乳中志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法的建立

为了快速、有效的检测乳中的志贺氏菌,建立一种特异性强、灵敏度高的荧光定量PCR方法。根据GenBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,对提取的志贺氏菌DNA模板进行PCR扩增,对目的基因进行克隆和测序,然后利用荧光定量PCR方法,对志贺氏菌进行检测,确定其扩增条件。建立的方法特异性强,检测的灵敏度可达到10-6 ng/μL。利用建立的方法可检测乳中2.84 cfu/mL的志贺氏菌。该方法为快速、准确检测乳中的志贺氏菌提供了参考。     

基于量子点的志贺氏菌sFLISA检测方法研究

目的本研究建立基于量子点的志贺氏菌s FLISA检测方法并进行验证。方法以志贺氏菌多克隆抗体为包被抗体,以生物素标记的志贺氏菌单克隆抗体为第二抗体,以量子点标记的链酶亲和素进行荧光定量检测。结果试验确定志贺氏菌s FLISA检测最佳条件:包被抗体浓度为1.25μg/m L,生物素标记的单克隆抗体稀释倍数为1:400,量子点标记的链酶亲和素稀释倍数为1:100;特异性检验表明,s FLISA方法仅与志贺氏菌出现阳性反应,而与大肠埃希氏菌、沙门氏菌、葡萄球菌、李斯特氏菌、变形杆菌、副溶血弧菌、芽孢杆菌等均呈阴性反应。结论本研究建立的基于量子点的志贺氏菌s FLISA检测方法的最低检出量为3.5×104 CFU/m L,实现了对志贺氏菌高通量定性和定量检测。     

进出口动物源性食品中志贺氏菌检验方法优化

为建立进出口动物源性食品中志贺氏菌检验方法,从检测条件入手,通过增菌方式、分离培养基特异性和生化鉴定优化方法,以不同种类食品检测和不同实验室检测验证方法。确定的检测条件为志贺氏菌增菌液中(41.5±1)℃厌氧培养16～20h作为志贺氏菌检测的增菌方式;在分离上,同时使用MAC、XLD和HE三种平板,以提高志贺氏菌的检出率;选择了微量生化管和API20E对志贺氏菌和其他肠杆菌进行了生化鉴定和比较,效果明显。以此方法检测人工污染食品均检出志贺氏菌,各实验室也均检出志贺氏菌。     

抗志贺氏菌IgY的提纯及建立间接ELISA检测志贺氏菌

采用水稀释法提纯抗志贺氏菌IgY,检测10mg/mL纯化抗志贺氏菌IgY的效价为1∶320,并以此IgY为基础建立间接ELISA检测志贺氏菌,测定志贺氏菌纯培养液的检出限为105～106cfu/mL。对蜡样芽孢杆菌等10株不同菌株的检测结果表明,该方法对志贺氏菌有明显的检测特异性,对所测定的其它菌株无交叉反应。     

原料乳中志贺氏菌的实时荧光环介导等温扩增技术研究

为了建立原料乳中志贺氏菌快速检测的有效方法,提高志贺氏菌的检出效率。研究根据Gen Bank中志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因(ipa H),设计特异性LAMP引物,将SYBR GreenⅠ荧光染料结合到LAMP扩增技术中,通过实时荧光监测仪优化Mg~(2+)、d NTPs、温度和引物等反应条件,建立了实时荧光环介导等温扩增技术检测志贺氏菌的反应体系,对纯菌的菌悬液及原料乳人工污染样品中的志贺氏菌进行检测,并对该检测方法的特异性、灵敏度进行了研究,并与普通的LAMP检测方法进行比较。结果表明,该检测方法特异性强灵敏度高,纯菌的菌悬液灵敏度和人工污染样品的检出限都能够达到100 cfu/m L,且灵敏度高于普通的LAMP检测方法。综上所述,研究建立的实时荧光LAMP检测方法灵敏度高、特异性强、耗时短,且检测结果直观易于分析,适用于快速准确监测原料乳中志贺氏菌的污染情况。     

反转录-环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌

建立了反转录-环介导等温扩增技术的志贺氏菌快速检测方法。针对志贺氏菌特异保守基因ipa H设计多套引物,建立优化了的反应体系,并评价其准确性、特异性、灵敏度。以人工污染脱脂乳样品比较RT-LAMP与RT-PCR的灵敏度。结果表明,在65℃等温条件下,RT-LAMP反应可在30 min内完成。在活菌/损伤菌模型中,该方法表现出比国标法更好的准确性。在23株细菌标准菌株中仅对4株志贺氏菌有特异性检出。志贺氏菌RNA模板的检测灵敏度为7 fg/μL。人工污染脱脂乳样品检测灵敏度达到40 CFU/g,比RT-PCR方法高出2个数量级。表明所建立的志贺氏菌RT-LAMP扩增方法可以准确的检测志贺氏菌,同时具有快速、特异、灵敏的优势,可用于志贺氏菌的快速筛查和现场监控。     

志贺氏菌传统检验方法研究进展

志贺氏菌是引起人类肠道疾病的常见致病菌,尤其在一些发展中国家致病率较高。为了有效地预防、治疗和控制水、饲料以及食物中的传染病,快速检测和鉴定志贺氏菌具有十分重要的意义。本文综述了近年来传统的志贺氏菌检测方法的进展,并介绍了这些方法的优缺点,为常规检验用志贺氏菌培养基的改进提供参考。     

牛奶中志贺氏菌PCR检测方法的建立

根据Genbank志贺氏菌侵袭性质粒抗原H (ipaH)基因序列, 自行设计引物, 扩增特异的326 bp核酸片段, 经过优化PCR扩增条件, 建立了志贺氏菌特异、敏感、快速的PCR检测方法, 并对牛奶中的志贺氏菌进行了检测.特异性试验结果表明, 志贺氏菌参考菌株均能扩增出特异的核酸片段, 大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌的扩增结果均为阴性.敏感性试验结果表明, 采用试剂盒提取基因组, 该方法的敏感性可达到1.75×102 cfu/mL.人工污染牛奶的模拟检测结果表明, PCR方法的检测限为1.75×103 cfu/mL.     

检测食品中志贺氏菌的双抗夹心ELISA方法的研究

研究获得纯化抗志贺氏菌IgY,经检测10mg/mL纯化抗志贺氏菌IgY的效价为1∶320;以志贺氏菌免疫新西兰大耳白兔,获得抗志贺氏菌的兔抗体,效价可达1∶12800。以此两种抗体建立双抗夹心ELISA,正交试验分析表明,兔抗体包被条件为4℃过夜,采用不封闭,抗原与包被抗体结合条件为37℃、1h;加入检测抗体(IgY)的浓度为0.25mg/mL,其结合条件为37℃、1h。该方法对纯培养菌液检出限为105cfu/mL,具有良好的敏感性;10株其他菌株的检测结果表明,该方法只与志贺氏菌发生特异性反应,不与其他菌株的抗原发生交叉反应。染菌的食品样品经选择性增菌后进行双抗夹心ELISA检测,含0.1～1cfu/mL志贺氏菌的样品在增菌13h后可检出阳性反应,含1～10cfu/mL志贺氏菌的样品在增菌11h后可检出阳性反应。     

食品中检测志贺氏菌的实时荧光RPA方法的建立与应用

本研究旨在建立志贺氏菌的实时荧光重组酶聚合酶扩增技术real-time RPA)检测方法。根据志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)的保守序列设计引物及exo探针,利用荧光检测设备实时监控反应进程,在39℃恒温下20 min即可完成检测。该方法特异性扩增志贺氏菌,对非志贺氏菌无扩增;以志贺氏菌基因组DNA为模板,该方法的检测灵敏度为3.5×10-3ng/μL,同已发表的real-time PCR方法一致。人工污染试验表明,当鸡肉、西兰花样品污染量为9 CFU/25g,增菌时间为8 h时,即可通过real-time RPA方法检出志贺氏菌。在人工污染试验中,real-time RPA和real-time PCR检测结果一致,而前者仅需7～12 min,后者则至少需要35 min(Ct值为27～34之间)。本研究建立的志贺氏菌real-time RPA方法特异性强,灵敏性高,反应时间短,操作方便,为食源性致病菌检测提供了一个新的技术平台。     

TaqMan探针双重荧光PCR技术检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌

目的 建立TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌的方法。方法 通过比对沙门氏菌和志贺氏菌的基因组序列,选择同源性高、保守性好的区域设计特异性引物和探针,经过引探筛选、浓度调试等一系列优化,建立了食源性沙门氏菌和志贺氏菌双重荧光PCR核酸检测方法,并对其特异性、质粒最低检出限、菌液敏感性、重复性、稳定性以及实际样品进行了验证。结果 该方法与大部分食源性致病菌无交叉反应,特异性强;沙门氏菌和志贺氏菌质粒的最低检出限可达5 copies/μL,沙门氏菌菌液敏感性为1.0×102 cfu/mL,志贺氏菌菌液敏感性10 cfu/mL;质粒和菌液核酸梯度的批内和批间变异系数均在0.177%~1.958%之间,小于5.0%,具有较强的稳定性;标准曲线相关系数(R2)均大于0.999。结论 本研究成功建立了一种TaqMan探针双重荧光PCR技术同时检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌的方法,该方法扩增时间短,只需要30min即可,而且特异性强、稳定性好,可用于疑似沙门氏菌和志贺氏菌污染样品的检测,为食品安全的快速检测提供技术支撑。     

牛奶样品中志贺氏菌的快速PCR检测技术研究

建立牛奶中快速检测志贺氏菌的有效方法。根据GenBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,筛选合适的DNA模板制备方法,采用快速常规PCR和定量实时PCR结合,对培养液中及牛奶阳性样品中的志贺氏菌进行检测,检测敏感度可达到2CFU/ml,检出时间小于20h。新建的PCR方法具有特异性好,灵敏度高等特点,适用于快速、准确检测牛奶中志贺氏菌的需要。     

乳饮料中志贺氏菌的快速PCR检测技术研究

建立乳饮料中快速检测志贺氏菌的有效方法。根据GeneBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,筛选合适的DNA模板制备方法,采用快速常规PCR和定量实时PCR结合,对培养液中及乳饮料阳性样品中的志贺氏菌进行检测,菌液敏感度可达到2cfu／mL,检出时间小于20h。新建的PCR方法具有特异性好,灵敏度高等特点,适用于快速、准确检测乳饮料中志贺氏菌的需要。     

一种快速筛查志贺氏菌的荧光纳米免疫层析方法的建立

本文以建立志贺氏菌荧光纳米颗粒免疫层析法为目的。首先,制成志贺氏菌单抗-荧光纳米颗粒偶联物,以双抗体夹心模式制备志贺氏菌免疫层析试纸条。利用微型手持荧光检测仪读出质控线和检测线上的荧光信号,并利用荧光强度来半定量检测志贺氏菌。结果显示:用本研究建立的荧光纳米颗粒试纸条检测30株菌,对宋内志贺氏菌和福氏志贺氏菌呈阳性结果,其余菌株的呈阴性结果,试纸条灵敏度为9.0×104 CFU/m L。用志贺氏菌免疫层析试纸条和标准法检测60份样品,两种方法的总符合率为88.3%。结论:本研究成功建立了志贺氏菌的荧光纳米免疫层析检测方法,能够快速检测志贺氏菌,具有良好的特异性和灵敏性,便于开展现场快速检测。     

奶粉中病原菌质控考核结果分析

目的 对质控考核样品进行检测, 分离鉴定肠杆菌科志贺氏菌属A群痢疾志贺氏菌和金黄色葡萄球菌, 并分析其中特别的生物学现象。方法 按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 (GB 4789.5-2012)》对考核检样进行检测。结果 分离出宋内志贺氏菌而未分离出金黄色葡萄球菌, 并在检验过程中观察到特别的生物学现象。结论 志贺氏菌在志贺氏菌属显色培养基上并非显示一样颜色, 有白色菌落周围培养基显示紫红色,也有黄色菌落周围培养基显示黄色。     

食品中志贺氏菌检测技术研究进展

志贺氏菌是主要的食源性致病菌之一,其低感染剂量和严重危害性受到人们广泛关注。因此,探究出快速、灵敏、高效的志贺氏菌的检测方法,对于保障食品质量安全是至关重要的。志贺氏菌的检测方法可分为三大类:传统培养方法、免疫学方法和分子生物学方法,许多研究为使其在样品检测中更加实用,进行了不同程度的改进。本文综述近年检测志贺氏菌的技术,包括改良的传统方法、免疫学方法和分子生物学方法以及新兴检测方法。重点阐述这些方法的应用范畴和应用进展,为志贺氏菌检测方法的选择提供参考。     

基于免疫磁分离-双重荧光定量PCR的鲜猪肉中沙门氏菌和志贺氏菌的检测

目的使用免疫磁分离-双重荧光定量PCR方法实现对鲜猪肉中金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的同时、快速检测。方法在37℃的条件下,利用特异性免疫磁球从250 m L循环体系中快速、有效地捕获目标菌。再通过特异性的引物与探针,对沙门氏菌和志贺氏菌进行双重荧光定量PCR检测。结果本研究方法针对鲜猪肉中沙门氏菌和志贺氏菌的检测限分别达到3.4 cfu/g和9.4 cfu/g。方法总体灵敏度、特异性和准确度均达到100%。此外,通过对30组实际样品的检测,该方法与传统标准方法的结果保持一致。结论本研究建立的免疫磁分离-双重荧光定量PCR方法比国标方法更快速和高效,适用于鲜猪肉中沙门氏菌和志贺氏菌的快速检测。     

牛奶样品中志贺氏菌胶体金免疫试纸条检测方法的建立

通过用超声波破碎的宋内氏志贺氏菌和福氏志贺氏菌的菌体碎片为免疫原免疫BALB/c小鼠,获得4株能稳定分泌抗志贺氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,选取其中一株制备单抗,并用胶体金标记。同时抗志贺氏菌的兔多抗和驴抗鼠抗体(二抗)分别喷涂于硝酸纤维素膜作为检测线(T线)和质控线(C线),研制了志贺氏菌胶体金快速检测试纸条。结果显示试纸条的灵敏度为105mL-1,并只与两株志贺氏菌有阳性反应外,而与其它23株常见的细菌无交叉反应。同时在检测添加有阪崎肠杆菌和长双歧杆菌的牛奶样品中,结果显示试纸条的灵敏度为106mL-1。志贺氏菌免疫胶体金试纸条的建立,为加强食品中志贺氏菌的检测工作,建立一种快速、简便的筛查方法具有重要的意义。     

肉制品中志贺氏菌DNA的快速提取方法

肉制品中致病菌DNA的提取对PCR检测具有重要意义。以污染志贺氏菌的猪肉为材料,比较了沸水浴法、裂解液煮沸法、CTAB/SDS法、改良的碱性异硫氰酸胍法4种提取方法对志贺氏菌DNA的提取效果,并以提取的DNA为模板进行PCR检测。结果表明:改良的碱性异硫氰酸胍法提取志贺氏菌DNA的效果较好,猪肉中志贺氏菌的PCR最低检出限为5×100CFU/g,整个检测时间<8h。经改良的碱性异硫氰酸胍法操作简便、经济省时,可用于肉类的PCR检测。     

水产品中志贺氏菌双抗夹心ELISA检测方法建立与应用

志贺氏菌（Shigella）通称痢疾杆菌,是一类具有传染性强和危害严重的革兰阴性食源性致病菌,广泛污染各类动物源性食品。该研究将志贺氏菌经0.5%福尔马林溶液灭活后,多次免疫雌性大耳兔获得抗志贺氏菌多克隆抗体,以抗志贺氏菌多克隆抗体作为捕获抗体,以辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记抗志贺氏菌多克隆抗体作为检测抗体,建立快速检测志贺氏菌双抗夹心酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）方法。结果表明：建立的双抗夹心ELISA方法检测曲线的线性范围为4.12×104cfu/mL～3.4×106cfu/mL,检测限为4.12×104 cfu/mL;用此体系检测大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌等无交叉反应;水产品实际样品志贺氏菌检出限（limit of detection,LOD）为105cfu/mg,具备较好的灵敏性和特异性。