酿酒酵母细胞表达异源萜类化合物的研究进展

萜类化合物具有可观的经济价值,但是目前的生产过程复杂、产量低。酿酒酵母甲羟戊酸途径为萜类化合物的合成提供直接前体,因此酿酒酵母细胞具有合成异源萜类化合物的天然优势。对酿酒酵母甲羟戊酸途径的清晰认识是对其进行有效利用的基础,本文从代谢途径、关键酶的特点和全局调控机制3个方面对该途径进行了介绍。从代谢途径的构建和优化、模块与底盘细胞的适配、模块构建及组装方式的角度概述了酿酒酵母细胞异源合成单萜、倍半烯萜、二萜、三萜类化合物的研究进展。指出实现酿酒酵母高效合成萜类化合物所需要解决的基础问题是对酿酒酵母甲羟戊酸途径进行更为全面了解和对萜类化合物的天然代谢途径进行明确解析;另外,合成生物学的进一步发展也将为此提供应用基础。     

酿酒酵母乙酰辅酶A精细调控合成萜类化合物研究进展

酿酒酵母作为细胞工厂被用来生产多种萜类化合物。乙酰辅酶A为合成萜类化合物的基本前体,细胞质乙酰辅酶A供应不足会导致目标产物产量较低,调控乙酰辅酶A合成是构建目标萜类化合物高产合成途径的重要手段。本文介绍了酿酒酵母乙酰辅酶A作为重要中心碳代谢分子,主要在细胞核组蛋白乙酰化、细胞质丙酮酸脱氢酶支路、线粒体三羧酸循环和过氧化物酶体乙醛酸循环中参与的代谢过程。总结了通过强化酿酒酵母内源丙酮酸脱氢酶支路,引入低三磷酸腺苷（ATP）消耗的异源乙酰辅酶A合成途径,增加辅酶A合成和利用线粒体乙酰辅酶A含量高且对其不渗透的特性进行区域化合成以提高乙酰辅酶A含量的代谢工程策略,旨在为酿酒酵母萜类化合物的高效合成提供借鉴。     

放线菌聚酮类化合物的合成生物学研究及生物制造

聚酮化合物具有广泛的药用活性和极高的经济价值,但如何高效、经济、绿色、环保地合成聚酮化合物是目前急需解决的问题。随着合成生物学的发展及分子生物学技术的进步,不断有新的技术和策略被用于聚酮化合物的生物制造。本文介绍了聚酮化合物生物制造中的关键酶、前体物质及代谢途径等,分析了通过CRISPR技术及翻译后修饰代谢工程优化代谢调控网络;通过替换及优化启动子等手段改造与优化代谢途径;通过构建简单、高效的异源表达系统等策略提高聚酮化合物的生物制造效率等。在此基础上对红霉素、阿维菌素、多杀菌素的合成生物学研究的最新进展进行了总结,进而对当前聚酮化合物生物制造面临的产量及效率低下等问题和可能的解决途径,如平衡初级代谢与次级代谢,构建新型、优势底盘细胞及代谢网络的重新设计与改造等进行了展望。     

工程化酿酒酵母合成植物三萜类化合物

三萜类化合物如甘草次酸、皂苷等是许多药物在细胞内发挥药理活性的主要存在形式,可作为药物的主要活性成分,有些还可作为甜味剂等。但是萜类化合物在天然植株中含量很低,不能很好地对其开发和利用。随着萜类物质代谢中关键酶的发现,整个萜类代谢途径变得清晰。近年来合成生物学快速发展,为利用微生物发酵生产三萜化合物奠定了基础。综述了酿酒酵母中三萜化合物的合成途径及在此途径中起重要作用的细胞色素单氧化酶的研究进展。     

微生物合成植物天然产物的细胞工厂设计与构建

植物天然产物结构多样,具有丰富的生理活性与功能。利用微生物细胞工厂生产来源稀缺、获取难度大的植物天然产物具有经济可行、环境友好等优势。本文系统介绍了萜烯、黄酮以及生物碱的生物合成途径及其关键酶,阐述了差异转录组学、同功酶挖掘等途径解析与重构的方法。指出关键酶改造、途径动态调控、代谢区室化与代谢网络再平衡是增大外源途径代谢通量、抑制副产物合成、降低产物毒性与菌株代谢负担、提高目标产物合成能力的有效策略。提出了解析合成植物天然产物关键酶在微生物中的催化特异性机制、开发外源途径的高效组装方法等进一步提高微生物细胞工厂生产效率的建议。     

低甘油产率的酿酒酵母工程菌构建研究进展

酿酒酵母具有安全、遗传背景清楚、生长速度快、高糖耐受性、高乙醇产量以及高胁迫耐受性等特性,是乙醇生产较为理想的细胞工厂.甘油是酿酒酵母发酵产乙醇过程中的一种主要伴生副产物,过量表达甘油影响糖醇转化率.通过基因工程改造甘油代谢和乙醇生产途径,是降低甘油产量和提高乙醇转化率的有效策略.首先分析改造酿酒酵母细胞中甘油和乙醇代谢路径,阐明甘油在酿酒酵母中生理功能;然后,根据甘油合成途径、分解途径和NAD+/NADH代谢途径,分析低甘油产率的酿酒酵母工程菌构建的技术路径,比较各种基因改造策略对甘油合成和乙醇产率的影响;最后,针对基因整合技术、工程菌遗传稳定型以及工程菌代谢负担加重方面存在的问题,提出可供参考的解决方案,为构建酿酒酵母工程菌高效生产乙醇提供参考.     

大肠杆菌乙酰辅酶A代谢调控及其应用研究进展

利用生物法合成生物基化学品具有高效、绿色、可持续发展等优势。乙酰辅酶A作为细胞内物质代谢的重要中间产物,是利用生物转化法合成许多生物基化学品的重要前体,在微生物碳代谢过程中发挥着枢纽作用。本文综述了大肠杆菌乙酰辅酶A的合成、代谢调控策略及其重要应用,重点总结了乙酰辅酶A的合成途径及近期发展的提高乙酰辅酶A胞内通量的代谢调控策略,包括乙酸途径的代谢调控、丙酮酸合成乙酰辅酶A途径的代谢调控、中心碳代谢途径的代谢调控、β氧化合成乙酰辅酶A途径的代谢调控和乙酰辅酶A合成新途径的发掘,进一步展望了提高乙酰辅酶A供给的策略,利用基因组编辑技术构建合成乙酰辅酶A为前体化学品细胞工厂的方法。     

微生物合成2,3-丁二醇的代谢工程

2,3-丁二醇（2,3-BD）是一种重要的微生物代谢产物,广泛应用于食品、医药、化工等多个领域。微生物合成2,3-BD的效率不高一直制约着其生物制造工业化进程,应用代谢工程的理论和方法优化微生物的代谢途径有望解决这一问题。本文全面总结了近年来微生物合成2,3-BD研究过程中的菌株改造和构建技术,包括过表达合成途径中的关键酶编码基因、敲除旁路代谢途径关键酶编码基因、应用辅因子工程手段对天然菌株代谢网络进行重新设计和合理改造,以及利用合成生物学技术在模式菌株中构建全新的代谢途径,实现2,3-BD的高效生物合成。最后,本文对未来的研究方向进行了展望,提出了进一步利用先进的合成生物学方法构建高效细胞工厂的指导性建议。     

微生物合成2,3-丁二醇的代谢工程

2,3-丁二醇(2,3-BD)是一种重要的微生物代谢产物,广泛应用于食品、医药、化工等多个领域。微生物合成2,3-BD的效率不高一直制约着其生物制造工业化进程,应用代谢工程的理论和方法优化微生物的代谢途径有望解决这一问题。本文全面总结了近年来微生物合成2,3-BD研究过程中的菌株改造和构建技术,包括过表达合成途径中的关键酶编码基因、敲除旁路代谢途径关键酶编码基因、应用辅因子工程手段对天然菌株代谢网络进行重新设计和合理改造,以及利用合成生物学技术在模式菌株中构建全新的代谢途径,实现2,3-BD的高效生物合成。最后,本文对未来的研究方向进行了展望,提出了进一步利用先进的合成生物学方法构建高效细胞工厂的指导性建议。     

胶红酵母产类胡萝卜素的研究进展

类胡萝卜素属于萜类化合物,在染色、食品、医药等领域具有很高的应用价值。类胡萝卜素常采用化学合成法、植物提取法和微生物发酵法得到,其中微生物发酵法最具发展前景。综述了胶红酵母产类胡萝卜素的代谢途径、优化菌株培养策略及类胡萝卜素提取策略,并介绍了利用基因工程手段调控关键酶基因的表达水平来提高类胡萝卜素产量及控制代谢途径筛选类胡萝卜素高产菌株,为类胡萝卜素的工业化生产提供了理论依据。     

Asymmetric bioreduction of γ- and δ-keto acids by native carbonyl reductases from Saccharomyces cerevisiae

Optically pure (R)-γ- and (R)-δ-lactones can be prepared by intramolecular cyclization of chiral hydroxy acids/esters reduced asymmetrically from γ- and δ-keto acids/esters using Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) as a whole-cell biocatalyst. However, some of the enzymes catalyzing these reactions in S. cerevisiae are still unknown up to date. In this report, two carbonyl reductases, OdCR1 and OdCR2, were successfully discovered, and cloned from S. cerevisiae using a genome-mining approach, and overexpressed in Escherichia coli (E. coli). Compared with OdCR1, OdCR2 can reduce 4-oxodecanoic acid and 5-oxodecanoic acid asymmetrically with higher stereoselectivity, generating (R)-γ-decalactone (99% ee) and (R)-δ-decalactone (98% ee) in 85% and 92% yields, respectively. This is the first report of native enzymes from S. cerevisiae for the enzymatic synthesis of chiral γ- and δ-lactones which is of wide uses in food and cosmetic industries.     

重组酿酒酵母生物合成菜油甾醇

菜油甾醇作为甾体药物（孕酮、雄烯二酮、氢化可的松等）的重要合成前体已受到国内外研究学者的广泛关注。首先通过生物信息学分析,筛选了10种不同来源的7-脱氢胆固醇还原酶DHCR7,并采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）内源的ERG5基因替换成不同来源的DHCR7基因,构建了菜油甾醇合成菌株。结果发现整合来源于Pangasianodon hypophthalmus DHCR7的菌株Zw507表现出最高的菜油甾醇的产量216.93 mg/L。进一步筛选了10种酵母内源启动强度较强的启动子来与PhDHCR7基因进行组合,结果显示以TEF1p为启动子时菜油甾醇的产量最高可达253.35 mg/L。为了进一步提高菜油甾醇产量,增加了DHCR7表达盒在酵母基因组上的拷贝数。当拷贝数为3个时,菜油甾醇的产量达到最高302.27 mg/L。最终,通过5 L发酵罐进行补料分批发酵,实现了916.88 mg/L菜油甾醇产量。该菌株可作为后续甾体药物生物合成的优良底盘细胞。     

Increased sedimentation of a Pseudomonas–Saccharomyces microbial consortium producing medium chain length polyhydroxyalkanoates

Concerns about feasibility,separability,settleability,efficiency once hampered studies on polyhydroxyalkanoates(PHAs) production,which mainly focused on single strain microorganism or activated sludge rather than artificial microbial consortia.Here,a medium chain length PHAs(mcl-PHAs) producing Pseudomonas-Saccharomyces consortium with xylose as the main substrate was studied.Mcl-PHAs accumulation increased from 12.69 mg·L~(-1) to 152.3 mg·L~(-1) without any optimization method.The presence of Saccharomyces cerevisiae,though in a relatively low concentration,improved the sedimentation of cell mass of the mixed culture by 60%.Reasons for better sedimentation of the consortium were complex:first,the length of Pseudomonas putida increased two to three times in the consortium;second,the positive surface charge of P.putida was neutralized by S.cerevisiae;third,the adhesion proteins on the surface of S.cerevisiae interacted with the P.putida.     

产蒎烯人工酵母细胞的构建

蒎烯可衍生为高能量密度燃料,但在酿酒酵母中的全生物合成却未见报道。酿酒酵母由于拥有强大的蛋白表达和翻译后修饰系统以及完整的内膜系统,相比于大肠杆菌等原核生物更适于P450等蛋白的表达,因此将酿酒酵母作为宿主细胞,对于蒎烯或者其他物质实现如“疯狂碳环”的高能量化是至关重要的。本研究在酿酒酵母底盘中表达内源焦磷酸香叶酯合成酶（ERG20）的突变体ERG20^ww和火炬松来源的蒎烯合酶（PtPS）构建了蒎烯的合成路径。通过截短PtPS N端2～51位氨基酸残基（tPtPS）,蒎烯产量较初始产量（0.329 mg·L^-1）提高了2.23倍。在过表达异戊二烯焦磷酸异构酶（IDI1）和RNA聚合酶Ш负调控因子（MAF1）的基础上,表达ERG20^ww和tPtPS的融合蛋白,蒎烯产量进一步提高了5.16倍。通过将内源基因ERG20启动子原位替换为弱启动子HXT1,下调ERG20的转录,蒎烯的产量提高了26.0%。最终通过调节发酵过程中的培养基pH使蒎烯产量达11.7 mg·L^-1,较初始产量提高了34.5倍。本研究在酿酒酵母中实现蒎烯的从头合成,并获得已知蒎烯摇瓶水平的最高产量。     

Impact of oxygen supply on production of terpenoids by microorganisms: State of the art

Terpenoids are a class of high value-added natural products with a variety of biological functions. Genetically engineered microorganisms, such as those of Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae, have merits in producing plant or fungus-derived terpenoids, due to their mature genetic manipulation, simple nutrient demand and fast growth. Oxygen, as a key environmental factor, is particularly important to microbial metabolism and growth, and suitable oxygen supply is viewed as a prerequisite for realizing highly efficient production of terpenoids by engineered microorganisms. In this article, the role of oxygen in regulating terpenoid bioproduction is overviewed from the viewpoints of cellular carbon metabolism, energy metabolism and terpenoid anabolism. Strategies on adjusting oxygen availability to microorganisms, including genetic modification of cellular metabolism related with oxygen utilization, are summarized and discussed, to provide helpful information for further improvement of terpenoid biosynthesis by microbes.     

Delivery of CRISPR/Cas9 by Novel Strategies for Gene Therapy

Precise editing of the genome of a living body is a goal pursued by scientists in many fields. In recent years, CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/Cas (CRISPR-associated) genome-editing systems have become a revolutionary toolbox for gene editing across various species. However, the low transfection efficiency of the CRISPR/Cas9 system to mammalian cells in vitro and in vivo is a big obstacle hindering wide and deep application. In this review, recently developed delivery strategies for various CRISPR/Cas9 formulations and their applications in treating gene-related diseases are briefly summarized. This review should inspire others to explore more efficient strategies for CRISPR system delivery and gene therapy.