抗HIV-1gp120单链抗体的原核表达与初步纯化

目的 在原核细胞表达抗HIV-1gp120单链抗体基因,纯化后检测其活性。方法 将单链抗体基因插入pET28原核表达载体进行诱导表达,对包涵体进行变性复性处理后,利用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达的蛋白进行初步纯化,纯化后的单链抗体与gp120标准抗原膜条反应。结果 表达产物主要以包涵体形式存在,最高表达量占菌体总蛋白量的51％,金属螯合层析一步纯化后纯度超过85％。纯化后的单链抗体可以特异地识别gp120标准抗原。结论 在原核细胞表达的单链抗体,复性纯化后具有生物学活性。     

抗HIV—lgp120单链抗体的原核表达与初步纯化

目的在原核细胞表达抗HIV－1gp120单链抗体基因，纯化后检测其活性。方法 将单链抗体基因插入pET28原核表达载体进行诱导表达，对包涵体进行变异性复性处理后，利用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达的蛋白进行初步纯化，纯化后的单链抗体与gp120标准抗原膜条反应。结果 表达产物主要以包涵体形式存在，最高表达量占菌体总蛋白量的51％，金属螯合层析一步纯化后纯度超过85％。纯化后的单链抗体可以特异地识别gp120标准抗原。结论 在原核细胞表达的单链抗体，复性纯化后具有生物学活性。     

二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的原核表达及生物学特性鉴定

目的构建二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体原核表达质粒,并进行表达和生物学特性鉴定。方法利用SWISS-PROT软件分析抗TNF-α单链抗体(scFv)的结构,并结合二硫键稳定的单链抗体(ds-scFv)的突变位点设计原则,确定其突变位点,采用PCR定点突变的方法,构建二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的表达质粒pGEX-4T-1-ds-scFv,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosy)l对表达的目的蛋白进行可溶性纯化,并进行抗原结合活性、相对稳定性及细胞毒中和活性检测。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-ds-scFv经菌落PCR及测序鉴定,证明构建正确。抗TNF-α的ds-scFv的表达量占菌体总蛋白的16.6%,主要以包涵体形式表达;纯化的目的蛋白纯度可达94.4%;经ELISA及Western blot验证,ds-scFv与TNF-α抗原的结合活性与scFv相近;相对稳定性优于scFv;在同样的抗体浓度下,scFv和ds-scFv的细胞毒中和活性略低于亲本鼠单抗,ds-scFv略高于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的原核表达质粒,并获得有活性的目的蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

HIV跨膜蛋白gp36和gp41的截短及融合表达

目的将HIV-1的跨膜蛋白gp41和HIV-2跨膜蛋白gp36进行截短,并在大肠杆菌中进行融合表达。方法用PCR将gp41和gp36的编码基因进行截短,回收的PCR产物纯化后克隆到连接载体pGEM-T上,然后用BamHⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ切下目的基因,并构建到表达载体pGEX-4T-3,导入宿主细胞BL21,用IPTG诱导表达。结果酶切鉴定显示,截短的HIV-1gp41和HIV-2gp36跨膜蛋白基因大小与预期的一致,表达产物经SDS-PAGE分析显示在相对分子质量66000处出现融合表达条带,Westernblot分析显示,与相应抗体出现特异性反应。结论已成功对gp41和gp36跨膜蛋白进行截短,并构建表达载体进行表达,为跨膜蛋白的进一步应用研究奠定基础。     

表达HIV-1 gp160膜蛋白靶细胞的制备及鉴定

目的获得表达INV-1 gp160膜蛋白的靶细胞,用于HIV-1特异性细胞毒性淋巴细胞(CTL)和抗HIV-1重组毒素细胞杀伤活性检测。方法采用PCR方法,从质粒pJen 10中扩增HIV-1 gp160基因,插入pGEM-T载体,测序后克隆入pIRESl neo载体中构建成重组质粒pIRE160,酶切鉴定正确后,转染人肝癌细胞(SMMG-7721),CA18加压筛选至细胞不再死亡为止,并采用Western blot和间接免疫荧光法对制备的靶细胞进行检测。结果HIV-1 gp160在SMMC7721表面表达,并裂解为gp120和gp41蛋白。结论已成功得到稳定表达HIV-1 gp160的靶细胞,且表达的蛋白具有良好的特异性。     

P53蛋白的原核表达及纯化

目的构建P53基因重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化。方法以pBabe-P53R质粒为模板,PCR扩增P53基因全序列,克隆至pGEX-4T-1载体中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-P53,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经不同配比的去垢剂复性后,用GlutathioneSepharose4Bgel亲和层析纯化。结果重组原核表达质粒pGEX-4T-1-P53经双酶切鉴定,表明构建正确。表达的GST-P53融合蛋白相对分子质量约80000,IPTG诱导时间以1h为宜。1%TritonX-100和1mmol/LEDTA为蛋白复性的最佳去垢剂。纯化的GST-P53融合蛋白可与羊抗人GST抗体和鼠抗人P53抗体发生特异性反应。500ml菌液可获得1mg纯化蛋白。结论已成功构建了P53基因重组原核表达质粒,表达并纯化了GST-P53融合蛋白,为研究NIRF与P53基因之间的相互关系奠定了基础。     

重组HIV-1 CN54 Nef抗原的制备及鉴定

目的原核表达HIV-1CN54调控蛋白Nef,并进行纯化、复性及鉴定。方法将CN54 Nef基因克隆至pThio-HisA载体,构建非融合表达载体,转化大肠杆菌BL21 Codonplus-RIL,IPTG诱导表达,通过尿素梯度洗涤包涵体纯化Nef蛋白,透析复性。Western blot检测目的蛋白的特异性。结果Nef蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的40%以上。用尿素洗涤法可直接纯化Nef,纯度达到90%以上。Nef蛋白透析后溶解于PBS缓冲液中。Western blot检测显示了良好的特异性。结论HIV-1 CN54 Nef抗原蛋白可在大肠杆菌中高效表达,采用的纯化和复性Nef蛋白的工艺简便、快捷,为开发针对Nef基因的HIV-1疫苗奠定了基础。     

HIV-1 Vpu蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化

目的在毕赤酵母中表达并纯化人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)辅助调节蛋白Vpu。方法从质粒p CDNA3.1-vphu中PCR扩增vphu基因,插入毕赤酵母表达载体p PICZαA,构建重组表达质粒p PICZαA-vphu,转化巴斯德毕赤酵母野生型X33菌株,经甲醇诱导表达带有6×His标签的重组Vpu蛋白。表达产物经Ni-Agarose 6×His标签纯化柱纯化。表达和纯化产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒p PICZαA-vphu经双酶切和测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约16 000,主要存在于细胞内;纯化后杂蛋白减少,与抗VPU抗体和抗His标签抗体均可结合,浓度为224μg/ml。结论利用毕赤酵母表达系统成功表达并纯化了HIV-1 Vpu蛋白,纯化的蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究其结构和功能以及靶点药物筛选模型的建立奠定了基础。     

与A549细胞相关的旋毛虫抗原蛋白7TR单链抗体的筛选

目的筛选可与A549细胞相互作用的抗旋毛虫7TR单链抗体。方法 PCR法克隆旋毛虫7TR基因,连接至表达载体p ET-32a,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导后,将表达的7TR蛋白进行复性及亲合层析纯化;以纯化后的旋毛虫7TR蛋白为抗原,筛选Tomlinson(I+J)人源噬菌体单链抗体库,筛选并纯化阳性抗体,免疫荧光试验检测抗体与A549细胞的结合活性。结果重组表达质粒p ET-32a-7TR经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的旋毛虫7TR蛋白相对分子质量约50 000。共获得2株稳定分泌抗旋毛虫7TR蛋白单链抗体的E.coli HB2151菌株,命名为4C7和8G5;8G5可与重组7TR蛋白发生特异性结合,具有良好的反应原性,也可与A549细胞发生特异性结合。结论筛选出了与A549细胞具有结合活性的抗7TR单链抗体,为后续的临床应用奠定了基础。     

不同HIV抗体检测试剂检测抗HIV-1膜蛋白抗体的敏感性

目的分析不同HIV抗体检测试剂检测HIV-1B’和BC重组型膜蛋白抗体的敏感性。方法选择HIV-1B’和BC重组型感染者血浆,用gp41抗原和gp160抗原分别进行亲和层析纯化。将各纯化产物进行系列稀释,用15种HIV抗体ELISA检测试剂以及3种HIV抗原/抗体联合检测试剂进行检测。结果用gp41抗原纯化后的样品只含有抗gp160和gp41的抗体带型,而用gp160抗原纯化后的样品含有抗gp160、gp120和gp41的抗体带型。进口试剂检测不同基因型样品的敏感性低于大部分国产试剂,国产试剂检测不同基因型的样品的敏感性无明显差异,而进口试剂检测B’亚型抗体的能力低于检测BC重组型抗体的能力。结论不同基因型的抗体对HIV抗体检测试剂的敏感性可能有一定的影响。     

人HSP70与MAGE-4表位基因原核表达载体的构建及表达

目的构建热休克蛋白70(HSP70)与黑色素瘤抗原-4(MAGE-4)抗原表位基因的原核表达载体,并对表达产物进行鉴定。方法在热应激条件下,用PCR法从结肠腺癌细胞获取HSP70基因。在线用蛋白质二级结构预测软件分析MAGE-4抗原表位,PCR获取MAGE-4抗原特征表位基因。将二者分别克隆入pGEM-Teasy载体,酶切鉴定后,将HSP70基因亚克隆入pET28a原核表达载体,再将MAGE-4基因克隆入HSP70基因的下游,构建重组质粒pET28a-HSP70-MAGE-4。转化大肠杆菌,IPTG诱导表达并鉴定。结果所构建的HSP70与MAGE-4抗原表位基因表达载体pET28a-HSP70-MAGE-4,经PCR及DNA测序结果表明构建正确。SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带。结论已成功构建了人HSP70与MAGE-4抗原表位基因的原核表达载体,为疫苗研究提供了依据。     

人乳头瘤病毒16型L1 N-端主要抗原基因的原核表达

目的　获得序列正确的人乳头瘤病毒 (HPV) 16型L1N -端主要抗原基因 ,构建其原核表达载体 ,并进行诱导表达。方法　采用PCR法从宫颈癌组织中获得HPV16型L1N 端主要基因重组表达质粒 ,转化E .coliDH5α ,4 2℃诱导表达 ,Westernblot分析表达产物。结果　获得了序列正确的人乳头瘤病毒HPV16型L1N -端主要基因 ,相对分子质量约为 5 10 0 0。表达蛋白能与乳头瘤病毒抗体及乳头瘤病毒感染患者的血清发生抗原抗体反应。结论　已成功构建HPV16型L1N -端主要基因表达载体 ,并获得有效表达。     

结核分枝杆菌PPE68蛋白的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌PPE68基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增PPE68基因,将其克隆至pET-32a(+)载体中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果重组表达质粒pET-32a(+)-PPE68经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE68基因序列一致。表达的Trx-PPE68融合蛋白相对分子质量约为57000,表达量约占菌体总蛋白的41%,可与结核分枝杆菌免疫小鼠血清发生特异性反应。纯化的重组蛋白纯度约为93%。结论已成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,原核表达并纯化了重组蛋白,为PPE68作为结核病特异性诊断抗原的开发及重组BCG疫苗的研制奠定了基础。     

A群链球菌四价重组蛋白的表达、纯化及其免疫原性

目的原核表达并纯化A群链球菌M1、3、6、18型四价重组蛋白,并检测其免疫原性。方法以克隆质粒pUC18-Strep4为模板,PCR法扩增四价重组蛋白基因,克隆至表达载体pQE30中,构建重组表达质粒,转化E.coilM15,筛选阳性克隆,IPTG诱导表达。采用Ni2+-NTA凝胶亲和层析纯化重组蛋白。以该蛋白免疫家兔,ELISA法检测血清抗体滴度;间接免疫荧光法(IFA)检测A群链球菌型特异性抗体;体外杀菌试验检测杀菌抗体活性。结果四价重组蛋白表达质粒pQE30-Strep4经双酶切和测序,证明构建正确。重组蛋白相对分子质量与预期相符,表达量约占菌体总蛋白的30%,为可溶性表达。纯化后蛋白纯度可达90%以上,并可诱导家兔产生高滴度的M1、3、6型特异性杀菌抗体。结论已成功表达了A群链球菌四价重组蛋白,纯化后的蛋白可诱导家兔产生针对A群链球菌M1、3、6三个血清型菌株的特异性杀菌抗体。     

胰岛素样生长因子-1基因原核表达载体的构建及表达蛋白的生物学活性

目的构建人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)基因原核表达载体,并检测表达的重组人IGF-1(rhIGF-1)蛋白的生物学活性。方法以pUC57-hIGF-1质粒为模板,PCR扩增hIGF-1基因,克隆入pTEtrans载体,进行DNA序列分析后,亚克隆入表达载体pTE,转化大肠杆菌W3110,进行诱导表达,表达产物经阳离子交换层析和凝胶过滤层析纯化,并进行Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析。MTT法检测rhIGF-1促MCF-7细胞的增殖作用。结果转化质粒pTE-hIGF-1的大肠杆菌经诱导后,以可溶性形式表达相对分子质量约为7700的目的蛋白,表达量约占菌体总蛋白的8%。Western blot证实该蛋白具有良好的反应原性,Tricine-SDS-PAGE证实纯度达98%以上,MTT证实具有良好的促MCF-7细胞增殖的作用。结论已成功构建了含hIGF-1基因的原核表达载体,并获得具有生物学活性的高纯度rhIGF-1。     

人T淋巴细胞CD3ε链的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化人T淋巴细胞CD3ε(hCD3ε)链。方法以健康成人外周血单个核细胞总RNA为模板,采用RT-PCR法扩增人CD3ε链基因,并克隆入pCR-II载体,酶切鉴定及测序分析后,再定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达质粒pGEX-4T-3-hCD3ε,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果酶切分析及DNA测序证实,hCD3ε链基因被正确克隆入pGEX-4T-3载体,并能在原核系统中稳定表达。表达产物的相对分子质量为49 500,0.2 mmol/L IPTG 25℃诱导表达4.5 h,目的蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的29.3%,其中可溶性表达占12.8%。纯化的融合蛋白纯度可达86.1%,可分别被兔抗人CD3ε多抗和羊抗GST多抗识别。结论已成功地原核表达并纯化了GST-hCD3ε融合蛋白。     

HIV-1 HXB2株Tat核心碱性区多肽Tat_(38-61)的原核表达及其免疫反应性

目的 构建HIV-1 Tat核心碱性区多肽Tat38-61重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化及免疫反应性检测。方法采用PCR法从HIV-1 HXB2株Tat1-101基因中扩增编码Tat38-61的基因序列,克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET32a(+)-Tat38-61。转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA柱亲和层析法纯化后,ELISA法鉴定其免疫反应性。结果重组原核表达质粒pET32a(+)-Tat38-61经双酶切及测序表明构建正确;SDS-PAGE分析显示,在相对分子质量约21 300处可见目的 蛋白条带,表达量占菌体总蛋白的67.4%,主要以可溶形式表达;纯化后融合蛋白的纯度可达97%以上;ELISA结果显示,该融合蛋白与兔抗PEPTIDE-Tat1-101血清及HIV阳性血清均呈特异性反应。结论已成功构建了HIV-1 Tat核心碱性区多肽Tat38-61的重组原核表达质粒,表达并纯化了PET32a(+)-Tat38-61融合蛋白,该融合蛋白碱性区表位得到较好的保留,为Tat38-61噬菌体突变文库的构建及亲和筛选奠定了基础。     

艰难梭状芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶的原核表达、纯化及其酶活性

目的原核表达艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile,CD)谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,GDH),纯化重组蛋白,并检测其酶活性。方法采用PCR法从标准株ATCC BAA-1805中扩增GDH基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28-GDH,转化感受态大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析,并通过Ni-NAT层析柱分离纯化后,根据脱氢酶酶活测定方法,测定纯化蛋白的酶活性。结果重组表达质粒pET-28-GDH经双酶切及测序,证实构建正确,重组蛋白的相对分子质量约46 000,可与抗His单抗特异性结合,主要以可溶性形式表达。纯化的目的蛋白纯度可达90%,浓度为1.7 mg/ml。纯化蛋白GDH以NADPH和NADP为辅酶,酶活性分别为42.6和63.3 U/L。结论已成功在大肠杆菌中表达了重组CD GDH,纯化的目的蛋白纯度高,具有GDH酶活性,为制备GDH单克隆抗体奠定了基础。