谷氨酸合成途径基因缺失对大肠杆菌发酵L-色氨酸的影响

降低谷氨酸的积累可提高L-色氨酸产量及糖酸转化率。敲除Escherichia coli TRTH中的谷氨酸脱氢酶及谷氨酸合成酶编码基因gdh A、glt B,构建TRTHA(TRTH,Δgdh A)、TRTHB(TRTH,Δglt B),考察gdh A、glt B缺失对L-色氨酸发酵的影响。结果表明,gdh A及glt B缺失能有效降低谷氨酸的积累,但会降低细胞生长及色氨酸合成;培养基中谷氨酸的添加可恢复TRTHA及TRTHB的生长及色氨酸合成能力。在含1 g/L谷氨酸培养基中,利用TRTHB发酵L-色氨酸,L-色氨酸产量(41.23 g/L)及糖酸转化率(15.45%)最高,较TRTH分别提高了10.92%和7.89%;谷氨酸生成量(5.72 g/L)及乙酸积累量(1.73 g/L)分别较TRTH降低了25.23%及提高了10.19%。TRTH和TRTHB代谢流分析结果表明,glt B缺失会降低谷氨酸合成代谢流并提高乙酸合成代谢流;TRTHB的色氨酸合成代谢流(11.4%)较TRTH提高了40.74%。     

柠檬酸转运蛋白突变基因在L-亮氨酸发酵中的应用

该研究利用同源重组方法敲除L-亮氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ALDP的柠檬酸合酶基因glt A,并引入柠檬酸转运蛋白突变基因CP_103,获得一株能高效摄取柠檬酸的菌株。在此基础上,比较不同的柠檬酸添加方式对菌株的OD_(600nm)值、L-亮氨酸产量和糖酸转化率的影响。结果表明,通过引入柠檬酸转运蛋白突变基因CP_103,显著提高了C. glutamicum ALDPΔglt A的柠檬酸摄取能力。当初始发酵液中的柠檬酸添加量为5 g/L,并在发酵过程中通过流加的方式维持柠檬酸含量在10～15 g/L范围内,较出发菌株C. glutamicum ALDP,C. glutamicum ALDPΔglt ACP_103的OD_(600nm)值轻微下降,但是L-亮氨酸产量达到最高,为(22.5±1.5)g/L、糖酸转化率为23.1%,分别提高23.0%和48.1%。     

ldhA基因敲除对Corynebacterium glutamicum TCCC11822发酵生产L-谷氨酸的影响

针对L-谷氨酸发酵过程中乳酸产量偏高的问题,以L-谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)TCCC11822为出发菌株,通过构建敲除质粒pK18mobsacB△ldh并采用同源重组技术敲除其乳酸脱氢酶编码基因ldhA,以期达到减少副产物、提高L-谷氨酸产量和转化率的目的。结果表明,与出发菌株相比ldhA基因敲除株的乳酸合成量降低了85.6%,L-谷氨酸的产量和转化率分别提高7.6%和5.5%,但生物量略有下降。本研究可为L-谷氨酸及其他氨基酸生产菌株的理性改造提供参考。     

1dhA基因敲除对Corynebacterium glutamicum TCCC11822 发酵生产L-谷氨酸的影响

针对L-谷氨酸发酵过程中乳酸产量偏高的问题,以L-谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌（Corynebactenum glutamicum） TCCC 11822为出发菌株,通过构建敲除质粒pK18mobsacB△1dh并采用同源重组技术敲除其乳酸脱氢酶编码基因1dhA,以期达到减少副产物、提高L-谷氨酸产量和转化率的目的.结果表明,与出发菌株相比1dhA基因敲除株的乳酸合成量降低了85.6％,L-谷氨酸的产量和转化率分别提高7.6％和5.5％,但生物量略有下降.本研究可为L-谷氨酸及其他氨基酸生产菌株的理性改造提供参考.     

黑曲霉TNA-09中α-葡萄糖苷酶基因敲除的研究

以柠檬酸生产菌黑曲霉TNA—09为原始菌株,通过农杆菌介导的方法,将其α-葡萄糖苷酶基因敲除,得到基因敲除菌株TGA101。对原始菌株黑曲霉TNA-09和基因敲除菌TGA101 α-葡萄糖苷酶活力测定,结果相对于TNA—09菌株,TGA101菌株α-葡萄糖苷酶活力下降61．15％。在柠檬酸发酵试验中表现出相对于黑曲霉TNA-09,TGA101菌株发酵液中异麦芽糖含量降低84．67％,柠檬酸提高2．34％,糖酸转化率提高2．34％。     

高产L-精氨酸谷氨酸棒状杆菌的构建

以产L-精氨酸诱变菌株谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）AJC为出发菌株,采用基因组编辑技术对其进行改造。 首先,敲除阻遏蛋白ArgR和FarR,解除反馈阻遏作用;然后,敲除乳酸脱氢酶编码基因ldh和整合鸟氨酸乙酰转移酶编码基因argJ,阻 断乳酸合成途径和增加前体物;最后,敲除谷氨酸分泌蛋白编码基因NCgl1221和整合乙酰谷氨酸激酶基因argB,减弱L-谷氨酸的胞 外分泌,筛选一株L-精氨酸高产菌株。 结果表明,获得一株高产L-精氨酸菌株AJC-4（C. glutamicum AJCΔargRΔfarRΔldh::PtufargJ ΔNCgl1221::PsodargB）,该菌株在5 L发酵罐中发酵64 h后,L-精氨酸产量和糖酸转化率分别为78.0 g/L和0.38 g/g,较出发菌株AJC分 别提高21.9%、18.8%;副产物乳酸和L-谷氨酸积累量分别为0.11g/L、0.16 g/L,较出发菌株AJC分别降低96.8%、96.1%。     

NCgl1221敲除和pyc过表达对谷氨酰胺发酵的影响

谷氨酰胺在生命活动中具有重要的作用,已被广泛应用于食品、医药等诸多领域。谷氨酸是谷氨酰胺生物合成的前体物质,也是谷氨酰胺生产过程中最常见的副产物。研究发现,NCgl1221基因的编码蛋白是谷氨酸分泌的重要载体,丙酮酸羧化酶是谷氨酸棒杆菌回补途径中的关键酶。为减少谷氨酰胺发酵过程中谷氨酸的积累量并提高谷氨酰胺产量,本研究利用同源重组技术敲除谷氨酰胺生产菌GM34的谷氨酸分泌载体编码基因NCgl1221,获得GM34ΔNCgl1221菌株;构建了丙酮酸羧化酶基因pyc过表达菌株GM34-pXMJ19pyc。5 L罐发酵实验表明,NCgl1221基因缺失可以使得谷氨酸积累量降低19.05%,过表达pyc基因使得谷氨酰胺产量和转化率分别提高5.54%和2.37%。可见,敲除NCgl1221、过表达pyc能够有效降低谷氨酸分泌并提高谷氨酰胺产量。     

ilvBNC操纵子协同cimA基因过表达提高Corynebacterium glutamicum YILW L-异亮氨酸产量的研究

L-异亮氨酸是人和动物八种必需氨基酸之一,在生命活动中具有重要地位。乙酰羟基酸合成酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS)是L-异亮氨酸合成途径的关键酶(由ilvBN编码),α-酮基丁酸是L-异亮氨酸合成的重要前体。因此强化ilvBN的表达以及增加α-酮基丁酸的供应理论上可提高L-异亮氨酸的合成。cim A编码的甲基苹果酸合成酶可以催化丙酮酸和乙酰-Co A快速生成L-异亮氨酸前体α-酮基丁酸,从而增强主代谢流通量。本文采用基因重组手段将L-异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum YILW ilvBNC操纵子中的启动子替换为强启动子Ptac获得C.glutamicum YILWPtac。摇瓶发酵结果显示该菌株L-异亮氨酸产量和转化率分别较出发菌株提高了14.8%和18.6%。在此基础上过表达cimA基因,获得C.glutamicum YILWPtacp XMJ19cim A,其L-异亮氨酸酸产量和糖酸转化率分别较出发菌株提高了14.5%和42.4%。本研究可为氨基酸生产菌株的选育提供依据。     

增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性对于谷氨酸棒状杆菌积累α-酮戊二酸的影响

α-酮戊二酸（α-ketoglutarate,α-KG）作为一种二元短链羧酸,是谷氨酸、琥珀酸等化合物的重要前体,在转氨基等反应中也起着重要作用。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是谷氨酸棒杆菌中催化合成TCA循环中重要代谢物草酰乙酸的关键酶,本文以谷氨酸棒状杆菌GDK-10为出发菌株,通过同源重组技术对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pepc进行以下改造：将GDK-10的Ppepc启动子替换为强启动子Ptuf,获得菌株GDK-11;构建pepc双拷贝菌株GDK-12;对GDK-10基因组pepc进行定点突变(N917G),获得菌株GDK-13。实时荧光定量PCR检测表明,菌株GDK-11和GDK-12的pepc表达量是GDK-10的47.05倍和2.03倍。发酵结果表明,菌株GDK-11和GDK-12的产酸量相对于出发菌株分别下降45.50%和13.90%,但GDK-12的单位菌体产量较GDK-10提高38.59%。菌株GDK-13产酸量无明显变化,但其单位菌体产量和糖酸转化率分别提高21.14%和8.97%。可见,适量过量表达pepc和将GDK-10基因组pepc替换为解除天冬氨酸反馈抑制的pepc (N917G)均可提高α-KG的单位菌体产量且后者可显著提高糖酸转化率。本研究结果可对α-KG的基因工程改造奠定基础。     

过表达mqo对重组谷氨酸棒杆菌L-异亮氨酸和4-羟基异亮氨酸合成的影响

4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)具有促进胰岛素分泌、降低胰岛素抵抗活性功能,在治疗糖尿病方面有潜在的应用价值。在产L-异亮氨酸(L-isoleucine,Ile)的谷氨酸棒杆菌SN01菌株中过表达ido基因后可以合成4-HIL。为了促进草酰乙酸的供应和4-HIL合成,在这株重组菌中又过表达了mqo。发酵144 h后,ido-mqo过表达菌的4-HIL产量是(60.86±2.24)mmol/L,低于ido过表达菌(72.06±5.60)mmol/L;但是,Ile的积累量高达(101.39±2.20)mmol/L,显著高于ido过表达菌(5.00±1.43)mmol/L。对ido-mqo过表达菌代谢途径中部分关键基因的RT-PCR分析表明,进入TCA循环的碳流由异柠檬酸裂解酶分流,进入乙醛酸循环,导致4-HIL合成所需的另一底物α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)供应不足和Ile过剩。于是添加α-KG,当添加量为40 mmol/L时,4-HIL的产量提高到(77.7±10.91)mmol/L,Ile到4-HIL的转化率提高到75%。因此,过表达mqo能够促进Ile合成,添加α-KG后能够促进Ile向4-HIL转化,从而提高4-HIL产量。     

谷氨酸棒杆菌ATCC 14067中L-精氨酸合成途径关键酶的过表达对L-精氨酸合成的影响

谷氨酸棒杆菌中与精氨酸合成相关的酶主要是由2个操纵子基因簇argCJBDFR和argGH编码合成。此外,在L-精氨酸合成途径的前体物谷氨酸和氨甲酰磷酸的合成中,由gdh、icd、gltA、carAB 4个基因分别编码的谷氨酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、柠檬酸合酶、氨甲酰磷酸合成酶是谷氨酸和氨甲酰磷酸合成的关键酶。研究以解除了L-精氨酸的别构抑制作用的谷氨酸棒杆菌为出发菌株,利用3种不同抗性的表达质粒分别对这些关键酶的编码基因进行串联共表达。在最终得到的13个菌株中,L-精氨酸产量最高的菌株是出发菌株L-精氨酸产量的6.23倍,这表明串联过表达菌株L-精氨酸合成途径中,不同节点关键酶的编码基因可以更有效地提高菌株中L-精氨酸的产量,为进一步改造L-精氨酸的合成途径、优化L-精氨酸的产量奠定了基础。     

敲除pknG提高谷氨酸棒杆菌L-谷氨酸和GABA产量

γ-氨基丁酸(GABA)具有多种生理功能,被广泛应用于食品、医药等行业。在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中表达来自短乳杆菌的两个谷氨酸脱羧酶(GAD)编码基因gadB1、gadB2,可将其自身积累的L-谷氨酸有效转变成GABA。为了进一步提高GABA产量,首先在ATCC13032中敲除了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknG的编码基因pknG,以提高GABA的前体物质L-谷氨酸的供应,然后将GAD表达质粒pJYW-4-gad B1-gad B2转入pknG敲除菌株和ATCC13032中,构建出重组菌SNW203和SNW200,最后对两个重组菌进行上罐发酵。结果表明:相对于SNW200,菌株SNW203的L-谷氨酸和GABA产量都有所提高。发酵72 h后,GABA产量为(30.2±0.3)g/L,相对于SNW200提高了55.4%,L-谷氨酸和GABA的总摩尔浓度为0.3 mol/L,提高了36.4%。这说明敲除pknG能够促进重组谷氨酸棒杆菌的L-谷氨酸和GABA生物合成。     

增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性对谷氨酸棒状杆菌积累α-酮戊二酸的影响

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是谷氨酸棒杆菌中催化合成TCA循环中重要代谢物草酰乙酸的关键酶,本文以谷氨酸棒状杆菌GDK-10为出发菌株,通过同源重组技术对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pepc进行以下改造:将GDK-10的Ppepc启动子替换为强启动子Ptuf,获得菌株GDK-11;构建pepc双拷贝菌株GDK-12;对GDK-10基因组pepc进行定点突变(N917G),获得菌株GDK-13。实时荧光定量PCR检测表明,菌株GDK-11和GDK-12的pepc表达量是GDK-10的47.05倍和2.03倍。发酵结果表明,菌株GDK-11和GDK-12的产酸量相对于出发菌株分别下降45.50%和13.90%,但GDK-12的单位菌体产量较GDK-10提高38.59%。菌株GDK-13产酸量无明显变化,但其单位菌体产量和糖酸转化率分别提高21.14%和8.97%。可见,适量过量表达pepc和将GDK-10基因组pepc替换为解除天冬氨酸反馈抑制的pepc(N917G)均可提高α-KG的单位菌体产量且后者可显著提高糖酸转化率。本研究结果可对α-KG的基因工程改造奠定基础。     

途径工程改造谷氨酸棒杆菌合成L-半胱氨酸

L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸,广泛应用在医药、食品和化妆品等行业。该文以实验室保藏的一株高产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)A36为出发菌株,通过加强表达丝氨酸O-乙酰基转移酶(serine O-acetyltransferase, SAT)、O-乙酰基-L-丝氨酸巯基化酶-A和转运蛋白Bcr编码基因强化L-半胱氨酸合成和转运,敲除L-半胱氨酸降解途径关键酶弱化其降解,构建系列重组菌株,其中重组菌S-C-7的L-半胱氨酸产量最高,为286.7 mg/L。进一步通过优化硫源提高菌株S-C-7的L-半胱氨酸产量,结果表明,最佳硫源为硫代硫酸钠,当发酵24 h时添加12 g/L硫代硫酸钠,L-半胱氨酸的产量最高,为581.6 mg/L,较优化前提高1.0倍。最后,在5 L发酵罐对S-C-7进行发酵评价,L-半胱氨酸产量达到1.2 g/L,是目前文献报道谷氨酸棒杆菌产L-半胱氨酸的最高产量;为实现谷氨酸棒杆菌发酵生产L-半胱氨酸奠定了基础。     

通过添加NaHCO_3和调节pH提高谷氨酸得率

研究了在谷氨酸发酵产酸期分别添加NaHCO3、调节pH及两者耦联操作条件下的发酵性能。结果表明:只有在升高pH值、添加NaHCO3同时进行或先升高pH值后添加NaHCO3的情况下,葡萄糖消耗量大幅下降,谷氨酸得率显著提高,分别比对照提高36%和34%,且谷氨酸产量可以达到正常水平(75 g/L以上)。酶学代谢分析表明,仅仅提高丙酮酸羧化酶活性不能提高谷氨酸得率,只有各个关键酶相互协调配合,即适度弱化丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶活性的同时,适度提高丙酮酸羧化酶和异柠檬酸脱氢酶活性,才能有效提高谷氨酸发酵整体性能。     

产L-丝氨酸谷氨酸棒杆菌诱变后突变基因对生长和产酸的影响

在前期研究中,通过比较基因组学分析发现产L-丝氨酸野生型谷氨酸棒杆菌SYPS-062及其突变株SYPS-062-33a之间有12个基因突变。对其中5个差异基因进行回复突变或敲除的研究,发现丙酮酸脱氢酶亚基ace E点突变与突变株SYPS-062-33a副产物积累量直接相关。在此基础上其余7个突变基因对菌株产酸和生长的影响将进一步研究,在高产L-丝氨酸谷氨酸棒杆菌ΔSSAAI中分别敲除这7个基因,发现敲除基因SD36_RS01255后,菌株OD562下降25.8%,L-丝氨酸产量下降26.4%,仅积累19.25 g/L。通过比对NCBI蛋白数据库,对基因SD36_RS01255编码的蛋白进行功能预测分析,发现其编码的蛋白部分区域与质粒pRi A4b ORF-3编码的蛋白类似,参与DNA修复。敲除基因SD36_RS01255影响DNA的修复,从而造成菌株生长和L-丝氨酸产量的下降。而过表达基因SD36_RS01255对谷氨酸棒杆菌ΔSSAAI的生长、L-丝氨酸的产量却未造成显著影响。     

谷氨酸棒杆菌苏氨酸脱氨酶基因敲除及对L-亮氨酸发酵的影响

L-异亮氨酸是L-亮氨酸发酵的主要副产物,L-异亮氨酸的积累对L-亮氨酸的发酵及提取均产生不利影响。采用基因重组技术敲除L-亮氨酸产生菌-谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)TGL8207的苏氨酸脱氨酶基因ilvA,构建了ilvA缺失株谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)TGL8207 ilvA。发酵结果显示:ilvA基因缺失对TGL8207 ilvA的生长影响很小。与供试菌比较,TGL8207 ilvA的L-亮氨酸产量和糖酸转化率分别提高了8.4%和1.9%。     

3-磷酸甘油醛脱氢酶促进谷氨酸棒杆菌发酵生产L-精氨酸和L-鸟氨酸

在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum) SNK118中表达NADP~+依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因,提高胞内NADPH水平,以提高L-精氨酸(L-Arginine)和L-鸟氨酸(L-Ornithine)发酵产量。通过NCBI数据库检索,选取了3个不同来源的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因。经测定酶活力,最终选择糖丁基梭菌(Clostridium saccharobutylicum) DSM 13864来源的NADP~+依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(Csgap C)。构建了产L-精氨酸的重组菌SNK118/p XMJ19-Csgap C,当摇瓶发酵70 h时产L-精氨酸11. 55 g/L,糖酸转化率0. 13 g/g,与对照菌SNK118/p XMJ19相比,精氨酸产量和糖酸转化率分别提高了26%和10. 2%。在L-鸟氨酸生产菌株SNK118Δarg FΔargR中重组表达Csgap C,重组菌SNK118Δarg FΔargR/p XMJ19-Csgap C摇瓶发酵70 h产L-鸟氨酸27. 76 g/L,糖酸转化率0. 274 g/g,与对照菌SNK118Δarg FΔargR/p XMJ19相比,L-鸟氨酸产量和糖酸转化率分别提高了20. 1%和15. 6%。结果表明,异源表达Csgap C有助于提高谷氨酸棒杆菌发酵生产L-精氨酸和L-鸟氨酸的水平。     

代谢工程构建谷氨酸棒杆菌合成5-氨基乙酰丙酸

非蛋白氨基酸5-氨基乙酰丙酸是合成四氢吡咯化合物的前体物,被广泛应用于医药、农业和畜牧业。为提升5-氨基乙酰丙酸合成效率,该研究以谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032为出发菌株,首先敲除L-谷氨酸输出蛋白编码基因NCgl1221阻断其分泌,菌株5-氨基乙酰丙酸产量达到0.62 g/L。然后利用脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)脚手架体系组装关键酶谷氨酰-tRNA还原酶和谷氨酸-1-半醛氨基转移酶,当二者比例为2∶1时最有利于5-氨基乙酰丙酸的合成,产量为0.84 g/L;为增强三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循环,分别通过过表达pyc、ppc和pckA强化回补途径,结合过表达gltA强化柠檬酸合成,结果表明以共表达pckA和gltA的效果最佳;在此基础上通过敲除aceA并过表达pntAB以增强α-酮戊二酸和NADPH供应,所获菌株ALA-10的5-氨基乙酰丙酸产量为1.47 g/L。该研究可为提升5-氨基乙酰丙酸的发酵合成效率提供参考。     

L-亮氨酸生物合成关键酶基因的克隆和表达

通过PCR获得黄色短杆菌ATCC14067基因组上编码L-亮氨酸合成途径中关键酶的基因。连接大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭表达质粒pDXW-8构建多种重组质粒,分别转化模式菌株C.glutamicum ATCC13032考察对其发酵生产L-亮氨酸的影响。经摇瓶发酵实验显示:C.glutamicum ATCC13032发酵液中没有L-亮氨酸的积累而基因工程菌ATCC13032/pDXW-8-leuA-ilvBNC中L-亮氨酸的产量达4.75g/L。