PMA-LAMP方法检测灭菌乳中金黄色葡萄球菌的研究

近年来,金黄色葡萄球菌引起的食品安全事件频发,这就需要建立一种快速准确地检测食品中金黄色葡萄球菌的方法。传统方法检测食品中金黄色葡萄球菌活菌存在很多缺点。由于细胞死亡后其DNA依然能够存活许久,所以传统方法不能有效区分DNA来自死菌还是活菌。通过荧光染料PMA与快速检测技术LAMP相结合的方法快速、灵敏的检测灭菌乳中金黄色葡萄球菌,并对死/活菌进行区分。根据金黄色葡萄球菌nuc基因设计引物,并对LAMP反应体系及PMA-LAMP方法进行优化,同时优化了灭菌乳中提取DNA的方法。在纯培养的金黄色葡萄球菌中,PMA-LAMP方法检测灵敏度为3.2CFU/mL,PMA-PCR方法的检测灵敏度为3.2×102CFU/mL;对人工污染灭菌乳中的金黄色葡萄球,PMA-LAMP方法检测灵敏度为5×101CFU/mL,而PMA-PCR方法检测灵敏度为5×103CFU/mL。整个反应需要大约6h,说明PMA-LAMP方法检测灭菌乳中金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄球菌活菌的新方法。     

食品中金黄色葡萄球菌检测方法研究进展

金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的重要致病菌之一,检测食品中金黄色葡萄球菌对于预防和控制金黄色葡萄球菌引起的食物中毒具有重要意义。论述和分析了传统培养方法、传统检测方法的改进、免疫学方法、以分子生物学为基础的快速检测方法以及商业化快速检测方法。     

多重LAMP—熔解曲线法检测食品中两种食源性致病菌

针对沙门氏菌的侵袭蛋白基因(inv A)和金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)设计LAMP引物,优化反应条件,并分别对反应产物进行熔解曲线分析,判断扩增结果,从而建立食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌多重LAMP—熔解曲线检测方法。对9株目标菌和23株非目标菌的检测未出现假阳性和假阴性结果,并可通过熔解曲线的熔解温度分析确定所含目标菌;对产物的测序分析表明所得序列与目的基因序列吻合;对目标菌的检测灵敏度均可达到10 fg/μL;对232份样品的检测结果显示,其中2份生猪肉中检出金黄色葡萄球菌。该方法具有良好的检测特异性,并可为食源性致病菌的快速检测提供一种重要技术手段。     

基于代谢标志物快速检测食品中金黄色葡萄球菌

采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术检测金黄色葡萄球菌的挥发性代谢产物,以3-甲基丁醛和3-甲基丁酸为候选标志物,考察其特异性、稳定性和实际应用情况。结果表明,在7.5%氯化钠肉汤增菌培养基中,金黄色葡萄球菌不能产生高于空白的3-甲基丁醛,而产生的3-甲基丁酸则是金黄色葡萄球菌的特异性代谢产物,该代谢产物的释放不受金黄色葡萄球菌菌株差异的影响,也不受与金黄色葡萄球菌共同培养的大肠杆菌O157:H7和肠炎沙门氏菌的影响,具有良好的稳定性。对于生鲜猪肉、生牛乳和米饭样品,挥发性代谢标志物检测法与传统培养法和聚合酶链式反应法的检测结果符合率很高,该方法操作简单,有望作为金黄色葡萄球菌活菌检测系统的补充方法,也为金黄色葡萄球菌活菌检测技术的开发利用提供了方法参考。     

实时逆转录聚合酶链式反应检测活的金黄色葡萄球菌

针对基于DNA水平的聚合酶链式反应(DNA-PCR)检测食品中金黄色葡萄球菌时会出现假阳性结果的缺点,建立一种能够区分死、活金黄色葡萄球菌的检测方法。根据金黄色葡萄球菌的femA基因,自设计Taqman探针、引物,采用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),以femA mRNA为检测对象,发现只有活的金黄色葡萄球菌显阳性,死亡的则呈阴性;纯培养时,重复检测变异系数为0.15,灵敏度为9×102CFU/mL,检出限可达1/3 CFU/3 mL。实验表明,该研究所建立的一步法逆转录聚合酶链式反应检测法,不仅灵敏度高、特异性强,而且能够有效地区分死、活金黄色葡萄球菌。     

畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌可视化LAMP检测方法的研究

目的:建立一种设备要求简单、结果可视化的用于定性检测畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌的快速检测方法。方法:通过对羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)浓度、叠氮溴化丙啶(propidium monoazide,PMA)浓度等的优化,结合环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立一种PMA-HNB-LAMP联用的可视化的用于快速检测畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌的方法,对其特异性、灵敏度进行测试,并用于人工污染样品和实际样品的检测。结果:本研究成功建立了LAMP扩增体系,并通过添加210 μmol/L HNB到LAMP扩增体系中,得到了差异明显的阴阳性结果。建立的HNB-LAMP法特异性强,其纯菌液灵敏度为104 CFU/mL,样品基质灵敏度为105 CFU/mL。本研究中用于处理样品的PMA浓度为10 μg/mL,处理条件为室温下避光孵育5 min,曝光15 min。在检测人工污染的样品时,PMA-HNB-LAMP法和传统微生物法检测结果一致。结论:本研究成功建立了可快速检测畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌的可视化PMA-HNB-LAMP法。     

实时荧光核酸恒温扩增技术检测食品中金黄色葡萄球菌的方法评价

目的 以传统国标培养法作为参比方法, 评价实时荧光核酸恒温扩增检测(real-time simultaneous amplification and testing, SAT)方法检测食品中金黄色葡萄球菌的能力。方法 依据 GB 4789.10—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》对SAT法检测食品中金黄色葡萄球菌的能力进行评价。分别检测纯培养物、人工污染样品以及实际样品来评价试剂盒的灵敏度、特异性、假阴性率、假阳性率和准确度, 同时采取2种方法的显著性差异分析, 确定最终结果。结果 SAT法灵敏度为100, 纯培养物检出限为103 CFU/mL, 人工污染检出限灵敏度为103 CFU/mL, 假阴性率为0、假阳性率为2.9%; 金黄色葡萄球菌的特异性符合要求。结论 SAT检测方法灵敏度高、特异性好, 假阳性率、假阴性率、准确度等检测结果全部达标, 并且检测时间短, 适用于食品中金黄色葡萄球菌的快速检测。     

速冻面米制品中金黄色葡萄球菌和肠毒素A基因三重PMA-qPCR快检方法的建立

为建立准确定量速冻面米制品中金黄色葡萄球菌活菌,筛查肠毒素sea基因并指示PCR反应假阴性的三重PMA-qPCR检测方法。针对金黄色葡萄球菌特异靶基因RpiR和肠毒素基因sea序列保守区,设计引物、探针和构建扩增内标,优化建立三重qPCR检测体系,建立PMA食品前处理方法去除死菌DNA,构建纯培养物和速冻面米制品中污染金黄色葡萄球菌的定量标准曲线,应用三重PMA-qPCR方法检测人工污染金黄色葡萄球菌的速冻面米制品。采用GB4789.10-2016中规定的选择平板计数法,评价三重PMA-qPCR方法的检测性能。结果表明,三重PMA-qPCR检测体系扩增效率高,特异性好。当食品中金黄色葡萄球菌污染量大于10~3CFU/g时,靶基因RpiR可获得有效扩增,污染量在10~3～10~7CFU/g之间时,扩增曲线线性良好(R~2=0.994),PMA-qPCR定量结果与平板计数结果一致性较好。当sea阳性菌株污染量大于10~3CFU/g时,应用PMA-qPCR方法可有效评估食品污染肠毒素A的风险。综上所述,本研究建立的三重PMA-qPCR检测方法操作简便,可快速定量检测速冻面米制品中金黄色葡萄球菌,评估食品污染肠毒素A的风险。     

基于TaqMan探针荧光定量PCR技术快速检测乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A

目的:建立检测金黄色葡萄球菌肠毒素A的Taq Man探针实时荧光定量PCR方法。方法:对金黄色葡萄球菌肠毒素A的基因序列分析、对比,设计特异性引物和Taq Man探针,建立对金黄色葡萄球菌肠毒素A的快速检测方法,并验证该方法的特异性、稳定性和灵敏性。结果:Taq Man探针荧光PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素A具有极强特异性,标准曲线相关系数为0.998,最低可检测出71个拷贝数的细菌DNA,检测乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A菌灵敏度为1.3×102CFU/m L,不同浓度质粒重复性扩增试验Ct值的变异系数均3%,显示了良好重复性。结论:Taq Man探针荧光定量PCR方法可以在6h内快速、准确地检出金黄色葡萄球菌肠毒素A,为金黄色葡萄球菌快速检测和食物中毒快速诊断提供技术支撑,推动了荧光PCR技术在食品安全检测方面的实践应用。     

食源性金黄色葡萄球菌青霉素类药物耐药基因型的分析

目的 建立多重PCR方法检测青霉素酶基因和mecA基因,了解食源性金黄色葡萄球菌两种β-内酰胺类药物耐药基因的分布情况,为金黄色葡萄球菌引起食源性疾病的防治提供参考数据.方法 建立多重PCR技术检测金黄色葡萄球菌青霉素酶基因、mecA基因和16S rDNA;多重PCR方法测定食品来源的171株金黄色葡萄球菌对青霉素类药物的耐药基因型.结果 165株菌携带有青霉素酶基因(96.5％),9株菌携带有mecA基因(5.3％).结论 建立的多重PCR检测方法快速、简便、准确,可满足高通量筛选菌株的需求;食源性金黄色葡萄球菌具有很高的青霉素酶基因携带率,并存在耐甲氧西林的菌株.     

肉中4种致病菌的PCR快速检测方法的建立

目的:建立一种能同时检测肉中金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌和单核增生李斯特菌的多重PCR检测方法。方法:根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)、沙门氏菌的侵袭蛋白基因(invA)、志贺氏菌的侵袭性质粒抗原基因(ipaH)和单核细胞增生性李斯特菌的内化素基因(inlA)设计引物,通过优化好的反应体系进行多重聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因。结果:特异性实验结果表明4种菌均能在相应位置扩增出特异性条带。对污染4种菌的猪肉进行检测,确定出金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的检出限是102CFU/mL,志贺氏菌和单核增生李斯特菌的检出限是101CFU/mL。结论:本实验建立的多重PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏,适用于肉中金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门菌和单核增生李斯特菌的快速检测。     

用免疫生物传感器快速检测金黄色葡萄球菌的初步研究

目的研究快速、经济、高灵敏的金黄色葡萄球菌新型检测技术。方法本研究应用F0F1-ATP酶旋转分子马达和免疫技术相结合,建立金黄色葡萄球菌的免疫生物传感器快速检测技术。首先pH变化敏感的荧光物质F1300标记到F0F1-ATP酶的载体色素体的内表面,然后在F0F1-ATP酶上连接β亚基抗体-生物素-链亲和素-生物素-金葡菌抗体复合体,得到可以捕获金黄色葡萄球菌的免疫生物传感器。传感器上负载菌量不同,引起的酶活性变化不同,酶活性变化又引起色素体内pH变化,最后通过F1300的荧光强度变化来检测菌量。结果该方法对金黄色葡萄球菌标准菌株(CMCC26003)的检测时间为4.5h,102～104CFU/孔呈现良好的梯度关系。结论该技术耗时短、操作简单、成本低、灵敏度高,符合食品安全检测技术发展要求。     

100份食品样品中金黄色葡萄球菌的检测情况

通过检测2016年玉溪市100份食品样品的金黄色葡萄球菌,了解易被金黄色葡萄球菌污染的食品类别,总结样品中分离出的典型菌和疑似菌的鉴定经验,分析几种方法用于鉴定过程中的优点和缺点。参考国家标准GB 4789.10-2010检测金黄色葡萄球菌,分离和鉴定疑似菌落,并与PCR方法比对。结果表明,肉类食品更易检出金黄色葡萄球菌,PCR方法可用于快速初筛,但仍需进行生化鉴定和血浆凝固酶试验确证。     

多重PCR检测4种常见食源性致病菌

目的 建立一种多重聚合酶链式反应法(multiplex polymerase chain reaction, MPCR)快速检测肉制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特氏菌的分析方法。方法 选取金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门氏菌SipB基因、志贺氏菌ipaH基因、单增李斯特菌inlA基因作为目标基因, 设计4对PCR引物, 建立并优化多重PCR反应体系, 评价该体系的特异性和灵敏度, 并对人工污染的熟肉样品进行检测。结果 构建的多重PCR方法特异性强、灵敏度高, 人工污染熟肉匀浆中4种致病菌的检出限为103 CFU/mL。结论 构建的多重PCR检测方法能够快速、准确、高效地检测肉制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特氏菌, 为食源性疾病菌的快速检测提供参考依据。     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测乳中携带sea基因金黄色葡萄球菌的研究

金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的一种常见的致病菌,而其产生的肠毒素A是乳及乳制品食物中毒事件的主要原因。本研究建立了SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测。该方法能快速、稳定地在8h内完成对乳中金黄色葡萄球菌的检测,对人工污染乳中金黄色葡萄球菌检测的最低检出限为83CFU/ml。     

食品中金黄色葡萄球菌PCR-ELISA检测技术建立

针对食品中金黄色葡萄球菌检测,选取金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因作为靶标,利用地高辛标记引物扩增的PCR产物与生物素标记的探针杂交,然后与ELISA平板上的链霉素杂交,通过抗地高辛抗体显色建立PCR-ELISA检测技术。应用该方法检测人工污染牛奶中金黄色葡萄球菌,同时将大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌等常见食源性致病菌作为阴性对照。结果显示,金黄色葡萄球菌的纯培养物以及人工污染金黄色葡萄球菌牛奶,金黄色葡萄球菌为阳性,其他对照菌为阴性,两者PCR-ELISA检测敏感性均为10~1CFU/m L,比普通PCR检测的敏感性(10~3CFU/m L)高100倍。因此,该研究建立的PCR-ELISA方法具有良好的特异性与敏感性,能够特异、敏感、准确地检测牛奶中的金黄色葡萄球菌,为食品中金黄色葡萄菌的快速鉴定、风险评估与有效监测提供重要技术手段。     

免疫磁球捕获-PCR检测牛奶中金黄色葡萄球菌的研究

对免疫磁球捕获-PCR(IMS-PCR)检测牛奶中金黄色葡萄球菌进行了初步研究。优化了免疫磁球制备参数,确定了金黄色葡萄球菌免疫磁球对目标菌的结合时间。研究结果显示,当纯菌浓度为101~104CFU/m L水平时,金黄色葡萄球菌免疫磁球对目标菌的捕获率大于80%。通过对目标菌和非目标菌的检测,IMS-PCR检测方法显示了很强的特异性;在纯培养、无需增菌情况,IMS-PCR检测方法检测限为104CFU/m L;牛奶中的金黄色葡萄球菌经磁分离后增菌2h用PCR检测,可检测出104CFU/m L的金黄色葡萄球菌。     

金黄色葡萄球菌活的非可培养状态复苏及PMA-qPCR检测

为研究金黄色葡萄球菌活的非可培养（VBNC）状态的复苏问题,采取温度、盐度和酸度3个因素复合诱导制备VBNC菌,尝试四种复苏方法,并以荧光定量PCR和PMA-qPCR技术结合的方法进行检测。结果证明：8%无菌Tween80可以使VBNC状态金黄色葡萄球菌48 h后复苏,同时PMA-qPCR能够有效检出VBNC状态金黄色葡萄球菌,克服传统平板计数法对于VBNC菌的漏检。     

SYBR Green I荧光定量PCR检测乳中携带sea基因金黄色葡萄球菌的研究

金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的一种常见的致病菌,而其产生的肠毒素A是乳及乳制品食物中毒事件的主要原因.本研究建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测.该方法能快速、稳定地在8h内完成对乳中金黄色葡萄球菌的检测,对人工污染乳中金黄色葡萄球菌检测的最低检出限为83CFU/ml.     

食源性混合病原菌生物被膜行为对金黄色葡萄球菌毒素因子转录水平的影响

以食源性病原菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肠炎沙门氏菌)形成的混合菌生物被膜为研究对象,对其定性和定量检测,通过实时荧光定量PCR方法分别检测单一菌和混合菌生物被膜中金黄色葡萄球菌28种目的毒素基因转录水平的变化。结果表明,结晶紫染色法、银染法和扫描电镜法均表明混合菌在培养24 h时达到最大黏附度;混合菌生物被膜中3种细菌的活菌数均低于单菌生物被膜中的活菌数;28种毒素基因在金黄色葡萄球菌中均被检出,且混合菌相对于单一菌生物被膜,上调量显著的有肠毒素基因sep、ser,显著下降的有溶血素基因hla和脱皮毒素基因etd,肠毒素基因seb表达量相等。