不同非氧化磷酸戊糖途径基因的过表达对酿酒酵母木糖发酵性能的影响

以双拷贝过表达木糖代谢上游途径关键酶(木糖还原酶XR、木糖醇脱氢酶XDH和木酮糖激酶XKS)的酿酒酵母菌株为背景,在过表达非氧化磷酸戊糖(PP)途径中转醛酶基因TAL1的基础上,对途径中其他基因TKL1(转酮酶)、RPE1(核酮糖-5-磷酸差向异构酶)和RKI1(核酮糖-5-磷酸异构酶)进行了不同程度的过表达,以研究PP途径基因过表达对酿酒酵母木糖代谢的影响。在不同培养基条件下对重组菌株木糖代谢进行研究,结果显示,在过表达TAL1的基础上不同组合过表达PP途径其他基因不同程度改善了酿酒酵母木糖发酵性能,重组菌株能在36~48 h耗完质量分数(下同)为5%的木糖。其中,过表达PP途径全部基因比其他过表达基因组合表现出明显的优势,在8%木糖发酵条件下其乙醇产量达到了每1 g木糖0.337 g,较对照菌株提高了7.86%。这说明同步过表达PP途径基因更有利于酿酒酵母木糖发酵。     

酿酒酵母采用木糖发酵产乙醇的研究现状

酿酒酵母具有安全性好,高产量和高的抑制剂耐受性等优点,故一直在生物乙醇工业中有重要作用。然而该酵母不能使木糖发酵,而木糖是木质纤维素水解产物中重要的戊糖。为了得到利用木糖高效产乙醇的工程茵,我们通过引入初始木糖的新陈代谢和木糖的运输体来改变细胞内的氧化还原平衡．木酮糖激酶的过表达和磷酸戊糖途径来提高乙醇产率。     

LSM蛋白增强木糖发酵重组酵母抗逆性能的研究

木质纤维素原料预处理过程中产生的弱酸、呋喃醛类和酚类化合物等对酿酒酵母的乙醇发酵有抑制作用,提高基因重组酵母对抑制物的耐受性,是利用植物秸秆水解液生产燃料乙醇的关键技术之一。研究从前期构建的戊糖、己糖共发酵重组酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae ZU-E8基因组DNA中克隆出RNA结合蛋白LSM6,将其连入含有PADH启动子的质粒构成表达载体pR-LSM,进而转入ZU-E8宿主细胞中。通过高浓度醋酸根平板筛选,得到高抗逆性木糖发酵重组酵母ZU-910。在醋酸浓度为2 g·L-1的木糖培养基中发酵96 h后,ZU-910的木糖利用率和乙醇浓度为90.2%和26.9 g·L-1,分别是出发菌株ZU-E8的8.5和10倍,并且ZU-910对糠醛和硫酸根的耐受能力也较ZU-E8大大增强。在玉米秸秆酶解液发酵中,ZU-910的木糖利用率和乙醇产量在ZU-E8基础上增加了10.5%和7.7%.证明LSM6蛋白确实能够增强木糖发酵重组酵母的抗逆能力,提高其发酵性能。该研究成果在木质纤维素替代粮食生产乙醇的产业化进程中具有良好的应用前景。     

木糖还原酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的定向整合

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是重要的乙醇生产菌株,但因缺少戊糖代谢途径而不能利用木糖,为了改良工业酿酒酵母利用半纤维素发酵生产乙醇的性能,利用分子生物学技术构建能够利用木糖的基因工程酵母。选取酿酒酵母染色体的rDNA重复序列作为外源基因整合位点,依此构建多拷贝染色体整合型载体pUG-LR。采用融合表达策略扩增得到含有酿酒酵母乙醇脱氢酶启动子PADH和树干毕赤酵母木糖还原酶基因xyl1的融合序列,并将其插入pUG-LR载体中,构建成含遗传霉素G418抗性标记的同源重组质粒pUG-LR-XYL1。以工业酿酒酵母ZU-01为宿主,通过优化后的电穿孔法将重组质粒导入经缓冲液处理的酵母细胞,30℃培养。通过提高YEPX复筛培养基G418浓度,得到10株生长较快的优良性状转化子。在不含G418的YEPX培养基上传代8次以上,以转化子基因组DNA为模板,进行PCR检测,均可获得目的基因片段。研究结果表明:木糖还原酶基因xyl1已定向整合于ZU-01染色体DNA上并稳定遗传,为后续构建工业酿酒酵母的木糖代谢通路、利用木糖产酒精的重组菌株奠定了基础。     

低甘油产率的酿酒酵母工程菌构建研究进展

酿酒酵母具有安全、遗传背景清楚、生长速度快、高糖耐受性、高乙醇产量以及高胁迫耐受性等特性,是乙醇生产较为理想的细胞工厂.甘油是酿酒酵母发酵产乙醇过程中的一种主要伴生副产物,过量表达甘油影响糖醇转化率.通过基因工程改造甘油代谢和乙醇生产途径,是降低甘油产量和提高乙醇转化率的有效策略.首先分析改造酿酒酵母细胞中甘油和乙醇代谢路径,阐明甘油在酿酒酵母中生理功能;然后,根据甘油合成途径、分解途径和NAD+/NADH代谢途径,分析低甘油产率的酿酒酵母工程菌构建的技术路径,比较各种基因改造策略对甘油合成和乙醇产率的影响;最后,针对基因整合技术、工程菌遗传稳定型以及工程菌代谢负担加重方面存在的问题,提出可供参考的解决方案,为构建酿酒酵母工程菌高效生产乙醇提供参考.     

纤维素乙醇生产重组酿酒酵母菌株的构建与优化研究进展

寻找化石能源的替代品以及开发和利用生物能源已引起国内外研究者的广泛关注。提高酿酒酵母利用来源广泛、贮存丰富的农林废弃物等木质纤维素原料生产燃料乙醇的效率是生物能源的重要研究内容,但是,重组酿酒酵母木糖发酵性能低是限制纤维素乙醇经济性的关键问题。本文总结了酿酒酵母中木糖代谢途径的构建和优化以及木糖转运对木糖利用的影响,分析了重组酵母利用纤维素水解液进行乙醇发酵的研究现状,并对进一步提高重组酿酒酵母纤维素乙醇生产效率的研究趋势进行了展望。目前国内外已经构建了可有效利用木糖产乙醇的重组酵母,但对其木糖代谢机制的研究还尚未深入,限制了重组菌株的定向改造。此外,目前缺少在纤维素生物质水解液发酵实际应用过程中对重组菌株的评价。因此,加强重组酵母菌株对木糖利用相关代谢调控机理的分析,注重多种抑制物对菌株发酵性能的影响,结合真实底物纤维素乙醇发酵过程进行重组菌株的构建和优化,从而进一步提高纤维素乙醇生产的经济性,是未来菌株构建的重要研究方向。     

缺失PHO13基因与进化工程构建高效利用木糖酵母

过表达了木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶基因的重组工业酿酒酵母菌株KAM-6X内缺失了编码对硝基苯磷酸盐磷酸化酶的PHO13基因,接着通过EMS诱变和进化工程筛选,获得了一株高效利用木糖的菌株,命名为PE。有氧条件下,在含50 g/L木糖和100 g/L木糖的YPX中最大比生长速率分别为0.299和0.282 h^-1,分别比出发菌提高了95.43%和102.87%,同时PE菌株能在前24 h内耗掉36.12 g/L木糖,48 h内耗掉70.25 g/L木糖。微好氧条件下副产物产量降低,糖醇转化率最高达到0.382 g/g,证明PE是一株高效利用木糖发酵的工业酵母菌株。     

整合型酿酒酵母菌株强化发酵和特性比较

为了提高木糖异构酶基因在重组酿酒酵母体内的稳定性,并比较不同真菌来源的木糖异构酶在木糖或者葡萄糖-木糖培养基的发酵利用特性,分别构建来自Piromyces sp.E2和Orpinomyces sp.的木糖异构酶基因的整合表达载体,利用同源重组将其整合进入呼吸缺陷型菌株的18S rDNA非转录区,结果测得Orpinomyces的木糖异构酶酶活活力为0.72 U/mg,比Piromyces的木糖异构酶酶活高2.8倍。在木糖培养基中发酵获得乙醇的得率分别为0.40 g/g和0.48 g/g。且整合入Orpinomyces的木糖异构酶基因菌株能获得最高酶活和乙醇得率。     

重组大肠杆菌的构建及利用木糖生产木糖醇的研究

xylB基因失活可以降低木酮糖的磷酸化,使木糖还原为木糖醇而不进入PPP途径。利用Red重组技术构建xylB缺失大肠杆菌DxylB/E.coli BL21(DE3)可以提高木糖醇的产率。通过PCR克隆得到来自Neurospora crassa的木糖还原酶基因xr,将该基因与载体p ET30a(+)连接构建表达质粒p ET30a-xr;PCR克隆得到来自E.coli K-12的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6-PGDH)基因gnd和葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH)基因zwf,依次与双启动子原核表达载体p CDFDute-1连接构建表达质粒p CDFDuet-gnd-zwf;将上述构建好的两个重组质粒同时转化到DxylB/E.coli BL21(DE3)宿主体内。经异丙基-?-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得分子量约为38、51、54 k D的三种蛋白,酶活测定显示,重组菌种XR的比酶活为7.25 U×mg-1,6-PGDH的比酶活为2.26 U×mg-1,G6PDH的比酶活为1.31 U×mg-1。5 L发酵罐发酵结果显示,xylB基因敲除可以提高木糖醇的产率,含NADPH再生系统的菌株木糖醇的体积产率是1.04 g×(L×h)-1,比只含有木糖还原酶的重组菌株0.88 g×(L×h)-1高24.32%,为后续工业化利用大肠杆菌生产木糖醇奠定了基础。     

Pro-sigmaK inhibitor-BofA基因敲除对嗜热厌氧杆菌SCUT27葡萄糖和木糖利用的影响

嗜热厌氧杆菌SCUT27(Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27,SCUT27)能同时利用木糖和葡萄糖,是发酵廉价木质纤维素获得乙醇及乳酸的优势菌株。为了提高该菌株对木糖和葡萄糖的利用效率,对其在葡萄糖、木糖和混合糖下不同时间点转录组数据分析的基础上,敲除pro-sigmaK抑制因子BofA(pro-sigmak processing inhibitor BofA,BofA)基因,获得基因工程菌ΔbofA。摇瓶发酵结果显示,与出发菌相比,当以木糖为唯一碳源时,突变株ΔbofA对木糖的代谢速率提高51.43%,乳酸产率提高23.53%;以混合糖(葡萄糖:木糖为=1:1)为碳源时,ΔbofA对木糖的代谢速率提高44.44%,乳酸和乙醇的产率分别提高43.75%和20.00%。由此可见,pro-sigmaK抑制因子BofA是木糖利用的负调控因子,其功能有待进一步研究。     

Effect of glucose:xylose ratio on xylose reductase and xylitol dehydrogenase activities from Candida guilliermondii in sugarcane bagasse hydrolysate

The influence of glucose on xylose reductase (XR) and xylitol dehydrogenase (XDH) enzyme activity was evaluated from sugarcane bagasse hydrolysate fermentations with different glucose:xylose ratios (1:25, 1:12, 1:5 and 1:2.5) by employing an inoculum of Candida guilliermondii grown in media containing glucose, a mixture of glucose and xylose, or only xylose as carbon sources. According to the results, the glucose:xylose ratio affected positively this bioconversion and a correlation was not observed between the favourable conditions for xylitol production and the XR and XDH activities. Also, the results were influenced not only by the glucose:xylose ratio in the fermentation medium, but also by the carbon source employed in the growth medium of the inoculum. The optimum condition for xylitol production by C. guilliermondii in sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate should use hydrolysate with a 1:5 glucose:xylose ratio and inoculum grown in medium containing xylose as the only carbon source. Copyright © 2006 Society of Chemical Industry     

木糖发酵菌种研究进展

综述了已发现的发酵木糖的天然微生物种类、木糖代谢途径及其机理以及近年来构建基因工程菌发酵木糖生产乙醇的研究进展.重点介绍了酿酒酵母、运动发酵单胞菌以及大肠杆菌的基因改造情况.     

ORP调控对马克斯克鲁维酵母发酵纤维素水解液的影响

采用通气的方式进行氧化还原电位（oxidation-reduction potential,ORP）调控,研究在添加抑制物条件下Kluyveromyces marxianus 1727-5利用葡萄糖、木糖以及两者混合体系的发酵性能,在此基础上考察了ORP调控策略对玉米秸秆水解液发酵的影响。研究结果表明：在调控ORP策略下,多种混合抑制物对酵母生长代谢造成的损害得以有效改善,细胞活性高,木糖、葡萄糖代谢速率加快。葡萄糖与木糖共发酵时,ORP调控至-150 mV时,葡萄糖发酵时间缩短近30%,木糖醇浓度由3 g·L^-1增加到10 g·L^-1。ORP调控策略也同样能有效缓解玉米秸秆水解液中较高浓度的多种抑制物对酵母细胞的胁迫,ORP为-100 mV时,相比于对照组,在保持终点乙醇不变的情况下,葡萄糖的发酵时间缩短了22%;木糖消耗由4.88 g·L^-1增至10.27 g·L^-1,木糖醇得率也由0.20 g·g^-1提高至0.48 g·g^-1。     

表达乙型肝炎表面抗原重组酿酒酵母工程菌发酵培养基配方的优化

目的优化重组酿酒酵母工程菌发酵培养基的配方,提高其表达HBsAg的水平。方法采用正交试验法对培养基配方进行优化,并对最佳培养基配方进行验证。结果最佳培养基配方为:在每50ml基础培养基中添加50%的甘油0.9ml和50%的蔗糖0.4ml,维持pH值为5.0。与基础培养基相比,以此培养基培养的工程菌表达HBsAg的水平平均可提高26%。结论在发酵过程中适当补充甘油和蔗糖,可以提高重组酿酒酵母工程菌表达HBsAg的水平。     

与膜耦合的细胞固定化串联发酵制乙醇的研究

利用植物纤维作为廉价的糖源生产燃料乙醇是解决世界能源危机的最有效途径.今研究采用海藻酸钙固定普通酿酒酵母细胞和嗜鞣管囊酵母细胞于两个串联的发酵罐内,连续发酵葡萄糖和木糖组成的糖液并与膜耦合来制取酒精.通过硅橡胶膜(PDMS)的渗透蒸发过程,将产品乙醇从发酵液中移出,减少了产物乙醇对发酵的抑制作用.实验结果表明,这套采用海藻酸钙固定酵母细胞进行连续发酵并与膜耦合的生物反应器系统,在稀释率为0.321 h-1下稳定运行,剩余葡萄糖和木糖浓度分别为0.134、4.921 g·L-1,乙醇得率为O.457 g(乙醇)·g-1(糖),是理论得率的92.64%.生产能力达到10.996 g·L-1·h-1.与其它发酵方式相比较,用海藻酸钙来固定细胞并与膜耦合的发酵过程可增大酵母细胞浓度,明显降低乙醇对酵母的抑制作用,并提高糖的转化率.     

重组酵母发酵半纤维素水解液生产酒精的研究

玉米秸秆中的半纤维素主要由五碳糖组成,普通的酿酒酵母不能发酵五碳糖。今利用基因重组酵母Sacchromyces cerevisiae ZU-10发酵玉米秸秆半纤维素水解液生产酒精,针对半纤维素水解液中的主要发酵抑制物,研究了硫酸根离子、乙酸、糠醛对重组酵母生长的影响,发现S.cerevisiae ZU-10细胞对SO42·,乙酸和糠醛的耐受浓度分别为5g·L·1、0.25g·L·1和0.08g·L·1。对玉米秸秆半纤维素的水解工艺进行了比较研究,结果表明,玉米秸秆采用1%H2SO4(固液比1:10),在95℃水解12h,其中的半纤维素水解率达到93%,发酵抑制物相对较少。半纤维素水解液经石灰中和、真空浓缩及离子交换处理后,可用于酒精发酵。半纤维素水解液的糖浓度与浓缩倍数及发酵抑制物浓度成正相关,对于重组酵母S.cerevisiae ZU-10,半纤维素水解液的适宜糖浓度为80g·L·1。在此浓度下,接种量1.2g·L·1(细胞干重计)、30℃、厌氧发酵96h,酒精浓度为31.05g·L·1,水解液中的木糖利用率达到95.85%。该研究结果对于促进半纤维素资源的转化利用,加速秸秆酒精的产业化进程具有重要意义。     

一种新型酿酒酵母固定化系统的建立

一种丝状真菌青霉菌被用来作为酿酒酵母的固定化材料,代替原来的物理学材料,当青霉菌被发酵产生的乙醇杀死之后,形成的微球体就可以用来继续后续的乙醇发酵。