此用乙酸乙酯和pH=5缓冲溶液的双相体系,在40℃条件下水解大豆异黄酮。与游离酶相比,固定化酶在此双相体系中起到了稳定酶的作用;与单相体系相比,双相体系中产物的产率显著提高,反应速率也更快,且能有效去除粗品大豆异黄酮的异味。对于30%左右级别的大豆异黄酮,水解的两个主要水解产物（大豆苷元和染料木素）的产率都能达到70%。     

里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因的高表达

纤维二糖水解酶II(CBH II)是纤维素酶的重要组分之一,对纤维素酶的水解性能有着重大影响,而里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶制剂中纤维二糖水解酶II明显不足,为了优化其酶系结构,采用了基因重组技术构建CBH II高产菌株:将里氏木霉CBH II基因置于里氏木霉强启动子Pcbh1(及其信号肽)和终止子Tcbh1之间,并进一步以pCAMBIA1300为载体骨架,构建成含潮霉素B抗性标记的重组质粒pCAMBIA1300-hph-PsCT。以里氏木霉ZU-02为宿主,采用根瘤农杆菌介导转化技术将重组质粒转入宿主分生孢子。以潮霉素B为抗性标记初筛到324个阳性转化子,进一步通过复筛,在以微晶纤维素为唯一碳源的筛选培养基上获得8个生长较快的优良转化子。在摇瓶条件下,分别对8个转化子进行产酶试验,培养48 h时,纤维二糖水解酶活力最高可达18.24 U·mL-1,是出发菌株的2.51倍。本结果对于里氏木霉纤维素酶的定向进化、提高其对纤维素的协同糖化效率具有重要意义。     

重组里氏木霉粗酶液提取虎杖中白藜芦醇的研究

为从虎杖中提取白藜芦醇并同步实现高效转化,经平板初筛和48 h的试管产酶复筛,从619株里氏木霉的基因重组菌中定向筛选出3株高产β-葡萄糖苷酶的菌株(BG-2,BG-4和BG-5)。摇瓶条件下产酶48h,三者的β-葡萄糖苷酶酶活为1.75,3.50和5.71 IU×m L~(-1),分别是出发菌株的36倍、73倍和119倍。以三者的发酵粗酶液直接处理虎杖粗提物,45℃条件下反应5 h后,与出发菌株相对比,重组菌株对白藜芦醇的提取率可达14.86~16.41 mg×g~(-1),是出发菌株的2.41~2.66倍;转化率可达120.5%~138.4%,是出发菌株的6.0~6.85倍,且反应液中基本无白藜芦醇苷残留。该研究策略从根本上提高了纤维素酶法对苷元型白藜芦醇的提取效率,可推广应用于其他易糖苷化的中草药成分的提取。     

β-葡萄糖苷酶发酵技术的进展

β-葡萄糖苷酶能作用于纤维二糖或纤维寡糖,使其水解为葡萄糖,在木质纤维素降解等领域具有重要的应用价值。文章对β-葡萄糖苷酶及其菌种的筛选和诱变、发酵工艺的优化以及菌体生长过程和发酵控制等进行综述。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

根据GenBank报道的黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因序列设计两对特异性引物,分别以黑曲霉H7总RNA及基因组DNA为模板,扩增出β-葡萄糖苷酶基因bgl全长及活性中心所在的外显子5序列E5,分别将其连接到pMD18-T载体并转化到大肠杆菌DH5α测序。结果表明,bgl序列全长2583 bp,与β-葡萄糖苷酶基因(XM001398779.1)核苷酸序列同源性为99%,氨基酸序列同源性为99%,E5与bgl外显子5区域同源性为100%。进一步构建表达质粒pET32a(+)-bgl、pET32a(+)-E5、pET28a(+)-E5,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳分析。     

柄篮状菌与里氏木霉酶解棕榈纤维效果的比较

以青霉属柄篮状菌和里氏木霉Rut-C30为研究对象,在50 IU/g底物酶用量的条件下,比较研究了这两种菌株各自对棕榈空果串纤维的酶解能力。结果表明,柄篮状菌对纤维素的酶解能好于Rut-C30,96 h后,两者葡萄糖转化率为83.7%、61.7%。Rut-C30对木聚糖的酶解能力相对较好,其木糖转化率为98.3%,而柄篮状菌酶解的木糖转化率仅为33.1%。将两菌株的酶按1∶1酶用量混合后,棕榈纤维的整体水解效果增强,葡萄糖、木糖转化率依次为91.3%和98.1%。该研究为柄篮状菌与木霉混合水解棕榈纤维提供了依据。