^60Coγ射线照射淋巴细胞诱导PIG3和GADD45基因mRNA变化

用60Coγ射线照射正常人外周血永生化淋巴细胞系后,初步分析受照细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的改变状况,并探讨上述基因作为辐射生物剂量计的可能性及意义.用60Coγ射线照射淋巴细胞,采用不同剂量(0～10Gy)照射和照射后不同时间点(0～72h)收集细胞,抽提mRNA,用Real-time PCR检测细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的变化.结果表明,正常人外周血永生化淋巴细胞系中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随照射剂量的增高而增加,并呈现出剂量效应关系.5Gy剂量60Coγ射线照射后,淋巴细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随时间的推移不断增高,在8h时均达到最高,随后开始降低.PIG3和GADD45基因对辐射均较敏感,其表达具有良好的剂量效应和时间效应关系,但相比而言,PIG3的表达随照射剂量和照射后时间的变化更加显著,更有潜力作为生物剂量计以满足实际需要.     

低剂量γ射线辐照对人淋巴母细胞基因表达转录谱的影响

为探讨低剂量电离辐射生物效应作用机制,本文研究了不同剂量单次辐照后,人淋巴母细胞基因表达转录谱的变化。采用0．1Gy、0．5Gy和1．0Gy剂量的γ射线照射人淋巴母细胞,未照射细胞为对照组。照射后4h提取细胞总RNA,用含有45033个基因的人类全基因组表达谱芯片检测分析。对差异表达基因进行层次聚类分析、基因本体论分析和通路分析,并用实时荧光定量PCR验证。结果表明,3个剂量组均上调表达的基因1330个,下调表达的基因1002个。基因表达量与吸收剂量相关的基因共18个,其中与剂量正相关的基因16个,负相关的基因2个。层次聚类分析结果表明,4个实验组中,0．1Gy和1．0Gy照射组差异表达基因相似程度最高。这些差异表达的基因涉及到多条通路,如细胞周期、p53信号通路、碱基切除修复、RNA转运和内质网蛋白加工等。实时荧光定量PCR检测结果表明,CASP9（caspase9）mRNA在照射后4h随吸收剂量表达变化与基因芯片检测结果一致。基因芯片筛选出的差异表达基因有助于阐明低剂量辐射生物效应作用机理,与辐射剂量相关的差异表达基因有可能成为低剂量辐射暴露的生物剂量计。     

5 cGyγ射线照射正常人淋巴母细胞基因表达转录谱的变化

应用基因芯片技术分析5cGγ低剂量60^Coγ射线照射正常人淋巴母细胞（AHH-1）后基因转录产物水平变化,探讨低剂量辐射对基因表达的影响规律。5eGy印Co7射线照射AHH-1细胞后4h,提取总RNA,用包含有14112个基因探针的人类cDNA芯片分析基因转录谱,照射组与对照组细胞的基因表达量差异比值大于2或小于0．5,两次检测结果一致的基因点为有效差异表达基因;用RT-PCR进一步验证部分差异表达基因;Western blot分析蛋白表达变化。结果筛选出了11个表达上调基因,9个表达下降基因：RT-PCR检测结果与芯片结果相一致,包括Connexin43、BMPR2、NOL6、IDC51760、LYK5等基因;Western blot证实Connexin43基因在翻译水平表达亦增加。实验结果表明所筛选出的差异表达基因有助于阐述低剂量辐射生物效应机理,部分基因有可能成为低剂量辐射暴露的生物标志物。     

~(60)Coγ射线照射人血淋巴细胞诱导p53相关基因mRNA表达水平的变化

采用不同剂量(0~10 Gy)60Coγ射线照射人外周血淋巴细胞,通过抽提mRNA,采用real-timePCR检测不同剂量照射后淋巴细胞中GADD45和CDKN1A基因mRNA表达水平的变化。筛选出最佳照射剂量(5 Gy)后,用该最佳照射剂量照射淋巴细胞,检测不同时间点(0~72 h)淋巴细胞中GADD45和CDKN1A基因mRNA表达水平的变化。结果表明,淋巴细胞中GADD45和CDKN1A基因mRNA的表达水平随照射剂量的增加而增加,并呈现出剂量效应关系。在5 Gy最佳剂量照射后,淋巴细胞GADD45基因mRNA表达水平随时间的推移不断增高,在8 h时达到最高,随后开始逐渐降低;淋巴细胞CDKN1A基因mRNA表达水平随时间的推移未见明显变化趋势。淋巴细胞系中GADD45和CDKN1A基因mRNA的表达水平与照射剂量均有较好的剂量效应关系,两者均有可能作为电离辐射的生物剂量计来估算受照剂量水平。     

基因芯片技术分析20 cGy γ射线照射人淋巴母细胞中差异表达的基因谱

应用基因芯片技术对20 cGy ^60Coγ射线照射的人淋巴母细胞和对照细胞中的mRNA表达水平进行对比杂交分析,探索差异表达基因。结果发现在所分析的14112条日的基因中差异表达显著的基因（2倍以上差异）有83条,其中表达上调的有21条,表达下降的有62条,这些基因表达产物涉及到信号转导、细胞周期调节、免疫相关蛋白、细胞骨架与运动等功能基因。表明低剂量辐射对多种功能基因表达产生了影响,是调控细胞辐射反应最基本的分子基础。     

X射线诱导人外周血淋巴细胞GADD45和p21基因表达上调

应用实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,定量分析不同剂量X射线体外照射对人外周血淋巴细胞GADD45和p21基因表达的影响,探讨了运用mRNA水平变化作为电离辐射生物剂量计的可能性。结果表明:经1、2、3、5Gy X射线照射后24h,GADD45和p21基因表达均明显上调。GADD45基因表达在1-5Gy照射剂量范围内呈指数相关。p21基因表达在1-3Gy照射剂量范围内呈线性剂量效应关系,但5.0Gy照射后,其表达不再继续增加。结果表明,X射线照射后人外周血淋巴细胞GADD45和p21基因的表达在一定剂量范围内呈剂量依赖性上调,GADD45更适合发展为核事故受照射人员的分子生物剂量计。     

X射线全身照射对小鼠脾细胞cyclin B1 和cdc2基因转录水平的影响

采用Northern blot杂交法研究了低、高剂量X射线全身照射后不同时间小鼠脾细胞cyclin B1和cdc2基因转录水平的变化。结果表明,75mGy X射线全身照射后2h及12－24h小鼠脾细胞cyclin B1 mRNA表达量略有升高,分别为假照组的1.25、1.27和1.22倍,48h回降至假照水平;而2.0Gy照射后4h开始下降,12h降至最低,与假照组相比降低了39％,48h恢复至假照组水平。同时观察了cdc2 mRNA表达量的变化,结果表明,与假照组相比75mGy X射线全身照射后2－48h的各时间点小鼠脾细胞cdc2 mRNA表达量未见明显变化;而2．0Gy照射后的时程变化与相同剂量照射后cyclin B1的变化基本一致。结果提示：低剂量辐射可诱导小鼠脾细胞cyclin B1转录水平增高,进而促进其细胞周期进程,但对cdc2转录水平无影响;相反,较高剂量辐射可诱导cyclin B1和cdc2转录水平均明显降低,最终发生G2期阻滞。     

Egr-IFNγ重组质粒的构建和在B16细胞中的辐射诱导表达

小鼠IFNγ cDNA基因连接到Egr-1启动子的下游构建成Egr-IFNγ重组质粒,利用质脂体介导转染B16细胞,用ELISA方法检测x射线照射后IFNγ表达的剂量效应和时程。结果表明,实验组的表达水平明显高于对照组,其中20Gy和2Gy照射组高于其它实验组(p<0.01)。26y照射后6h IFNγ表达量最高(p<0.01)。转染后的B16细胞每隔24h接受2Gy x射线照射,结果显示第一次照射后表达量最高(p<0.01),然后逐渐降低。结果提示电离辐射可激活Egr-IFNγ重组质粒,并调节IFNγ基因表达,这项研究可能对肿瘤治疗的研究有一定的意义。     

电离辐射联合顺铂对人肺癌细胞中BTG3基因表达的影响

加速器产生的6-MV X-射线一次性照射体外培养的人肺腺癌细胞株A549和SPCA-1,细胞的吸收剂量分别设置为0、1、3、5和8 Gy,细胞照射后24 h及单次接受5 Gy照射后6、12和24 h后取样;X-射线联合顺铂对BTG3表达的影响研究设立单纯照射组(5 Gy)、顺铂处理组(20μmol·L-1顺铂)和联合处理组(5 Gy+20μmol·L-1顺铂),上述实验均以未给予任何处理的细胞为对照组;采用Western blot及RT-PCR法检测受到不同剂量电离辐射及照射后不同时间肿瘤细胞中BTG3表达水平。Western blot与PCR检测结果均显示,A549和SPCA-1细胞在受到不同剂量的X-射线照射后24 h,其BTG3蛋白及mRNA表达量均明显增加,并随电离辐射剂量的增加而增加,与对照组比较有统计学差异(t=5.25-15.75,p0.05);照射后不同时间检测结果显示,细胞在X-射线照射4 h后BTG3蛋白及mRNA的表达量即开始上升,并持续到照射后24 h,与照射前相比有统计学差异(t=7.52-11.18,p0.05);联合处理组BTG3的表达量均明显高于单纯照射组、顺铂处理组和对照组(t=7.02-15.86,p0.05)。电离辐射联合顺铂可以上调肺癌细胞株中BTG3的表达,BTG3基因有可能作为肺癌放化疗的靶基因。     

X射线照射后EL-4细胞p16mRNA和Pl6蛋白表达的变化

采用RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)半定量方法检测p16基因转录水平的变化,采用免疫细胞化学方法检测蛋白表达,观察x射线照射对离体培养的EL-4细胞pi6基因转录及蛋白表达的影响,证实pi6基因转录表达在辐射诱导EL-4细胞G1期阻滞中的重要作用.结果表明,2.0Gy x射线照射后2-48h,EL-4细胞p16mRNA水平增高,照射后72h恢复正常水平.P16蛋白表达于照射后2h开始增高,照射后12h P16蛋白表达非常显著高于对照组(p＜0.01).剂量-效应实验表明,0.5-6.0Gyx射线照射后12h,EL-4细胞p16mRNA水平明显提高.2.0、4.0、6.0Gy组P16蛋白表达均非常显著增加(分别P＜0.01).研究证实,电离辐射能够诱导EL-4细胞p16基因转录及蛋白表达增高,其增幅呈现明显的剂量依赖性.提示辐射诱导pi6基因转录表达增加在辐射诱导EL-4细胞G1期阻滞中发挥重要作用.     

钴-60伽玛射线诱导淋巴细胞γH2AX表达的研究

采用流式细胞术检测60Coγ-射线照射后γH2AX表达的量效和时程关系,同时探讨紫外线联合60Coγ-射线照射后γH2AX的表达情况。结果表明,不同剂量60Coγ-射线照射后γH2AX表达量与照射剂量之间呈现明显的剂量效应关系。4 Gy 60Coγ-射线照射后,γH2AX的表达在1 h达到峰值,随后逐渐减少。与假照组相比,单纯紫外线照射组γH2AX表达增加,一直稳定维持约6 h左右,随后开始减少。紫外线联合60Coγ-射线照射组与单纯60Coγ-射线照射比较,γH2AX的表达无显著性差异。结果提示采用流式细胞术检测γH2AX的表达估算受照剂量具有可行性,该法有望成为估算辐射剂量的新方法。     

X射线照射后EL-4细胞p16mRNA和P16蛋白表达的变化

采用RT?PCR(逆转录聚合酶链反应)半定量方法检测p16基因转录水平的变化,采用免疫细胞化学方法检测蛋白表达,观察X射线照射对离体培养的EL?4细胞p16基因转录及蛋白表达的影响,证实p16基因转录表达在辐射诱导EL?4细胞G1期阻滞中的重要作用。结果表明,2.0GyX射线照射后2—48h,EL?4细胞p16mRNA水平增高,照射后72h恢复正常水平。P16蛋白表达于照射后2h开始增高,照射后12hP16蛋白表达非常显著高于对照组(p<0.01)。剂量?效应实验表明,0.5—6.0GyX射线照射后12h,?4细胞p16mRNAEL水平明显提高。2.0、4.0、6.0Gy组P16蛋白表达均非常显著增加(分别p<0.01)。研究证实,电离辐射能够诱导EL?4细胞p16基因转录及蛋白表达增高,其增幅呈现明显的剂量依赖性。提示辐射诱导p16基因转录表达增加在辐射诱导EL?4细胞G1期阻滞中发挥重要作用。     

特大剂量γ射线照射的染色体畸变剂量效应曲线

为准确估算大剂量事故受照者的生物剂量,拟合6—22Gy照射后染色体畸变剂量效应曲线。采用60Coγ射线照射离体人血,浓集有核细胞,一步法培养52h、68h和72h收获制片。计数双(多)着丝点 环数目,比较不同培养时间畸变差异,拟合剂量效应曲线及数学方程。用大剂量事故受照者的剂量结果对曲线进行验证。实验表明,大剂量照射后需适当延长细胞培养时间,52—72h获得的染色体双 环畸变率无明显差异。新拟合的剂量效应曲线符合线性平方模型Y=-2.269 0.776D-7.868×10-3D2。经事故剂量验证结果可靠。本研究首次建立了6—22Gy照射后染色体双 环剂量效应曲线及数学方程,为特大剂量照射后的准确剂量估算提供了可依据的方法。     

用BrdU法研究γ射线外照射诱发外周血淋巴细胞HPRT基因突变

用5－溴脱氧尿嘧啶（BrdU）法检测，不同剂量γ射线外照射诱发正常人外周血淋巴细胞HPRT基因突变频率（MFs），并研究其剂量效应关系，抽取正常成年人静脉血，分成5组，分别用0.0-4.0Gy的不同剂量γ射线照射，全血培养后用BrdU法检测淋巴细胞HPRT基因MFs。结果表明，正常人外周血淋巴细胞的MFs随外照射剂量的增加而上升，且剂量效应关系符合线性平方模型，研究证明了BrdU法是一种快速、简便、较敏感的检测外照射诱发HPRT基因突变的方法，HPRT基因辐射突变可作为生物剂量计。     

辐射敏感基因Pig-a、Gadd45α和Hprt作为潜在生物剂量计的实验研究

为了提高对辐射遗传损伤效应的检测能力,同时建立一种快速简便的生物剂量估算方法,选择Piga、Gadd45α及Hprt 3个基因,运用其m RNA表达水平的变化,筛选可能作为电离辐射生物剂量计的辐射敏感基因。采用RT-qPCR检验非放射从业健康人群(对照组)和放射从业人员(暴露组)外周血中目的基因的相对表达量,分析辐射敏感基因本底表达量的平均值、波动范围和变异系数;应用不同剂量(0 Gy、0.10 Gy、0.25 Gy、0.50 Gy、1.00 Gy、2.00 Gy、5.00 Gy)的X射线照射健康成年人外周血,6 h后用RTqPCR检验目的基因的相对表达量,二项式曲线回归分析存在的剂量–效应关系。结果表明:Pig-a、Gadd45α基因在对照组中本底水平差异较小;Hprt基因本底水平差异较大,变异系数大于20%;Hprt基因在对照组中表达量高于暴露组;Gadd45α基因与Pig-a基因在对照组中的表达量低于暴露组,两组比较有统计学意义(p0.05)。Gadd45α、Pig-a基因表达量的本底水平与照射剂量存在剂量–效应关系,提示Pig-a基因与Gadd45α基因表达量的变化可能作为电离辐射生物剂量计应用。     

微剂量及微剂量辐射效应

介绍发生在分子水平的原发辐射效应,射线能量在微组织水平的沉积,次级电子微剂量效应在细胞损伤中的作用,以及基因微剂量效应对细胞存活的影响,为定量描述各种微观辐射效应,更加准确认识和理解低剂量辐射诱导的各种生物效应,科学评估低剂量辐射的健康危害,引出微剂量和微剂量事件等术语和概念。     

低剂量X射线全身照射对小鼠脾细胞糖皮质激素受体表达的影响

采用放射性配体结合法,观察了不同低剂量X射线全身照射对小鼠脾细胞糖皮质激素受体(GCR)表达的影响及75mGy全身照射后GCR表达的时程变化.结果显示,25、50、75mGy X射线全身照射后8h小鼠脾细胞GCR表达明显下降;75mGy X射线全身照射后4h GCR表达开始下降,8hGCR表达显著低于对照组.低剂量X射线全身照射可降低小鼠脾细胞GCR的表达,提示GCR表达下调可能在低剂量辐射免疫增强效应中发挥作用.     

辐射诱导细胞周期调控和DNA损伤反应相关基因表达变化的实验研究

采用实时定量PCR技术检测小鼠胸腺和脾脏基因表达对X射线全身照射的反应,为探索可行的辐射生物标志物打下实验基础。研究中选用细胞周期调控和DNA损伤反应相关基因Cdkn1a、Ccnd1、Ccnb1、Gadd45a、Atm和Fdxr,以Gapdh为参考基因,观察0.5、1、2、4、6 Gy X射线全身照射后4和24小时上述基因在胸腺和脾脏的相对表达量的变化。同时计数骨髓细胞涂片嗜多染红细胞(PCE)的微核率进行对比。结果显示,上述6种基因对电离辐射全身作用都出现变化,但以Cdkn1a、Ccnd1和Ccnb1三者对全身照射的剂量效应关系较为明显,其中Cdkn1a和Ccnd1基因的表达随辐射剂量增加而升高,Ccnb1基因的表达随辐射剂量增加而下降。剂量效应曲线可拟合为线性-平方方程,其相关系数r为0.851～0.998,p0.05～0.01。但与嗜多染红细胞微核率进行对比,Ccnd1和Ccnb1的表达只有部分结果与之具有显著的相关关系。Cdkn1a的表达量则不仅随辐射剂量增加而升高,而且与嗜多染红细胞微核率的剂量-效应曲线明显相关,在两器官和两时间点其相关系数为0.950～0.975,p0.01。另一方面Cd-kn1a表达量变化的幅度较大,照射后4小时和24小时胸腺的最高表达量分别为11.2和11.3倍,脾脏的最高表达量分别为20.6和9.3倍。鉴于实时定量PCR技术适用于快速、高通量检测,通过进一步在人体观察验证,Cdkn1a基因表达变化有可能成为研制新的辐射生物剂量计的候选者。     

60Co γ射线照射对培养小鼠骨髓基质细胞IL-6表达的影响及机制研究

观察了^60Coγ射线照射对培养小鼠骨髓基质细胞（BMSCs)的白细胞介素－6（IL－6）mRNA及蛋白表达的影响。采用Dexter方法体外培养小鼠BMSCs,8.0Gy^60Coγ射线照射后用放射免疫法测定培养上清液中IL－6的浓度,应用逆转录聚合酶链式反应（RT－PCR）的方法检测IL－6的mRNA表达,同时与NF－KB抑制剂PDTC或地塞米松预处理的BMSCs相比较。结果表明,培养小鼠BMSCs在正常情况下低表达IL－6,辐射后2h时其mRNA水平表达升高,4h时达峰值,之后开始下降;其蛋白表达在2h时开始升高,8－12h时达峰值,24h时基本恢复正至正常水平;而BMSCs在受照射前2h用PDTC或地塞米松预处理后,辐射并不引起IL－6mRNA表达的改变。结果显示,^60Coγ射线照射能够激活培养小鼠BMSCs细胞IL－6基因的转录,使细胞分泌IL－6增多,其机制可能与照射引起的NF－KB活化有关。     

低剂量X射线对小鼠睾丸生精细胞中凋亡诱导因子变化的影响

采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(Strept actividin-biotin complex,SABC),观察低剂量X射线照射后小鼠睾丸各类生精细胞中(Apoptosis inducing factors,AIF)的表达变化;采用逆转录多聚酶链反应(Reverse transfer polymerase chain reaction,RT-PCR)法观察AIF的mRNA水平变化.研究低剂量X射线对小鼠睾丸生精细胞中凋亡诱导因子AIF蛋白及mRNA水平的影响.研究发现,0～0.2Gy照射后,小鼠睾丸各类生精细胞不同程度表达AIF,以精原细胞和精母细胞表达为主,精子细胞和精子则表达相对较少.AIF表达量与吸收剂量有相关性,0.075Gy照射组表达量最大,且发现AIF蛋白的表达随时间推移而增强,12h达到峰值,然后下降,但仍高于0h组.RT-PCR结果显示,低剂量照射12h后,0.1Gy剂量组AIF mRNA表达量最大.而0.075Gy照射后0-24h,其mRNA表达量逐渐增大,在24h到达峰值.所以,低剂量X线照射诱导小鼠睾丸生精细胞中AIF蛋白及mRNA表达与吸收剂量和表达时间有一定的相关性.