黑曲霉作为分泌蛋白细胞工厂的研究进展

黑曲霉具有极强的分泌蛋白的能力,其分泌的木质纤维素降解酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等广泛应用于食品、饲料和生物技术等相关工业中。本文围绕黑曲霉生产同源和异源分泌蛋白,阐述黑曲霉作为分泌蛋白细胞工厂的巨大潜力。首先,通过总结黑曲霉表达系统的优越性,确定了黑曲霉作为分泌蛋白细胞工厂的开发前景。随后,介绍了初步构建黑曲霉分泌蛋白细胞工厂的一般流程。接着,总结了近十年来黑曲霉作为同源分泌酶细胞工厂的研究进展,提出在黑曲霉中定向表达分泌酶是深入研究黑曲霉自身分泌酶性质、功能和结构的理想策略。最后,总结了近年来黑曲霉作为异源分泌蛋白细胞工厂的研究进展,并从异源蛋白表达中遇到的难点出发介绍了完善黑曲霉细胞工厂来提高异源蛋白产量的对策。     

丝状真菌异源蛋白高效表达的研究进展

丝状真菌作为细胞工厂在生物技术领域被广泛应用于生产药物、化学试剂和酶类。近年来,丝状真菌基因组学领域取得了快速发展,利用丝状真菌表达异源蛋白也越来越受到重视。本文从基因表达与调控、蛋白质分泌途径及丝状真菌菌株等方面对丝状真菌高效表达异源蛋白的最新研究进展作一综述。     

微生物高效分泌蛋白质的策略与应用

相比于胞内蛋白的生产,利用微生物细胞工厂生产分泌型蛋白具有更快速、便捷和下游分离工艺简单等优势。因此,首先概述了细菌微生物与真菌微生物不同的蛋白分泌系统和分泌机制,并分析了在蛋白分泌过程中,不同蛋白分泌系统、蛋白折叠和分泌过程、代谢负担与发酵培养条件对微生物高效表达分泌蛋白的影响以及导致的一系列瓶颈问题。基于以上瓶颈问题,分别从分泌蛋白表达体系、蛋白分泌途径组分、组学研究与发酵条件等方面进行了系统分析并提出相应的优化策略,为提高分泌蛋白的产量提供更多可用的信息与借鉴,旨在为今后利用微生物作为细胞工厂实现外源蛋白的高效分泌生产提供一定的理论基础与技术支持。     

YebF作为载体蛋白所引导的重组蛋白胞外分泌表达途径的研究进展

大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主菌之一,但是由于它大多将重组蛋白分泌到菌体内部,导致重组蛋白不能正确折叠或者被降解而失去活性,使得目的蛋白的提取和纯化过程较为繁琐。解决这些问题的方法之一就是将重组蛋白分泌到胞外培养基中,这样不仅有利于蛋白的正确折叠,也会极大地简化目的蛋白的提取和纯化过程。近年发现的YebF蛋白是由大肠杆菌分泌到胞外培养基中的可溶内源性短肽,大小为10.8kDa;虽然其功能未知,但是YebF可作为载体蛋白与重组蛋白融合从而引导异源蛋白的胞外分泌表达。综述了YebF蛋白的结构及其胞外分泌表达的机理,总结了应用YebF分泌途径成功胞外表达异源蛋白的例子,阐述了利用YebF胞外分泌途径提高目的蛋白表达量的策略,为更多重组蛋白的高效分泌表达提供了理论基础。     

生物支架系统在合成生物学中的应用

合成生物学作为一种新兴的工程化生物学,可以在底盘细胞中引入外源基因模块实现新功能。但是如何将多种外源模块（酶）进行有效地组装从而提高其协同催化功能是急需解决的一个重大问题。由于异源酶在新宿主中存在内源环境适应性问题,限制了酶的生物活性。生物支架系统作为一种有效手段,可以提供有效的多酶组装系统。恰当的生物支架能够提供适应环境的柔性平台,实现多酶体系的表达调控,稳定性组装,利于酶与底物结合的区域化设计。本综述对不同类型的生物支架的研究进展进行了系统的总结。文中根据不同类型支架（蛋白型、核酸型）的特点,介绍了典型的应用范例,论述了每种支架的优势与不足,并对生物支架的常见工作机制做了详细讨论。最后对生物支架在人工细胞器设计和复杂聚合物降解等方面的应用做出展望。     

代谢工程改造酵母生产香料的研究进展

天然产物香料作为食品、药品和日用化学品的添加成分,市场需求高,有着较高的开发利用价值。从动植物中提取香料产物存在来源少、含量低和分离困难等缺点,化学合成香料又存在着安全隐患和污染问题,很难满足市场需求。因此,研究与开发生产天然产物香料的微生物来补充或代替原有的传统提取和化学合成方法具有重要的理论意义和潜在的应用价值。酵母菌作为代谢工程菌株的一类,细胞内具有更好表达异源蛋白的细胞结构和翻译后修饰机制。文章总结了有关对酵母菌进行代谢改造生产萜类、芳香族类及脂肪族类香料化合物的具体实例和研究进展,包括所涉及的宿主菌株、关键酶、代谢途径、改造策略以及发酵条件优化等,并在最后讨论了酵母代谢工程改造生产天然产物香料目前所面临的问题和未来的发展方向。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的研究进展

系统介绍了近年来黑曲霉β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.2)的酶解特征、酶学性质、催化机制、活性中心、生物学功能及应用技术等方面的研究进展,并展望了其应用前景。     

肌酐酶在枯草芽孢杆菌中的异源表达及分泌机制

肌酐酶是用于临床检测肾小球滤过功能的关键酶之一，但目前国内肌酐酶的生产量较低无法满足市场需求，多依赖于国外进口。为了解决这一问题，本研究将恶臭假单胞杆菌肌酐酶基因克隆至原核表达载体pMA5实现肌酐酶在枯草芽孢杆菌1A751中的异源表达。随后通过启动子优化，使肌酐酶的蛋白表达量显著提高到1.08mg/mL，并且胞外肌酐酶的比酶活力达到238U/mg。同时发现肌酐酶可不依赖于信号肽即可实现胞外分泌，因此对肌酐酶在枯草芽孢杆菌中的分泌机制进行研究。通过对经典分泌途径和Holin途径的分析排除、利用Calcein-AM/PI双染色法鉴定表达菌株1AGC的细胞膜不完整，最后通过电子显微镜观察结果表明表达菌株表面存在潜在的泄漏位点，因此证实肌酐酶在枯草芽孢杆菌中通过细胞泄漏的方式，释放到胞外培养基中。本文构建了一株基于细胞泄漏的肌酐酶高产菌株，为肌酐酶的表达和潜在工业化应用提供理论基础，同时也为枯草芽孢杆菌泄漏表达系统提供了一定的研究基础。     

真菌纤维素酶表观遗传修饰的研究进展

组蛋白乙酰化酶编码基因gcn5、蛋白甲基转移酶LaeA及其同源物Lae1、VeA等可通过作用于调节纤维素酶基因及其表达调控因子的表达,进而在转录水平上影响纤维素酶基因的表达。简述了真菌纤维素酶的种类与结构和真菌纤维素酶基因的表达调控机制,重点从DNA甲基化、蛋白甲基化和乙酰化以及非编码RNA等的角度,综述几种主要表观遗传修饰对真菌纤维素酶基因表达作用的研究进展。     

毕赤酵母组成型表达载体的构建及报告蛋白表达评价

目的构建毕赤酵母(Pichia pastoris)组成型分泌表达载体,并表达报告蛋白葡萄球菌核酸酶(staphylococcus nuclease,SNase,NucA),以评价其表达外源蛋白的能力。方法从巴斯德毕赤酵母GS115基因组中PCR扩增毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter,pGAP)片段,克隆至载体pPIC9K中,构建组成型分泌表达载体pGHKα;从金黄色葡萄球菌基因组中PCR扩增编码报告蛋白金黄色葡萄球菌NucA成熟肽的序列nucA,克隆至载体pGHKα中,构建重组表达质粒pGHKα-nucA,经SacⅠ和BglⅡ依次酶切线性化后,电转化至毕赤酵母GS115中;PCR及TB-D平板法筛选阳性重组酵母菌;Tricine-SDS-PAGE检测表达产物;琼脂扩散法检测重组酵母菌表达上清液的核酸酶活性。结果组成型分泌表达载体pGHKα经PCR鉴定,证明构建正确;重组表达质粒pGHKα-nucA经PCR及测序鉴定,证明nucA基因片段正确插入载体pGHKα中;重组酵母菌GS115/pGHKα-nucA经PCR及TB-D平板法检测证明构建成功;表达的目的蛋白相对分子质量约为17 000,表达量约占上清总蛋白的42%,且具有显著的核酸酶活性。结论成功构建了毕赤酵母组成型分泌表达载体pGHKα,其能正确表达报告蛋白NucA,且表达的蛋白能分泌到细胞外,表达效率高,为异源蛋白在毕赤酵母中的安全高效表达奠定了基础。     

微生物胆固醇酯酶的研究进展

胆固醇酯酶,又称为甾醇酯酶,是一种极具开发潜力的生物催化剂。该酶属于α/β水解酶家族,在水溶液中催化胆固醇酯的水解,在有机溶剂中催化酯化反应或酯交换反应合成胆固醇酯。作为一种重要的工业生物催化剂,胆固醇酯酶在造纸工业、医学及食品加工等领域有广阔的应用前景。综述了胆固醇酯酶的资源、结构、异源表达及应用的研究进展,为胆固醇酯酶的深入研究及开发提供了参考。     

微生物降解纤维素机制的分子生物学研究进展

对纤维素酶的分子生物学，主要是该酶对天然纤维性底物的降解机制研究进展作了简要评述，包括纤维素酶的一、二、三级结构、酶分子的多形性、纤维素酶族、酶基因克隆方法及表达和分泌中存在的问题、新酶分子的构建等。并介绍对细胞融合、单克隆抗体、DNA体外定位诱变、活性中心测定和糖基化方法等在纤维素酶降解研究中的应用。     

绿色荧光蛋白基因在枯草芽孢杆菌中的表达

目的探讨异源基因在枯草芽孢杆菌中表达的可行性。方法以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的穿梭质粒为基本骨架,在大肠杆菌中完成含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组表达质粒的构建,通过酶切鉴定筛选阳性克隆,采用电转化的方法,将重组质粒转入枯草芽孢杆菌进行表达,通过检测GFP的存在,评价枯草芽孢杆菌对异源基因的表达。结果重组表达质粒pGJP-GFP酶切鉴定结果与预期片段大小相符。绿色荧光蛋白可在枯草芽孢杆菌中表达,且表达蛋白具有较好的生物学活性。结论利用枯草芽孢杆菌的自身启动子,可以实现外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达。     

稳定表达甲型流感病毒血凝素蛋白的哺乳动物细胞系的建立

目的建立稳定表达甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白的哺乳动物细胞系。方法 PCR扩增流感病毒(A/PR/8/34)全长HA基因,并将其克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT(pDF)中,构建重组表达质粒pDF-HA,将其与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In-CHO细胞,通过体内同源重组使目的基因整合至宿主细胞染色体上。采用Hygromycin B持续压力筛选重组细胞系CHO-HA,通过间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法检测HA蛋白的表达。重组细胞连续培养10代后,采用PCR和IFA法检测细胞中HA的基因遗传和蛋白表达的稳定性。结果重组表达质粒pDF-HA经双酶切及测序,证实构建正确;通过Hygromycin B抗性及IFA,共筛选出20株高表达HA蛋白的重组细胞株,Western blot结果进一步证实,HA蛋白在重组细胞中获得表达,并被切割成HA1和HA2蛋白;连续培养10代后,PCR与IFA方法分别检测到重组细胞HA基因和蛋白的表达。结论已成功建立了稳定表达甲型流感病毒HA蛋白的哺乳动物细胞系,为针对HA蛋白和流感病毒的免疫学检测以及HA蛋白的功能研究提供了靶细胞。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型gC2蛋白在CHO细胞中的表达、纯化及其免疫活性

目的在CHO细胞中表达单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)Ⅱ型gC2蛋白,纯化后检测其免疫活性。方法利用ANTHEWIN等软件分析GenBank中HSVⅡ型gC2的氨基酸序列,筛选抗原表位富集、且亲水性较好的蛋白胞外区片段,选择真核和原核生物均偏爱的密码子,通过OptimumGene软件对基因进行序列优化,化学合成全新的基因序列HSV2-gC2,PCR扩增后,插入pMCE5载体,构建重组表达质粒pMCE5-gC2,转染至CHO细胞中进行真核表达。表达的重组gC2蛋白经亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。将纯化的重组gC2蛋白分别于第0、2、4周经腹腔免疫小鼠,以免疫PBS作为对照,采用间接ELISA法检测免疫小鼠的血清抗体水平;酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测免疫小鼠脾淋巴细胞分泌IFNγ(代表Th1细胞因子)和IL-4(代表Th2细胞因子)的细胞频率。结果重组表达质粒pMCE5-gC2经菌落PCR、双酶切(EcoRⅠ/NotⅠ)及测序证实构建正确;纯化的重组gC2蛋白相对分子质量约为90 000,纯度约为85%,浓度为40μg/ml,可与小鼠抗His单克隆抗体特异性结合;通过3次免疫,小鼠产生了高水平的血清抗体,与免疫前相比,差异均有统计学意义(P0.001);免疫小鼠脾细胞经特异性抗原刺激后,分泌IFNγ和IL-4的细胞频率分别为(13.46±2.832)/106和(19.2±2.48)/106个细胞,均显著高于对照组(P0.001)。结论在CHO细胞中表达了重组gC2蛋白,纯化的蛋白能够激发小鼠产生良好的体液免疫和细胞免疫应答,为进一步研制HSV亚单位疫苗奠定了基础。     

原发性开角型青光眼致病基因MYOC真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建原发性开角型青光眼(POAG)致病基因MYOC的真核表达质粒,并在COS-7细胞中表达MYOC蛋白。方法用RT-PCR法扩增人眼组织(角膜缘)MYOC基因cDNA,纯化回收后,克隆入pGEM-T载体,再亚克隆入真核表达质粒pEGFP-N3,构建重组表达质粒pEGFP-N3-MYOC,转染COS-7细胞,用荧光显微镜观察MYOC蛋白在COS-7细胞中的表达,Western blot分析MYOC蛋白分泌特点。结果经酶切和DNA测序鉴定,证实重组表达质粒pEGFP-N3-MYOC构建正确,荧光显微镜观察MYOC蛋白能在COS-7细胞中表达,并且定位在细胞质中,而绿色荧光蛋白分布在整个细胞内。Western blot结果显示,MYOC蛋白能分泌到细胞外。结论已成功构建MYOC基因真核表达质粒,并能在COS-7细胞中表达MYOC蛋白,为进一步研究POAG发病机制奠定了基础。     

线粒体能量代谢相关miRNA的研究进展

线粒体为真核细胞的能量工厂,其能量代谢与细胞凋亡、自噬和衰老等过程密切相关,在疾病的发生发展以及后续治疗中也发挥着重要作用。microRNAs(miRNAs)为一类广泛存在于真核生物中的单链RNA,可通过降解靶基因或抑制靶基因的翻译来调节蛋白表达。近年来多项研究表明,miRNA还可通过调节线粒体相关基因的表达,调控线粒体的结构及功能,影响线粒体的能量代谢。本文就miRNA的作用机制及其与线粒体能量代谢关系的研究进展作一综述。     

酿酒酵母乙酰辅酶A精细调控合成萜类化合物研究进展

酿酒酵母作为细胞工厂被用来生产多种萜类化合物。乙酰辅酶A为合成萜类化合物的基本前体,细胞质乙酰辅酶A供应不足会导致目标产物产量较低,调控乙酰辅酶A合成是构建目标萜类化合物高产合成途径的重要手段。本文介绍了酿酒酵母乙酰辅酶A作为重要中心碳代谢分子,主要在细胞核组蛋白乙酰化、细胞质丙酮酸脱氢酶支路、线粒体三羧酸循环和过氧化物酶体乙醛酸循环中参与的代谢过程。总结了通过强化酿酒酵母内源丙酮酸脱氢酶支路,引入低三磷酸腺苷（ATP）消耗的异源乙酰辅酶A合成途径,增加辅酶A合成和利用线粒体乙酰辅酶A含量高且对其不渗透的特性进行区域化合成以提高乙酰辅酶A含量的代谢工程策略,旨在为酿酒酵母萜类化合物的高效合成提供借鉴。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E在CHO细胞中的稳定表达

目的在CHO细胞中稳定表达水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白E(gE)。方法PCR扩增VZVgE完整胞外结构域编码基因,克隆至哺乳动物细胞表达质粒PSGHVO中,与DHFR选择性基因和脂质体共转染CHO/dhfr-细胞,筛选稳定分泌人生长激素(hGH)和gE融合蛋白的细胞株。采用ELISA和Western blot方法检测细胞培养上清中hGH和gE融合蛋白的表达,并用Ni2+-NTA柱进行纯化。结果gE基因PCR扩增产物和重组表达质粒PSGHVO-gE的双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳,均可见1500bp的目的基因条带。转染PSGHVO-gE质粒和DHFR基因的细胞培养上清液经ELISA和Western blot,确认有重组蛋白表达,gE表达量约为20mg/L;纯化后蛋白纯度约为90%。结论已在CHO细胞中稳定表达了VZVgE蛋白,为制备VZV表面抗原奠定了基础。     

糖基化基因修饰对重组蛋白表达及活性的影响

蛋白质翻译后修饰是蛋白质结构及功能成熟过程中的重要组成部分,其中的一种重要的翻译后修饰为蛋白质糖基化。许多影响细胞、组织、器官乃至生命的内源性蛋白或外源性重组蛋白(如治疗性重组蛋白或单克隆抗体),在细胞内成熟过程中几乎均会发生蛋白质糖基化修饰,而糖基化修饰的质和量的差异,可能会影响相关蛋白的表达水平、结构及功能。随着治疗性重组蛋白的需求和应用的不断发展,已出现了以改造治疗性重组蛋白为目的的蛋白质糖基化工程技术。该技术主要通过改变用于表达重组蛋白的宿主细胞中参与糖基化修饰的关键酶蛋白(糖苷酶及糖基转移酶),来影响重组蛋白的糖基化,从而改变重组蛋白的表达水平、结构及功能。本文介绍了重组蛋白糖基化修饰的类型及其生物学作用,重组蛋白糖基化修饰改造的策略,其中重点介绍了改变糖基化相关酶蛋白基因的活性的策略,经证明目前该糖基化工程策略是影响重组蛋白的表达及活性十分有效的方式。