干酪乳杆菌LC2W最优电转化条件的建立

目的 建立干酪乳杆菌LC2W电转化的最优条件 。方法 研究了不同质粒、细胞壁弱化剂浓度、电场强度、复苏时间以及质粒浓度对电转效率的影响,通过单因素轮换法进行了逐一优化。结果 经过对乳杆菌感受态制备及电转过程中各因素的考察,得到最佳的参数条件为：添加1 %甘氨酸作为细胞壁弱化剂制成感受态细胞,电场强度为10 kV/cm进行高压电击后,复苏3 h,质粒浓度为200 ng/μL时,能够达到最高的电转效率为1.25×106 CFU/μg DNA。结论 经优化后,获得了较高的转化水平,可用于指导多种乳杆菌的高效电转,并且为下一步的LC2W菌株改造和基因功能探究奠定了基础。     

一株无内源质粒短乳杆菌的电转化条件

以质粒p MG36e,p NZ8148,p NZ9530和无内源质粒的短乳杆菌(Lactobacillus brevis CGMCC1306)为材料,通过对短乳杆菌感受态制备及电转化过程中各影响因素的考察,建立了最佳的电转化实验条件。结果表明:添加质量分数1%甘氨酸作为细胞壁弱化剂,于MRS培养基中37℃静置培养至对数中期(OD600=0.4~0.6),以0.5 mol/L蔗糖、5 mmol/L KH2PO4、0.5 mmol/L Mg Cl2(p H 7.4)为洗涤剂,以1 mol/L蔗糖、3 mmol/L Mg Cl2为电击缓冲液制成感受态细胞,加入400 ng的质粒DNA,调节电场强度为10 k V/cm,电击3.5 ms,于含有0.3 mol/L蔗糖的MRS培养基中复苏培养3 h,获得最佳转化率。为外源基因电转化短乳杆菌提供了实验依据,也为短乳杆菌遗传改造及基因功能探究奠定了实践基础。     

食品微生物肉葡萄球菌的高效转化技术研究

肉葡萄球菌是广泛应用于发酵肉制品的食品微生物,然而,该菌在发酵制品中的生长代谢机理目前尚未可知,究其原因与基因工程操作中质粒转化难、无法建立成熟的分子生物学体系密切相关。肉葡萄球菌具有厚且致密的刚性细胞壁和限制性修饰(RM)系统,导致电转化的再现性差、效率低。本试验研究了电击缓冲液、电场强度、质粒质量浓度、复苏培养基以及质粒修饰和感受态细胞的高温热处理对肉葡萄球菌pCA44电转化效率的影响,并进行电转方案优化。结果表明:用10%甘油与0.5 mol/L甘露醇洗涤制备感受态细胞,加入500 ng/100 μL经大肠杆菌DC10B修饰的质粒,56 ℃高温热处理肉葡萄球菌pCA44感受态细胞2 min后,在电场强度10 kV/cm的条件下电击质粒与细胞混合物,且电击结束后立即加入含有0.5 mol/L甘露醇的复苏培养基RGM2,得到的肉葡萄球菌pCA44电转化效率最高,达到6.26×105 CFU/μg,且随机挑取转化子进行PCR验证均是阳性。本研究获得的电转方案显著提高了肉葡萄球菌pCA44电击转化效率,可为其发酵代谢机制解析提供技术支持,并为后续其它含有RM系统屏障的葡萄球菌系菌株提供参考。     

鼠李糖乳杆菌电转化条件的研究

目的:研究不同因素对鼠李糖乳杆菌电转化效率的影响,探讨电转化的最适条件,提高电转化效率。方法:以鼠李糖乳杆菌05-28为受体菌株,大肠杆菌-乳酸菌穿梭型质粒p MG36e为载体,通过原生质体电转化的方法研究了质粒浓度、电击缓冲液、电转化参数、复苏培养基组成及复苏培养时间对电转化效率的影响。结果:利用1μL质量浓度为1μg/μL的质粒p MG36e,在电场强度8 k V/cm,电阻200Ω,电容25μF的条件下进行电击转化,以含有0.5 mol/L蔗糖和20 mmol/L的MgCl_2、CaCl_2且无吐温80的MRS再生培养基复苏培养2.5 h,并采用添加红霉素的筛选培养基,获得1.66×105CFU/μg DNA的电转化效率。结论 :实现了鼠李糖乳杆菌的高效遗传转化,为遗传育种提供了技术支持。     

利用组成型表达载体pMG36e电转化德式乳杆菌保加利亚亚种的研究

以典型的乳酸菌组成型表达质粒pMG36e为载体,德式乳杆菌保加利亚亚种为受体.采用电转化方法研究受体菌株的生长状态与细胞壁处理方式、质粒浓度、电转化参数、复苏培养基组成与复苏培养时间、受体菌株的限制修饰作用对电转化效率的影响,探讨电转化的最适条件,以提高电转化效率.结果表明:选择含2.5%甘氨酸的SMRS培养基培养受体细胞至对数中期,收获制成感受态细胞,在电场强度12 kV/cm、电阻200Ω、电容25μF条件下电击转化,以含20 mmol/L MgCl2、CaCl2的SMRS培养基复苏培养2 h,涂板筛选得到较高的电转化效率.特别是采用受体菌株修饰的质粒进行电转化,转化效率提高30倍以上,达到6.3×104cfu/μg DNA.本研究结果为进一步构建乳酸菌组成型高效表达系统和食品级基因工程乳酸菌株提供试验依据.     

明串珠菌电转化的优化

为了构建食品级基因工程受体菌,课题对明串珠菌的电转化条件进行了优化.以大肠杆菌-明串珠菌穿梭质粒pCW4为载体,以明串珠菌为受体,文章优化了细胞壁处理方式、电击参数、复苏时间等与电转化相关的因素.结果表明:用氨苄浓度0.7μg/mL的MRS培养基培养明串珠菌至OD600为0.5左右,以PBS作缓冲液,收获制成感受态细胞,与1μg DNA混合,在电场强度12 kV/cm、电阻200 Ω、电容25μF下电击转化,以含80 mmol/L MgCl2的MRS培养基复苏培养3h,得到最高的转化效率为1.75×105 cfu/μg DNA.     

基于原生质体法保加利亚乳杆菌电转化条件的研究

目的:研究不同因素对保加利亚乳杆菌原生质体法电转化效率的影响,通过研究电转化的最适条件,以提高电转化的效率。方法:以保加利亚乳杆菌为受体菌株,大肠杆菌-乳酸菌穿梭型质粒pMG36e为载体,通过原生质体电转化的方法研究溶菌酶浓度、质粒浓度、电转化参数、复苏培养基组成对电转化效率的影响。结果:用SMM在37℃下制备溶菌酶(30 mg/mL)对细胞进行酶解,直至通过显微镜发现约60%的原生质体形成。用1μL质量浓度为1.2μg/μL的质粒pMG36e,在电场强度7.5 kV/cm,电阻200Ω,电容25μF的条件进行电击转化,以含有0.5 mol/L蔗糖和20 mmol/L的MgCl_2、CaCl_2且无吐温80的MRS再生培养基复苏培养2.5 h,并以含红霉素的MRS平板筛选,获得1.42×10~5CFU/μgDNA的电转化效率。结论:本研究实现了保加利亚乳杆菌的高效遗传转化,并为遗传育种提供了技术支持。     

乳杆菌电转化条件的优化

乳杆菌的遗传转化是限制对其遗传操作的关键因素之一.本实验用广宿主质粒pHY300PLK电转化植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B0080,并优化了转化条件.系统地考察了细胞的生长时期、生长培养基组分、质粒浓度、电击时电场强度、复苏培养基组分等因素对转化效率的影响.选择含5.13%甘氨酸和0.54mol/L蔗糖的MRS培养基制备乳杆菌受体细胞,加入500ng质粒DNA,在电场强度7.41kV/cm电击转化,以含有0.3mol/L蔗糖的MRS培养基复苏培养,获得最佳转化率为3.6×104CFU/μg DNA,比使用初始方法得到的转化率提高了40倍.采用优化后条件,同样实现了pHY300PLK、pBBR1MCS-5对L.amylovoru s B0112和L.acidophilus B0068的高效转化,为进一步对这些菌株进行基因工程改造奠定了有利的方法学基础.     

不同感受态细胞制备方法对副干酪乳杆菌转化效率的影响

目的:研究不同感受态细胞制备方法对副干酪乳杆菌转化效率的影响。方法:优化并比较未处理、青霉素处理法、溶菌酶处理法及NaCl处理法制备的感受态细胞的转化效果。结果:优化各处理法获得的条件分别为:未处理法OD600为0.8,甘氨酸质量浓度为3 g/mL,青霉素终质量浓度为12.5μg/mL,溶菌酶质量浓度为10 mg/mL,NaCl浓度为0.7 mol/L。不同处理方法获得的感受态细胞转化效率差异显著(P0.05),转化效率由高到低依次为青霉素处理法【(1.64±0.05)×103cfu/μg质粒】、甘氨酸处理法【(1.51±0.03)×103 cfu/μg质粒】、NaCl处理法【(1.20±0.04)×103cfu/μg质粒】、溶酶菌处理法【(0.56±0.02)×103 cfu/μg质粒】、未处理法【(0.43±0.01)×103 cfu/μg质粒】。结论:青霉素、甘氨酸及NaCl处理法制备的感受态细胞能够有效提高副干酪乳杆菌转化效率,为副干酪乳杆菌遗传转化体系的建立奠定基础。     

乳酸乳球菌高效电转化的方法

以质粒pMG36e和pNZ8148为材料,对乳酸乳球ATCC19435的电转化条件进行了优化研究.实验结果表明,乳酸乳球菌的最佳电转化条件为对数生长中后期的细胞,电场强度12 kV/cm,质粒浓度0.1～1 mg/L,复苏时间2 h,此时质粒pMG36e和pNZ8148时供试菌株的电转化效率分别为1.95x105μg-1和2.18x105μg-1,比优化前电转化效率均提高10倍以上.本研究为外源基因电转化乳酸乳球菌提供了可靠的试验参数依据.     

多黏类芽孢杆菌JSa-9电转化方法的优化

为建立多黏类芽孢杆菌JSa-9菌株的高效电击转化体系,本实验研究菌体培养时间、电场强度、电击缓冲液、质粒用量以及电击后复苏培养时间等因素对JSa-9菌株电转化效率的影响。结果表明：Paenibacillus polymyxaJSa-9培养至OD595 nm为0.3时,电转化效率最高,为0.12×103 CFU/μg DNA;用0.5 mol/L甘露醇、0.5 mol/L山梨醇以及10%甘油的电击缓冲液洗涤细胞,在电场强度17.5 kV/cm、电阻200 Ω,电容25 μF的电击条件下,加入1.0 μg/100 mL质粒DNA,复苏培养时间18 h,电转化效率达到约为0.36×103 CFU/μg DNA;制备P. polymyxa JSa-9原生质体,在电场强度5.0 kV/cm的电击条件下,加入0.8 μg/100 mL质粒DNA,电转化效率较感受态电转提高到约1.0×103 CFU/μg DNA。     

植物乳杆菌G63电转化方法的优化

为获得植物乳杆菌G63高效的电转化方法,本研究从细胞生长状态、细胞弱化剂质量浓度、洗涤液、质粒添加量和电击参数等方面对菌株G63的电转化效率进行优化。结果表明：取菌株G63对数生长中期的细胞制备感受态,以1 g/100 mL甘氨酸作为细胞弱化剂,分别用1 mmol/L MgCl2和30 g/100 mL聚乙二醇1000洗涤细胞,并用30 g/100 mL聚乙二醇1000作为电击液,加入20 μg穿梭质粒,在1.5 kV和400 Ω条件下进行电击,可以获得最高的电转化效率,转化效率达到1.18×103 CFU/μg DNA,满足后续遗传学实验要求。     

干酪乳杆菌LC2W原生质体的制备与再生

以干酪乳杆菌LC2W为出发菌株,对其进行原生质体制备与再生。通过单因素试验研究菌龄、溶菌酶质量浓度、酶解时间及酶解温度对干酪乳杆菌LC2W原生质体制备的影响,并对制备条件进行正交设计优化。结果表明：干酪乳杆菌LC2W原生质体制备的最佳条件为：菌龄8h、酶质量浓度10mg/mL、酶解时间75min、酶解温度42℃,在此条件下制备原生质体并进行再生实验,原生质体形成率达到97.15%,再生率可达到31.25%。研究结果可为L. casei LC2W食品级外源表达系统的构建提供初步的基础。     

利用响应面法优化发酵乳杆菌AR497电转化条件

以1株能有效改善小鼠肠炎的发酵乳杆菌AR497为研究对象,在Plackett-Burman试验的基础上选取甘氨酸质量浓度、OD_(600)、电场强度和山梨醇浓度为自变量,电转化效率为响应值,利用Box-Behnken响应面法优化其电转化条件。最优条件为:电场强度15 kV/cm,山梨醇浓度0.6 mol/L,OD_(600)0.2,甘氨酸质量浓度26 g/L。在此条件下,电转化效率高达2.78×10~5 CFU/μg DNA,比优化前提高了22倍,实现了发酵乳杆菌AR497的高效遗传转化,为后续对其进行遗传改造和解析抗炎机制奠定基础。     

克雷伯氏肺炎杆菌电击转化条件的优化

针对克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)TUAC01的电击转化方法进行了研究。主要考察了培养基EDTA的浓度、细胞的生长状态、感受态细胞的密度、电击电压、质粒浓度等参数对转化效率的影响,建立了一种适合K.pneumoniae TUAC01的电击转化方法。结果:K.pneumoniae TUAC01培养基中添加EDTA至终浓度0.7mmol/L;当细胞生长至OD600为0.7时收集菌体,制作感受态细胞;制作的感受态细胞浓度OD600大于30时,使用2mm的电转杯在2kV的电压下转化,转化效率达到最大值,达到8.58×105cfu/μg DNA。     

响应面法优化干酪乳杆菌LC2W合成胞外多糖的培养条件

采用响应面法(RSM)对影响干酪乳杆菌LC2W合成胞外多糖的培养条件进行了优化。以胞外多糖产量为指标,通过单因素试验初步得到干酪乳杆菌LC2W合成胞外多糖的培养条件,再根据Box—Benhnken中心组合实验设计原理,在单因素试验基础上采用3因素3水平的响应面分析法,建立了胞外多糖产量与各影响因子的回归方程,并得到以胞外多糖产量为响应值的响应面图和等高线图,进而得出干酪乳杆菌LC2W合成胞外多糖的优化培养条件:接种量4%,发酵温度31.5℃,发酵时间32h。验证试验结果表明,在此条件下胞外多糖的产量可达157.46mg/L,比优化前产量提高了30.81%。     

干酪乳杆菌LC2W发酵脱脂乳营养因子优化

通过向还原脱脂乳中添加碳源、氮源及金属离子,对干酪乳杆菌(L.casei)LC2W发酵脱脂乳营养因子进行优化。在单因素试验基础上,以脱脂乳中葡萄糖、大豆多肽和MnSO4添加量为自变量,以发酵乳中L.caseiLC2W菌落总数对数值为响应值,通过三因素三水平的Box-Behnken响应面分析法,分析各自变量及交互作用对L.caseiLC2W菌落总数的影响,并对营养因子进行优化。结果表明:各营养因子对L.casei LC2W菌落总数的影响顺序为:MnSO4添加量>大豆多肽添加量>葡萄糖添加量,且MnSO4添加量与大豆多肽添加量的交互作用影响显著。各营养因子的优化参数为:葡萄糖添加量65.90g/L、大豆多肽添加量7.68g/L、MnSO4添加量13.88mg/L。在此优化条件下发酵24h后,干酪乳杆菌LC2W菌落总数可达2.6×109CFU/mL,比优化前(2.1×108CFU/mL)提高了11.38倍。     

四株乳酸菌的加工性能

选用红霉素(Erythromycin)、氯霉素(Chloramphenicol)、四环素(Tetracycline)等常见的抗生素,用于测定4株乳酸菌在不同抗生素中的最高耐受浓度,并比较4株乳酸菌体外模拟胃肠道环境的耐受性。实验结果表明:4株乳酸菌均有不同程度的抗生素抗性作用。肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides)BD1710在四环素和氯霉素中的最高耐受浓度分别为1、2μg/m L;植物乳杆菌ST-Ⅲ(Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ)在氯霉素中的最高耐受浓度为1μg/m L;干酪乳杆菌BD0054(Lactobacillus casei BD0054)在四环素和氯霉素中的最高耐受浓度都为1μg/m L;干酪乳杆菌LC2W(Lactobacillus casei LC2W)对氯霉素的最高耐受浓度为1μg/m L,4株乳酸菌都不耐红霉素。模拟胃肠道环境实验表明,在胃液环境下,ST-Ⅲ、LC2W的生长不受影响,但BD0054受到影响较大;在肠液环境下,ST-Ⅲ、BD1710生长不受影响,LC2W肠道不耐。高温处理过程,EDTA会加重菌体的损伤程度。冷冻干燥处理,存活率在90%~95%之间。     

甲醇毕赤酵母Pichia methanolica的高效电转化方法

采用电穿孔的方法对甲醇毕赤酵母进行外源DNA的转化。通过调整参数,对影响电转化效率的主要因素进行探索,建立了质粒pMETA-Lip对甲醇毕赤酵母PMAD16的高效电转化方法。结果表明,当采用对数生长中期的菌体制备感受态细胞、质粒DNA浓度为30μg/mL、采用0.2cm电转杯、电压为600 V时,转化率达到最大值,为57个转化子/μg质粒DNA。经抽样鉴定所得到的转化子均为阳性克隆。为外源基因在甲醇毕赤酵母中的表达奠定了基础。     

沙漠小球藻转人乳铁蛋白的电转优化

对沙漠小球藻建立高效的遗传转化方法,对电击转化的条件和相关参数进行优化。作者以人乳铁蛋白基因作为电转条件优化的参考基因,采用单因素实验确定转染效率的电转化条件,然后进行电转化正交实验,得到最优的电转化组合。结果表明:最优的电转化组合是电压1 400 V、培养周期8 d、渗透剂浓度0.2 mol/L、渗透时间为0 h、质粒质量浓度为6 ug/mL、电击缓冲液浓度为0.4 mol/L,其细胞致死率为51.30%、荧光百分率为52.54%、PCR阳性平均百分率为42.30%。