基于免疫磁分离-双重荧光定量PCR的鲜猪肉中沙门氏菌和志贺氏菌的检测

目的使用免疫磁分离-双重荧光定量PCR方法实现对鲜猪肉中金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的同时、快速检测。方法在37℃的条件下,利用特异性免疫磁球从250 m L循环体系中快速、有效地捕获目标菌。再通过特异性的引物与探针,对沙门氏菌和志贺氏菌进行双重荧光定量PCR检测。结果本研究方法针对鲜猪肉中沙门氏菌和志贺氏菌的检测限分别达到3.4 cfu/g和9.4 cfu/g。方法总体灵敏度、特异性和准确度均达到100%。此外,通过对30组实际样品的检测,该方法与传统标准方法的结果保持一致。结论本研究建立的免疫磁分离-双重荧光定量PCR方法比国标方法更快速和高效,适用于鲜猪肉中沙门氏菌和志贺氏菌的快速检测。     

鲜猪肉中沙门和金葡菌荧光定量PCR检测

通过结合两种技术-免疫磁分离技术与双重荧光定量PCR技术,建立同时、快速对鲜猪肉进行沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测方法。利用偶联有特异性抗体免疫磁球,在37℃的条件下能够有效地从250 m L循环体系中边富集边捕获目标菌。利用特异性的引物与探针,对两种食源性致病菌进行双重荧光定量PCR同时检测。本研究方法针对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测限分别达到3.6 CFU/g和9.2 CFU/g。方法总体灵敏度、特异性和准确度达到98.8%、100%以及98.9%。本研究建立的免疫磁分离-双重荧光定量PCR方法比国标方法更快速和高效,适用于鲜猪肉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的快速检测。     

乳中志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法的建立

为了快速、有效的检测乳中的志贺氏菌,建立一种特异性强、灵敏度高的荧光定量PCR方法。根据GenBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,对提取的志贺氏菌DNA模板进行PCR扩增,对目的基因进行克隆和测序,然后利用荧光定量PCR方法,对志贺氏菌进行检测,确定其扩增条件。建立的方法特异性强,检测的灵敏度可达到10-6 ng/μL。利用建立的方法可检测乳中2.84 cfu/mL的志贺氏菌。该方法为快速、准确检测乳中的志贺氏菌提供了参考。     

实时荧光定量PCR法与分离培养法检测食品从业人员沙门菌和志贺菌的比较研究

目的比较实时荧光定量PCR法(RT-PCR)与分离培养法对食品从业人员肠道致病菌沙门菌和志贺菌的检测效果。方法 1RT-PCR法:用实时荧光定量PCR对体检肛拭子进行初筛;2分离培养法:按照国标方法GB/T 4789.4—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》和GB/T 4789.5—2003《食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验》对所筛选出的菌株进行鉴定。结果 RT-PCR法对食品从业人员肠道沙门菌和志贺菌的检出率明显高于分离培养法。结论 RT-PCR法相对于分离培养法在从业人员体检沙门菌和志贺菌的检测中,无论从检出率、准确度,还是检测时效性上都有着明显的优势。因此,在从业人员体检中运用RT-PCR法具有很好的实际意义。     

一种快速筛查志贺氏菌的荧光纳米免疫层析方法的建立

本文以建立志贺氏菌荧光纳米颗粒免疫层析法为目的。首先,制成志贺氏菌单抗-荧光纳米颗粒偶联物,以双抗体夹心模式制备志贺氏菌免疫层析试纸条。利用微型手持荧光检测仪读出质控线和检测线上的荧光信号,并利用荧光强度来半定量检测志贺氏菌。结果显示:用本研究建立的荧光纳米颗粒试纸条检测30株菌,对宋内志贺氏菌和福氏志贺氏菌呈阳性结果,其余菌株的呈阴性结果,试纸条灵敏度为9.0×104 CFU/m L。用志贺氏菌免疫层析试纸条和标准法检测60份样品,两种方法的总符合率为88.3%。结论:本研究成功建立了志贺氏菌的荧光纳米免疫层析检测方法,能够快速检测志贺氏菌,具有良好的特异性和灵敏性,便于开展现场快速检测。     

肉制品中志贺氏菌DNA的快速提取方法

肉制品中致病菌DNA的提取对PCR检测具有重要意义。以污染志贺氏菌的猪肉为材料,比较了沸水浴法、裂解液煮沸法、CTAB/SDS法、改良的碱性异硫氰酸胍法4种提取方法对志贺氏菌DNA的提取效果,并以提取的DNA为模板进行PCR检测。结果表明:改良的碱性异硫氰酸胍法提取志贺氏菌DNA的效果较好,猪肉中志贺氏菌的PCR最低检出限为5×100CFU/g,整个检测时间<8h。经改良的碱性异硫氰酸胍法操作简便、经济省时,可用于肉类的PCR检测。     

基于量子点的志贺氏菌sFLISA检测方法研究

目的本研究建立基于量子点的志贺氏菌s FLISA检测方法并进行验证。方法以志贺氏菌多克隆抗体为包被抗体,以生物素标记的志贺氏菌单克隆抗体为第二抗体,以量子点标记的链酶亲和素进行荧光定量检测。结果试验确定志贺氏菌s FLISA检测最佳条件:包被抗体浓度为1.25μg/m L,生物素标记的单克隆抗体稀释倍数为1:400,量子点标记的链酶亲和素稀释倍数为1:100;特异性检验表明,s FLISA方法仅与志贺氏菌出现阳性反应,而与大肠埃希氏菌、沙门氏菌、葡萄球菌、李斯特氏菌、变形杆菌、副溶血弧菌、芽孢杆菌等均呈阴性反应。结论本研究建立的基于量子点的志贺氏菌s FLISA检测方法的最低检出量为3.5×104 CFU/m L,实现了对志贺氏菌高通量定性和定量检测。     

牛奶样品中志贺氏菌的快速PCR检测技术研究

建立牛奶中快速检测志贺氏菌的有效方法。根据GenBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,筛选合适的DNA模板制备方法,采用快速常规PCR和定量实时PCR结合,对培养液中及牛奶阳性样品中的志贺氏菌进行检测,检测敏感度可达到2CFU/ml,检出时间小于20h。新建的PCR方法具有特异性好,灵敏度高等特点,适用于快速、准确检测牛奶中志贺氏菌的需要。     

乳饮料中志贺氏菌的快速PCR检测技术研究

建立乳饮料中快速检测志贺氏菌的有效方法。根据GeneBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,筛选合适的DNA模板制备方法,采用快速常规PCR和定量实时PCR结合,对培养液中及乳饮料阳性样品中的志贺氏菌进行检测,菌液敏感度可达到2cfu／mL,检出时间小于20h。新建的PCR方法具有特异性好,灵敏度高等特点,适用于快速、准确检测乳饮料中志贺氏菌的需要。     

基于内参的志贺氏菌实时荧光定量PCR快速检测

根据Genbank已公布的志贺氏菌基因组序列,筛选特异性靶基因ipa H,设计特异性引物和探针,优化反应体系,并在体系中加入内参(IAC),通过标记不同荧光基团的Taq Man探针来监测IAC,进而实时监控整个PCR反应过程。按照人工污染样品,以评价所建立反应体系的性能。以志贺氏菌基因组DNA为模板,最低检测限为1 pg/u L;以10倍梯度稀释的菌液用水煮法提取DNA为模板,最低检测限为9×103CFU/m L;以含有ipa H的质粒为模板,最低检测限可以达到103考贝/u L;建立ipa H和ipa H-IAC标准曲线,Ct值与模板拷贝数均呈良好的线性关系(R2=0.999);人工污染初始菌量为20 g中10 CFU的羊肉时,志贺氏菌在增菌6 h后即可检出(水洗加试剂盒法)。作者建立的ipa H-IAC实时荧光定量PCR方法,既能有效检测食品中志贺氏菌,又能实时监测PCR反应过程,有效防止"假阴性"的发生,进一步保证了结果的可靠性,有利于实现样品中志贺氏菌实时荧光定量PCR检测方法的标准化。     

TaqMan探针双重荧光PCR技术检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌

目的 建立TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌的方法。方法 通过比对沙门氏菌和志贺氏菌的基因组序列,选择同源性高、保守性好的区域设计特异性引物和探针,经过引探筛选、浓度调试等一系列优化,建立了食源性沙门氏菌和志贺氏菌双重荧光PCR核酸检测方法,并对其特异性、质粒最低检出限、菌液敏感性、重复性、稳定性以及实际样品进行了验证。结果 该方法与大部分食源性致病菌无交叉反应,特异性强;沙门氏菌和志贺氏菌质粒的最低检出限可达5 copies/μL,沙门氏菌菌液敏感性为1.0×102 cfu/mL,志贺氏菌菌液敏感性10 cfu/mL;质粒和菌液核酸梯度的批内和批间变异系数均在0.177%~1.958%之间,小于5.0%,具有较强的稳定性;标准曲线相关系数(R2)均大于0.999。结论 本研究成功建立了一种TaqMan探针双重荧光PCR技术同时检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌的方法,该方法扩增时间短,只需要30min即可,而且特异性强、稳定性好,可用于疑似沙门氏菌和志贺氏菌污染样品的检测,为食品安全的快速检测提供技术支撑。     

实时荧光PCR在食源性致病菌监测中的应用研究

目的 建立沙门菌、志贺菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠埃希菌O157:H7、金黄色葡萄球菌5种致病菌的实时荧光PCR检测方法,并在食源性致病菌监测工作中推广应用.方法 将菌株及样品经培养基增菌后,用热裂解法提取DNA,使用荧光定量PCR反应试剂盒,时该检测方法进行特异性验证,并在2006-2007年间,同时应用实时荧光PCR和传统方法对890份各类实际工作监测标本进行比较分析.结果 实时荧光PCR方法对19株不同种类标准菌株符合率为100%;对用传统方法检测分离到的5种食源性致病菌的符合率分别为:沙门菌96.61%,单核细胞增生李斯特菌92.30%,大肠埃希菌O157:H7、志贺菌、金黄色葡萄球菌均为100%;对890份监测标本检测结果表明,实时荧光PCR法对食品及临床标本中食源性致病菌的检出率略高于传统培养法,差异无统计学意义,而实时荧光PCR法可在3～36 h内时目标样品作出结果判断.结论 实时荧光PCR方法成功应用于食源性致病菌的检测,具有快速、特异和灵敏的特点,可作为食物中毒等突发公共卫生事件处置和重大活动食品安全保障工作的有效技术支撑.     

实时荧光定量PCR技术快速检测志贺氏菌

目的 建立实时荧光定量PCR法快速检测志贺氏菌。方法 提取志贺氏菌基因组为模板扩增virA基因片段, 将目的片段连接至pMD19-T载体得到重组质粒, 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 验证所得到的重组质粒, 以紫外分光光度计测量重组质粒吸光度值A260, 并换算为质粒拷贝数后作梯度稀释得到不同浓度的质粒标准品; 进行荧光定量PCR分析并通过特异性、灵敏性实验以验证该方法的可行性。结果 重组质粒标准品浓度在103~108 copies/μL范围内线性关系良好(r2>0.99), 实时荧光定量PCR检测志贺氏菌时出现良好的扩增曲线, 鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均未出现扩增曲线。志贺氏菌的检出限为100 CFU/mL。 结论 本方法便捷、高效、可靠, 可用于志贺氏菌的快速定性定量检测。     

食品中检测志贺氏菌的实时荧光RPA方法的建立与应用

本研究旨在建立志贺氏菌的实时荧光重组酶聚合酶扩增技术real-time RPA)检测方法。根据志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)的保守序列设计引物及exo探针,利用荧光检测设备实时监控反应进程,在39℃恒温下20 min即可完成检测。该方法特异性扩增志贺氏菌,对非志贺氏菌无扩增;以志贺氏菌基因组DNA为模板,该方法的检测灵敏度为3.5×10-3ng/μL,同已发表的real-time PCR方法一致。人工污染试验表明,当鸡肉、西兰花样品污染量为9 CFU/25g,增菌时间为8 h时,即可通过real-time RPA方法检出志贺氏菌。在人工污染试验中,real-time RPA和real-time PCR检测结果一致,而前者仅需7～12 min,后者则至少需要35 min(Ct值为27～34之间)。本研究建立的志贺氏菌real-time RPA方法特异性强,灵敏性高,反应时间短,操作方便,为食源性致病菌检测提供了一个新的技术平台。     

实时荧光PCR检测熟肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌的结果分析与探讨

目的:对实时荧光PCR检测单核细胞增生李斯特氏菌假阳性结果的原因分析探讨。方法:对假阳性的样本进行传统培养法鉴定分析,将鉴定的菌落进行实时荧光PCR检测,同时对样本基质的影响和培养基本底的影响进行实时荧光PCR检测。结果:样本中的可疑菌落、样本的基质、培养基本底对实时荧光PCR检测结果均无假阳性影响。结论:实时荧光PCR检测熟肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌的假阳性主要原因可能是样本中存在死亡目的菌基因造成的干扰。     

二重PCR法快速检测3种食源性致病菌

目的建立快速检测食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)及志贺氏菌属(Shigella spp.)的二重PCR方法。方法分别针对金黄色葡萄球菌.femA和nuc、沙门氏菌属invA和hilA及志贺氏菌属ipaB和ipaH设计6对特异性引物,检测每对引物的特异性及灵敏度,组合优化各自二重PCR反应体系。结果初步建立了针对这3类致病菌的二重PCR检测方法,整个检测过程不超过18 h,检测灵敏度均可达10 pg DNA/reaction。结论所建立的针对3类致病菌的二重PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和方便高效等优点,具有良好的市场应用前景。     

牛奶中志贺氏菌PCR检测方法的建立

根据Genbank志贺氏菌侵袭性质粒抗原H (ipaH)基因序列, 自行设计引物, 扩增特异的326 bp核酸片段, 经过优化PCR扩增条件, 建立了志贺氏菌特异、敏感、快速的PCR检测方法, 并对牛奶中的志贺氏菌进行了检测.特异性试验结果表明, 志贺氏菌参考菌株均能扩增出特异的核酸片段, 大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌的扩增结果均为阴性.敏感性试验结果表明, 采用试剂盒提取基因组, 该方法的敏感性可达到1.75×102 cfu/mL.人工污染牛奶的模拟检测结果表明, PCR方法的检测限为1.75×103 cfu/mL.     

单核增生李斯特氏菌检测能力验证结果分析

目的验证本实验室对食品中单增李斯特氏菌的检出能力。方法按照能力验证作业指导书、GB4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌》和SN/T 1870-2016《出口食品中食源性致病菌检测方法实时荧光PCR法》进行检验。首先进行2次前增菌,再按照国标法进行选择分离、纯化、生化鉴定进行检验;同时利用增菌液进行实时荧光PCR方法检验。结果国标法和实时荧光PCR法检验结果均为CODE 40样品检出单增李斯特氏菌,CODE 61样品未检出单增李斯特氏菌。结论组织者对本实验室此次能力验证试验结果评价满意,说明本实验室同时具有传统国标法和实时荧光PCR法检测单增李斯特氏菌的能力。     

3种食源性致病菌的实时荧光PCR快速检测

DNA提取方法采用先钢珠机械破坏细菌细胞壁,再添加丙酮、蛋白酶K溶解去除杂质,大大提高了食源性致病菌基因组DNA的得率和纯度。继而针对金黄色葡萄球菌egc基因、沙门氏菌NA(not availabale)基因、志贺氏菌ipaH基因为靶基因设计特异性引物对样品建立实时荧光定量PCR检测方法。结果试验设计的引物对3种细菌具有很强特异性,除目标细菌外,对单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌3种对照菌均未检测到荧光信号。对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的检测灵敏度分别达到10~(-6)、10~(-6)、10~(-7) ng/μL。     

绿色魏斯氏菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法的建立

以rpoA基因为靶基因,建立绿色魏斯氏菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）快速检测方法。针对rpoA基因设计特异性引物,建立绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR检测体系,通过特异性、灵敏度和重复性实验评价体系的检测效果,同时与常规PCR方法进行比较。结果表明：实时荧光定量PCR方法能够特异性检出绿色魏斯氏菌,对基因组DNA的检测灵敏度达到2.667×10－3 pg/μL,对纯培养物和模拟污染牛肉样品直接检测的灵敏度分别为30 CFU/mL和0.8 CFU/g;与常规PCR相比,实时荧光定量PCR检测的灵敏度是其1 000 倍;不同浓度样品独立重复实验循环阈值的标准差均小于1,变异系数在0.02%～1.28%之间。本研究所建立的绿色魏斯氏菌实时荧光定量PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能够进行准确的定量检测,是快速检测绿色魏斯氏菌的有效手段。