常压室温等离子体快速诱变选育高产单宁酶菌株

采用常压室温等离子体诱变技术处理黑曲霉B0201,选育高产单宁酶突变株,为单宁酶的发酵生产提供优良菌株。确定等离子体处理条件,采用稀释平板培养法挑选突变株,利用变色圈法和分光光度法测定产酶量,获得最佳诱变时间为180 s,正突变率高达19%。通过2%的高浓度单宁酸显色平板初筛850株菌,液态摇瓶发酵复筛90株菌,得到高产单宁酶的菌株B1401。诱变后单宁酶酶活为17.61 U/g,是原始菌株酶活8.94 U/g的2倍左右,且传代菌种产单宁酶稳定性良好。     

米曲霉多酶系优良菌株的诱变选育

以米曲霉1-7.3为出发菌株,通过紫外诱变,采用含有不同制霉菌素药物浓度的PDA培养基,初筛得到生长速度快、孢子颜色和菌落形态发生变化的菌株125株.通过制曲复筛进一步得到了一株综合酶系优良的目标菌株80110,该菌株产生的酸性蛋白酶和中性蛋白酶的酶活力较之1-7.3分别提高了230.10%和17.50%,糖化酶活力较之传统生产菌株3.042高出15.10%.用80110、1-7.3和3.042三种菌株进行酱油低盐固态发酵比较,80110发酵得到的酱油,总氮含量和氨基态氮含量都明显高于1-7.3和3.042.     

LiCl-ARTP复合诱变选育高产碱性蛋白酶菌株及其发酵条件优化

以地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）E-417为出发菌株,采用氯化锂（LiCl）-常压室温等离子体（ARTP）复合诱变法对其进行诱变,通过酪蛋白平板初筛、摇瓶复筛、遗传稳定性验证筛选高产碱性蛋白酶的优良菌株,并通过单因素及响应面试验对其发酵产酶条件进行优化。结果表明,在氯化锂添加量为1.5%、ARTP照射时间为45 s的最适复合诱变条件下筛选得到1株高产碱性蛋白酶的优良菌株F-3,酶活达到12 147 U/mL,且该菌株传代8次后仍具有良好的遗传稳定性,其最适发酵培养基成分为玉米粉41 g/L、豆饼粉40 g/L、碳酸钠2.1 g/L、磷酸氢二钠2.0 g/L;最适发酵条件为发酵温度37 ℃、初始pH值7.0、接种量8%。在此优化条件下,碱性蛋白酶酶活达到16 156 U/mL,较原始菌株提高75%。     

基于基因组改组的米曲霉沪酿3.042多亲株PEG介导融合育种

利用经过分生孢子的原生质体紫外线-氯化锂、NTG复合诱变得到的米曲霉沪酿3.042的8株突变株作为候选株文库,采用基因组改组(genome shuffling),利用原生质体,进行多亲株双灭活PEG介导融合,优化融合条件。以酪蛋白平板初筛,以及固体发酵测定中性蛋白酶酶活复筛,通过2轮融合操作,筛选出6株高产中性蛋白酶的融合株。其中融合菌株FII-41酶活达到7412U/g(干基),比原始出发菌株4212U/g(干基)提高1.76倍,且遗传稳定。     

米曲霉与酱油曲霉高酶活菌株的诱变选育

酱油酿造过程中菌株所分泌的酶系直接影响原料的利用率和最终产品的品质.实验通过紫外诱变、亚硝基胍诱变以及紫外-亚硝基胍复合诱变方法分别对米曲霉和酱油曲霉菌株进行了诱变,采州酪蛋白透明圈法初筛以及福林酚法和DNS法复筛,根据碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、纤维素酶和α-淀粉晦酶活水平的变化,选育出数株米曲霉和酱油曲霉高酶活菌株.并对初筛方法的可行性和不同诱变方法对菌株改良的效果进行了探讨.     

基于基因组改组的米曲霉沪酿3．042多亲株PEG介导融合育种

利用经过分生孢子的原生质体紫外线-氯化锂、NTG复合诱变得到的米曲霉沪酿3.042的8株突变株作为候选株文库,采用基因组改组(genome shuffling),利用原生质体,进行多亲株双灭活PEG介导融合,优化融合条件.以酪蛋白平板初筛,以及固体发酵测定中性蛋白酶酶活复筛,通过2轮融合操作,筛选出6株高产中性蛋白酶的融合株.其中融合菌株FII-41酶活达到7412U/g(干基),比原始出发菌株4212 U/g(干基)提高1.76倍,且遗传稳定.     

1种高产凝乳酶菌株复合诱变选育及所产酶酶学性质研究

以蓝色刺孢霉为出发菌株,利用复合(紫外和硫酸二乙酯)诱变处理出发菌株,筛选凝乳酶高产菌株,并对其做遗传稳定性试验,研究蓝色刺孢霉产酶的酶学性质。研究表明,先UV后DES复合诱变初筛,最可能为正突变株的有A1,A7,A15和A18;先DES后UV复合诱变初筛,最可能为正突变株的有B9,B12,B20,B22和B27。通过对上述菌株进行复筛,A18,B9和B20的凝乳酶活比出发菌株分别提高了20.80%,104.32%和37.51%,其中以先DES后UV诱变的菌株B9相对酶活最大,达到(115.95±7.20)SUm L-1,酶活增加104.32%。遗传稳定性试验表明B9具有较好的遗传稳定性。通过酶抑制剂试验,确认蓝色刺孢霉所产酶为天冬氨酸蛋白酶。采用SDS-PAGE电泳,制定标准曲线,由其方程得出该凝乳酶相对分子质量为32 400 ku。通过与小牛皱胃酶酶切位点比较,得出水解产物和小牛皱胃酶的基本相同。     

原生质诱变选育高产酸性α-淀粉酶黑曲霉菌株

以产酸性α-淀粉酶的黑曲霉0-2-1为出发菌,选用180s的紫外线照射剂量对其孢子原生质体进行诱变,利用固体平板透明圈法初筛和发酵液酶活测定复筛;筛选到3株酶活有较大提高的突变株UV9、UV17、UV31,其酸性α-淀粉酶活力分别为184.66、162.73、167.31U/mL,比出发菌株分别提高了54.9%、38.1%和42.0%,遗传稳定性实验证明3株突变株传代过程中均保持相对稳定的较高酸性α-淀粉酶活力。     

产克拉维酸的棒状链霉菌突变株的选育

以棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus),B71为出发菌株,通过紫外线诱变育种,采用琼脂块法初筛和摇瓶发酵复筛,选育出2株甘油耐受性正向突变株S.clavuligerus B71—14和S.clavuligerus B71-49,在摇瓶条件下,其克拉维酸产量与出发菌株S.davuligerus B71相比,分别提高了90.6%和88.8%,并具有良好的遗传稳定性。     

紫外诱变黑曲霉筛选高产果胶酶菌种

以黑曲霉(Aspergilus niger) CICC41254为出发菌株,进行紫外线诱变.初筛使用透明圈法,从果胶平板上的突变菌株中,挑取了26株透明圈与菌落直径比值显著大于出发菌株的突变株.将这些突变株进行三角瓶固体发酵复筛,最后筛选出1株高产果胶酶的突变株CICC41254-D8.突变株CICC41254-D8经斜面传代培养了5代,产酶遗传特性稳定,其果胶酶活力最高可达1156.8U/g干基,比出发菌株酶活力(750.0U/g)提高了54.24％.     

促酱醪发酵芽孢杆菌的筛选及应用

用酪素平板法从高盐稀态酱醪中筛选出56 株蛋白酶活性较好的菌株,牛津杯法复筛后制曲测定酶活性,得到淀粉酶活性最高的菌株CS1.11、蛋白酶活性最高的菌株CS1.13及纤维素酶活性最高的菌株CS1.17;16S rRNA序列测定结合形态学分析,CS1.11、CS1.13、CS1.17分别鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）、甲基营养型芽孢杆菌（B. methylotrophicus）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）;分别将3 株实验菌与对照菌枯草芽孢杆菌CS1.03单独进行制曲后盐卤发酵,发现CS1.13发酵酱油氨态氮质量浓度最高,为5.12 g/L,CS1.11发酵酱油还原糖质量浓度最高,为27.20 g/L,与其酶活性结果一致,4 株菌对酱油总酸含量影响不大;顶空固相微萃取气相色谱-质谱联用内标法定性及定量分析发酵酱油发现,3 株实验菌与对照菌均具有产生吡嗪类物质及其前体乙偶姻和2,3-丁二醇的优势,且3 株实验菌优于对照菌;吡嗪类物质能赋予酱油良好的风味及健康因子,是芽孢杆菌酱油发酵的特征风味物质。筛选自高盐稀态酱醪的芽孢杆菌CS1.11、CS1.13、CS1.17有促酱醪发酵、丰富酱油风味、增进健康因子的潜力,具备良好的应用前景。     

乙醇对酱油发酵体系中蛋白酶系的影响研究

通过控制酒精发酵来研究乙醇对酱油发酵体系中蛋白酶系的影响,发现乙醇对碱性蛋白酶的稳定性影响很大,特别是在发酵温度为30℃、pH 5.0、乙醇含量在2％以上时碱性蛋白酶失活加剧;乙醇对中性蛋白酶活力的抑制作用较明显,特别是在乙醇含量大于2％以后,其活力急剧下降,最低降到38％.研究结果显示,适度的酒精发酵对氨基氮生成和原...     

酸性蛋白酶对高盐稀态酱油发酵的影响

以高盐稀态发酵酱油为研究对象,以未添加酸性蛋白酶的样品为对照组（K）,在酱油发酵初期（0 d）添加酸性蛋白酶（1‰）的样品为实验组（S）,通过分析发酵过程（1～62 d）中酸性和中性蛋白酶活力、pH、总酸含量、氨基酸态氨含量和游离氨基酸含量的变化及生酱油的呈味氨基酸含量,考察添加外源酸性蛋白酶对酱油发酵的影响。结果表明,S组的酸性蛋白酶和中性蛋白酶活力分别为K组的2.9倍和2.1倍。发酵结束时,与K组相比,S组酱油的pH下降至4.50、总酸、氨基酸态氮含量分别增加36.71%、16.49%;游离氨基酸总含量降低13.64%,生酱油呈鲜味的谷氨酸含量由11.52 g/L降至1.26 g/L。表明酸性蛋白酶虽然能够提高原料利用率,但对酱油滋味也有一定影响。     

新型制曲促进剂用于酱油生产的研究

以淀粉糖浆培养制取的增香酵母粉配以马齿苋、茵陈提取物和无机物丙酸钠制成新型制曲促进剂,探讨该促进剂对酱油曲料蛋白酶活力的影响、对制曲原料细菌污染的抑制效果以及对制曲周期的改变。结果表明,与对照样品比较,添加0.4g/100g 制曲促进剂,可使蛋白酶活力提高32%,细菌污染率降低92%,制曲周期缩短4h,发酵后原料氮利用率提高5.1%,酱油中氨基酸生成率提高5.8%。     

耐盐米曲霉CICIM F0899在酱油酿造过程中的应用

耐高盐环境的蛋白酶对酱油工业有着积极作用。该实验对1株产耐盐蛋白酶的米曲霉CICIM F0899在高盐稀态酱油发酵过程中的作用进行了研究,并同沪酿3042进行了比较。结果表明,在酱醪发酵阶段,微生物代谢产酸使酱醪pH持续下降,影响了蛋白酶的活性,导致酱油中氨基态氮和风味物质含量的变化,在180天时氨基态氮含量达到0.62 g/100 mL,比沪酿3042高11.11%。利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)对挥发性成分进行了分析鉴定,检测出酱醪中7大类共49种挥发性化合物,其中酯类、杂环类化合物的含量明显高于沪酿3042,而醛类物质的含量相对较少。因此,米曲霉CICIM F0899在氨基态氮含量和风味组成方面都具有更加明显的优势。     

酱油的罐式与池式发酵过程中关键呈味物质对比分析

从发酵罐和发酵池中选取发酵过程中的酱油进行中性蛋白酶活力、氨基酸态氮含量、游离氨基酸含量、pH值、总酸含量、有机酸含量、还原糖含量、淀粉酶活力和食盐含量的检测与分析。结果表明：池式发酵酱油的中性蛋白酶活力、氨基酸态氮含量、氨基酸总量、有机酸总量、淀粉酶活力、还原糖含量、总酸含量和pH值都高于罐式发酵酱油;食盐含量则是罐式酱油更多;其中鲜味氨基酸在发酵12 d后池式酱油的含量就高于罐式酱油的含量,尤其是池式酱油的谷氨酸在发酵45 d时已达到10.42 g/kg,而罐式酱油的谷氨酸含量仅7.91 g/kg;两种方式发酵的酱油都能检测出7种有机酸,且含量较高的两种有机酸分别是乳酸和乙酸;在发酵结束时池式酱油的还原糖含量比罐式酱油的还原糖含量高1.01 g/100 g;池式酱油的食盐含量比罐式酱油的食盐含量低0.90 g/100 g,说明在关键呈味物质上池式发酵酱油优于罐式发酵酱油。     

Construction of the mutant strain in Aspergillus oryzae 3.042 for abundant proteinase production by the N+ ion implantation mutagenesis

Because of secreting large amounts of enzymes, Aspergillus oryzae was widely used in the fermentation of soy sauce in many Asian countries. Here, N⁺ ion implantation mutagenesis was applied to improve the ability of A. oryzae to secrete acid protease. Several mutants were screened using three kinds of plates (Casein medium, Czapek’s medium and carboxymethyl cellulose medium agar plates). Compared with the other mutants, the mutant A100‐8 could secrete the most protease. Acid protease activity of A100‐8 was enhanced about 44.1% at 36 h by koji fermentation test. In addition, A100‐8 was stable by periodically subculturing and maintaining on the agar slant. The mRNA expression levels of two kinds of acid protease (serine carboxypeptidase and aspartyl protease) were measured by RT‐PCR at different periods. Serine carboxypeptidase and some kinds of aspartyl protease of A100‐8 were significantly (P < 0.01) expressed higher than the control at all times.     

米曲霉1228制曲条件的优化及酱油酿造的研究

以米曲霉1228为发酵菌种,豆粕和麸皮为原料制曲,通过单因素试验和正交试验,优化制曲工艺条件;采用低盐固态发酵工艺,进行酱油酿造试验。结果表明:豆粕与麸皮以6:4配比,采用90%加水量和0.5%接种量制曲32 h,成曲的中性蛋白酶酶活为1473 U/g;发酵20 d后,测得酱油的氨基酸态氮含量为6.90 mg/mL,可溶性无盐固形物含量为163.60 mg/mL,酱油色泽棕红,酱香浓郁。     

多菌种酱油稀发酵对照试验

在稀发酵酱油发酵过程中添加多菌种试验,为研究多菌种发酵对酱油品质的影响。结果表明:多菌种发酵不但改善了酱油风味,而且氨基酸态氮和还原糖分别比单菌种发酵提升了16.1%和34 7%。     

蛋白酶固定化条件优化及在酱醪发酵中的应用

本文以海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、酶液与载体溶液体积比及固定时间为因素,优化中性蛋白酶固定化工艺,并将固定化中性蛋白酶凝胶颗粒应用于传统高盐稀态酱醪发酵,以缓解高渗透压环境对酶的胁迫作用,提高蛋白质利用率,缩短酿造周期。结果显示:当采用0.007 M海藻酸钠、0.27 M氯化钙,酶液与载体溶液体积比为12:30,固定2 h,固定化凝胶颗粒最稳定,相对酶活力最高;另外,酱醪发酵数据显示,酱醪总重17.5 kg,添加总酶量5.80 g(1000 U/g酶粉)时,外源游离蛋白酶和固定化蛋白酶试验组均能显著改善发酵过程各指标含量,平均缩短发酵时间20 d左右;与外源游离组相比,固定化试验组效果更加显著,蛋白质转化率较空白对照组与游离组分别提高达6.08%和1.88%。因此,在酱醪发酵过程添加固定化外源蛋白酶能有效提高高盐稀态酱油发酵蛋白质转化率,同时缩短发酵周期。