葡聚糖接枝型耐碱Protein A介质的层析性能提升研究

Sepharose 4FF微球经环氧活化后与葡聚糖溶液反应,得葡聚糖接枝型琼脂糖微球,再经环氧活化和偶联耐碱型Protein A配基,得葡聚糖接枝型高载量Protein A介质,测定了介质在线清洗稳定性能,并进行了热力学研究. 结果表明,与常规Protein A介质相比,葡聚糖接枝型Protein A介质的最高流速提高约32%,对抗体hIgG的动态载量为60.6 mg/mL,分别为常规介质和MabSelect SuRe介质载量的123%和95%;经40次清洗后,葡聚糖接枝型Protein A介质动态载量为原始载量的92%,远高于常规介质的84%,与MabSelect SuRe稳定性基本一致. 3种介质对抗体的结合均为熵驱动过程,葡聚糖接枝型Protein A介质的吸附热介于MabSelect SuRe和常规Protein A介质之间.     

葡萄球菌蛋白A的纯化新工艺

目的建立一种高效、简便、实用的分离纯化葡萄球菌蛋白A(SPA)的工艺。方法采用超声波破菌和IgG-Sepharose4B亲和层析分离纯化SPA;以Lowry法检测蛋白含量;双向琼脂免疫扩散法测定效价和特异性;用还原和非还原SDS-PAGE法检测纯度和相对分子质量。结果此法制得的3批SPA的蛋白含量分别为4·7、4·4和5·4mg/ml,收率分别为2·70、2·64和3·78g/100g湿菌。对人IgG的免疫双扩散效价均为1:64;与正常人、豚鼠、家兔和小鼠的血清反应均出现一条沉淀线,而与鸡和羊不出现沉淀线。经非还原SDS-PAGE检测只呈现一条蛋白带,相对分子质量约为160000～180000;经还原SDS-PAGE检测呈现两条蛋白带,相对分子质量分别约为67000和34000。结论已成功建立了分离纯化SPA的新工艺。     

应用于抗体药物捕获的耐碱亲和层析介质性能的比较

目的比较应用于抗体药物捕获的耐碱的4种蛋白A亲和层析介质和2种小分子亲和层析介质的性能,为单抗纯化工艺的选择提供参考。方法利用两种单抗纯品(mAb1和mAb2)测定4种蛋白A亲和层析介质MabSelectSuRe、POROS MabCaptureA、Absolute High Cap、TOYOPEARL AF-rProtein A-650F和2种小分子亲和层析介质Mabsorbent A2P HF、Fabsorbent F1P HF在停留时间分别为4、6、8 min时的动态载量;利用含mAb2的发酵液,从回收率和杂质去除方面比较6种亲和层析介质的纯化效果。结果在5%穿透点,各介质对mAb1和mAb2的动态载量在35~73 g/L之间。小分子亲和层析介质Mabsorbent A2P HF纯化mAb2的回收率为89%,其他5种介质纯化mAb2的回收率均≥96%;6种介质纯化mAb2的宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)在2 000 ppm之内,蛋白A残留量在20 ppm之内。结论结合流速、动态载量、回收率和杂质去除效果等指标,可从6种亲和层析介质中挑选适用于抗体类药物下游纯化工艺的耐碱型蛋白A或小分子亲和介质。     

混合模式色谱介质的制备及其在蛋白分离纯化中的应用

随着生物制药技术的迅速发展,生物制品的制备规模和质量要求的提高对下游分离纯化工艺提出了新的要求.如何通过分离纯化手段快速获得目标产物并进一步降低成本是现代生物分离技术研究的热点问题.混合模式色谱技术是一种高效的分离纯化方法,一般兼有多种作用模式,并且其蛋白结合量高、选择性好、洗脱条件温和、具有耐盐吸附等多种特性,可减少...     

混合模式介质的制备及用于清除抗体中蛋白A

针对抗体纯化过程中脱落蛋白A的清除,设计和制备了以N-苄基-N-甲基乙醇胺为功能配基的混合模式层析介质Adhere NUPharose FF,该配基兼有疏水、静电和氢键作用。采用烯丙基缩水甘油醚活化法,并对琼脂糖微球基质的活化和配基偶联条件进行了优化,优化后活化密度达260 μmol·ml^-1以上,配基密度达120 μmol·ml^-1。同时以抗体和蛋白A的混合物为研究对象来考察该介质对抗体中蛋白A的清除能力,结果表明对蛋白A的有效去除率达到83.1%,为抗体制品中蛋白A的清除提供了一种可行性方法。     

席夫碱法制备大孔聚合物肝素亲和层析介质

肝素亲和层析介质因其专一性好、操作条件温和等特点,广泛应用于蛋白分离纯化,本工作以大孔聚丙烯酸酯微球为基质,肝素为配基,利用席夫碱法制备了肝素亲和层析介质。配基偶联经过三步完成,首先将大孔聚丙烯酸酯微球表面环氧基团通过0.5 mol/L H₂SO₄水解为邻羟基,然后将邻羟基氧化为醛基,最后利用醛基与肝素分子的胺基反应将肝素分子固定于微球表面。以溶菌酶为模型蛋白,主要考察了肝素偶联反应的各因素对蛋白结合容量的影响规律,包括肝素浓度、缓冲液pH及浓度、反应时间等,建立了最优偶联肝素配基的方法。所得亲和介质静态结合容量可达40.3 mg/mL,比商品GP-肝素介质高约36%,经1.0 mol/L的氯化钠洗脱,其蛋白回收率达到95%。通过扫描电子显微镜表征微球表面形貌,观察到偶联肝素后的微球仍能保持其大孔结构。考察了该类亲和介质在不同操作流速(31.8～318 cm/h)下的动态结合容量,发现操作流速提高10倍后介质结合容量仅下降12%。经10次重复使用后,动态结合容量仍可保持初始容量的81%。用于混合蛋白模型中分离乳铁蛋白,结果表明具有良好的分离效...     

肺炎链球菌表面蛋白A的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的原核表达、纯化肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,Psp A),并制备多克隆抗体。方法应用ANTHEWIN、DNAstar等分子生物学软件,对Psp A氨基酸序列进行分析,筛选出抗原表位富集区(第33~109个氨基酸),选用原核生物偏爱的密码子优化基因序列,化学合成全新的基因序列pspa,插入质粒p GEX-4T-2和p ET28a(+)中,构建重组表达质粒p GEX-4T-2-pspa和p ET28a(+)-pspa,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。分别纯化带有GST标签和His标签的Psp A重组蛋白GST-Psp A和His-Psp A,以His-Psp A作为免疫原,经背部多点免疫新西兰大耳白兔,间接ELISA法检测血清抗体效价,Western blot法检测血清抗体特异性。结果两种重组表达质粒p GEX-4T-2-pspa和p ET28a(+)-pspa经双酶切鉴定构建正确;表达的两种重组蛋白GST-Psp A和His-Psp A相对分子质量分别约为33 000和18 000,均为可溶性表达,纯化后目的蛋白条带均无降解,纯度约为95%,蛋白浓度分别为2和0.2 mg/ml;制备的兔抗血清效价较高,可达1∶200 000,且特异性较好。结论原核表达并纯化了肺炎链球菌Psp A融合蛋白,并制备了特异性良好的高效价兔抗血清,为下一步建立肺炎链球菌快速检测技术奠定了基础。     

新型人血白蛋白分离介质吸附性能及重组人血白蛋白分离

针对毕赤酵母发酵液中分离重组人血白蛋白(rHSA),采用新型介质IAA-CYS,探讨HSA吸附性能,优化分离条件,实现rHSA高效分离.考察了不同pH和盐浓度下IAA-CYS介质对HSA的吸附,发现pH为4.5是最佳条件,HSA饱和吸附容量达到157.6 mg.mL-1,盐浓度影响较小.测定了不同NaCl浓度和线性流速...     

断裂内含肽介导的亲和介质与亲和标签的应用

应用Cfa断裂内含肽构建了一种新型的亲和纯化系统,并完成对目的蛋白无标签纯化。首先对Cfa断裂内含肽的IN片段与IC片段进行分子改造,通过研究在自由混合条件下的断裂情况,测定了其断裂速率。其次以改造后的IN片段作为配体与环氧活化的琼脂糖微球载体偶联,制备了IN亲和层析介质;IC片段作为亲和标签与目的蛋白GFP融合,并利用IN亲和层析介质实现对目的蛋白进行无标签纯化。结果表明,将IN与IC-GFP片段混合后,30s内即可断裂超过50%,4 h内即可完全断裂;IN亲和层析介质的静态载量为66.78 mg×m L^-1,动态吸附载量约为30 mg×m L^-1;纯化后的绿色荧光蛋白(GFP)纯度达到了96.7%,回收率为29.3%。Cfa断裂内含肽的应用为开发新型亲和纯化技术提供了一种潜在的方法。     

3种不同Protein A亲和层析填料纯化抗CD52单克隆抗体的比较

目的 比较3种Protein A亲和层析填料MabSelect SuRe、Protein A Diamond及UniMab 50纯化抗CD52单克隆抗体的载量及纯化效果.方法 将浓度为1.24 mg/mL的抗CD52单克隆抗体分别流经3种Protein A亲和层析填料,确保保留时间一致,检测流穿液的抗体浓度,以流穿液中...     

一种新型水渣滤料的制备及性能研究

以钢铁企业冶炼生铁时产生的高炉水渣为主要原料,添加黏结剂和成孔剂,制得一种轻质高强的新型水渣滤料。通过正交试验确定了水渣滤料制备的最佳配比和最佳工艺条件,制得的水渣滤料主要性能指标均能达到国家标准。将陶粒和水渣滤料分别填加到曝气生物滤池中进行生物挂膜实验,结果表明:运行两周后,水渣滤料对COD和氨氮的去除率分别达到80%和70%以上,且去除效果优于陶粒。     

壳聚糖微珠亲和层析介质的制备及其初步应用

目的制备壳聚糖(CTS)微珠亲和层析介质,并进行初步应用。方法采用多种化学方法对CTS的表面基团进行改造,使其活化。用此改性CTS进行羊抗人IgG及小牛血清纤维连接蛋白(FN)的纯化。结果此改性的CTS微珠粒径在40￣160μm之间,每克可溶胀至4ml。活化的CTS对人丙种球蛋白的吸附量为15￣25mg/gCTS,对明胶的吸附量为5.8￣6.5mg/gCTS。采用此方法纯化的羊抗人IgG及FN与Sepharose4B法纯化效果一致。结论已制备的壳聚糖微珠亲和层析介质,其性质稳定且价格较低,是一种可以广泛应用的亲和层析介质。     

SPA的高效表达及其亲和介质制备条件的优化

使用M9培养基,以大肠杆菌BL21为宿主菌、pET32a（＋）为载体,在15℃、IPTG浓度为0.8 mmol.L-1、150 r.min-1、诱导时间为4 d的条件下,SPA能够得到高效表达;在SPA∶Sepharose 4B=1∶1（质量体积比）、偶联时间为14 h时,SPA偶联率为89.67%,对IgG的纯化效果最好。     

减电荷聚甲基丙烯酸钠接枝介质的制备及蛋白质吸附性能

离子交换容量（IC）为320mmol/L的聚甲基丙烯酸钠（pMA）接枝型介质（FF-pMA-320）对溶菌酶和γ-球蛋白具有较高的吸附容量,但其传质速率较低。在保持聚合物链长度的前提下,通过乙醇胺与接枝链上的羧基进行电荷中和反应,降低pMA接枝型介质的电荷密度,提升介质的蛋白质传质速率。将FF-pMA-320进行部分电荷中和修饰,制备得到离子交换容量分别为230mmol/L和170mmol/L的减电荷阳离子交换介质,分别命名为pMA-320-R230和pMA-320-R170。采用吸附平衡、吸附动力学和柱穿透实验,研究了溶菌酶和γ-球蛋白在这两种新型介质上的吸附行为,并与初始介质FF-pMA-320进行了比较。结果表明：随着介质的IC值（电荷密度）从320mmol/L降低到170mmol/L,介质对两种蛋白质吸附容量随之减少,这与电荷中和修饰降低蛋白质吸附位点有关。随着接枝聚合物电荷密度的降低,相邻聚合物链之间的静电排斥作用减弱,蛋白质吸附容量降低,造成接枝链的灵活性增加以及蛋白质排阻效应减弱。因此,溶菌酶和γ-球蛋白在pMA-320-R170上的传质速率分别是FF-pMA-320的1...     

Eupergit手性配体交换色谱固定相的制备及应用

介绍了以Eupergit C 250L为载体,L-羟脯氨酸盐为手性配体,通过两者间的"一步交联反应",制备出一种新型的Eupergit手性配体交换固定相。交联反应过程简单、高效、副反应少。尝试通过此大颗粒的Eupergit手性配体固定相对丝氨酸手性对映异构体进行拆分,得到了良好的拆分结果。为将来在工业领域内,通过使用制备型拆分柱来拆分手性氨基酸的设想提供了有利的技术支持。     

氟虫腈为配基的亲和介质制备及鱼类GABA受体纯化

以琼脂糖凝胶(Sepharose)CL-6B为载体,衍生化的氟虫腈为亲和配基,制备亲和层析介质,对其进行FT-IR和XPS表征。用制备的亲和层析介质分离鱼类脑组织中的GABA(γ-氨基丁酸)受体,研究分离蛋白质的效率。结果表明,成功将氟虫腈作为配体偶联到亲和介质上,偶联量为36.68μmol/g胶;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示两条蛋白质条带,其相对分子质量约为44 kD和55 kD。     

一种新型滤料──炉渣滤料性能研究

针对炉渣滤料的过滤性能作了系统的实验研究。实验表明，炉渣滤料具有较大的悬浮物脱除效率和截泥量，且系废料利用，因而具有很大应用价值。在实验的基础上，得到了炉渣滤料阻力损失的模型和过滤模型中的参数，并开发了过滤过程模拟计算软件，可作为新型滤料工艺设计或核算之用。