枯草芽孢杆菌糖化型α-淀粉酶的研究(Ⅲ)——酶的催化作用

糖化型α-淀粉酶(BSA)作用于淀粉时与液化型α-淀粉酶(BLA)具有相同的基本特性——随机切割α-1.4葡萄糖苷键,产生小分子糊精、低聚糖。BSA能水解低聚糖(G7-G4),且对G3有一定的分解力,主要产物为G2和G。其水解淀粉程度比BLA彻底,同一蓝值时产生的还原端比BLA多。BSA不能切割1.6-葡萄糖苷键,作用于支链淀粉时残留异麦芽糖苷麦芽糖BSA还有一定的分子间糖基转移催化活性。     

枯草芽孢杆菌糖化型α-淀粉酶的研究(Ⅰ)——糖化型淀粉酶的发酵生产条件及纯化

枯草芽孢杆菌KO_2在合适的碳源,如糊精、可溶性淀粉及氮源,如豆饼浸出液的培养液中三天能达产糖化型α-淀粉酶高峰。使用硫酸铵分级盐析,离交色谱,凝胶过滤可获得纯净的酶。对此纯化的酶的研究表明:该酶的等电点为pH5.16,pH稳定范围5.0～8.5,温度稳定范围40～50℃以下,最适作用pH为5.5,最适作用温度66℃,分子量经凝胶过滤、高压液相色谱、SDS电泳及超速离心分析测得为42,000～45,000,由396氨基酸残基构成并确定了各种氨基酸的百分比及数量,对于可溶性淀粉的米氏常数为0.057,最大速度V_(max)=1.3微克分子/分钟·亳升·单位酶活。比较此酶与液化型α-淀粉酶、糖化酶对基质的作用表明,此酶具有独特的作用机理。     

枯草芽孢杆菌变异菌株的α-淀粉酶分离纯化及酶学性质的研究

从枯草芽胞杆菌变异菌株培养得到的α—淀粉酶,通过硫酸铵沉淀,DEAE-葡聚糖凝胶A-50,葡聚糖凝胶G-100以及超滤浓缩等操作,获得该酶的纯样品,该酶的分子量、等电点分别为52.5KD、pI 4.6。该酶的最适pH和温度分别为pH6.0及65℃,稳定pH范围为pH4.5～7.5,而且在50℃时该酶活力较稳定。Ca~(2 )、Mg~(2 )、Li~ 对酶活有激活作用,而Ag 、Al~(3 )、Cu~(2 )、Fe~(2 )、Zn~(2 )、Mn~(2 )、Ni~(2 )和CO~ 对酶活有抑制作用。另外,该酶对可溶性淀粉的分解限度为42.8％,由此可估计该酶属于糖化型α—淀粉酶。     

枯草芽孢杆菌HD132产生的α-淀粉酶性质的初步研究

文章对枯草芽孢杆菌B.subtilis Ki-2-132的UV诱变菌株HD132发酵产生的a-淀粉酶进行了初步研究,结果表明:在实验条件下,枯草芽孢杆菌HD132比BF7658产生的a-淀粉酶活力高,a-淀粉酶的最适温度为60℃、最适pH值为6.0,Ca2 对酶有一定的激活作用,而Cu2 、Fe2 和Fe3 强烈抑制a-淀粉酶的活性.     

碳源对枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶的影响

研究可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖3种主要碳源对枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶活力、细菌浊度及其发酵培养过程中培养基pH值变化的影响.结果表明,枯草芽孢杆菌在摇床发酵试验中,当发酵时间超过54 h酶活力基本达到最高且保持不变.以可溶性淀粉为碳源时最佳,枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶酶活力最高为(114.5±2.3) U/mL,细胞浊度为2.342±0.023;其次是葡萄糖和蔗糖,最高酶活分别为(75.6±2.1),(72.2±1.2) U/mL,细胞浊度分别为2.515±0.031,2.421±0.044.可见枯草芽孢杆菌产生α-淀粉酶受淀粉的诱导,受蔗糖及葡萄糖的阻扼作用.     

细菌α-淀粉酶发酵技术研究(Ⅱ)——淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶的发酵条件的研究

将在日本收集的α-淀粉酶有关菌种,作了菌种酶活性的比较,发现淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens KA 63培养在10%可溶性淀粉,2%蛋白胨,1%牛肉膏,0.5%酵母粉,0.5%NaCl,0.5%K_2HPO_4中可获较高的α-淀粉酶酶活,2升发酵罐培养28-30小时,α-淀粉酶酶活可达400单位/亳升,该菌种具有一定的生产价值,将为我国增添一个液化型α-淀粉酶的新品种。     

枯草芽孢杆菌工程菌产中温α-淀粉酶发酵条件优化

利用基因工程的手段获得高产中温α-淀粉酶基因工程菌株pWB—amy／WB600,对其在7L发酵罐中的发酵条件进行了研究和优化。结果表明,发酵过程中通过调节通气量和搅拌转速来控制发酵液中的溶氧含量,使溶氧浓度控制为15％-25％;采用流加氨水的方式控制发酵液的pH值为6．0～7．5;并且利用间歇补料的方式,有利于酶量的积累,优化过后的发酵液酶活比未优化时提高了41％。     

麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。     

重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌构建与表达

根据GenBank枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因序列设计引物,以枯草芽孢杆菌基因组为模板,PCR克隆α-淀粉酶基因(amy),将α-淀粉酶基因插入穿梭表达载体pP43C,构建重组质粒pP43Camy。随后将重组质粒转化八种蛋白酶缺陷的宿主枯草芽孢杆菌WB800,经筛选获得重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌WB800/pP43Camy1026,工程菌摇瓶发酵酶活力达960U。性质研究表明,重组α-淀粉酶的最适作用温度为70℃,最适反应pH为6.0,具有良好的应用潜力。     

酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

酸性α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现酸性α-淀粉酶基因的高效表达,将本实验室已经克隆得到的去信号肽的酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌WB600宿主中进行表达,成功的构建了表达菌株pHT43-amy/WB600。在初始菌浓度OD600为0.8时加入终浓度为0.9 mmol/L的IPTG,诱导6 h的条件下测得酶活力为1 230 U/mL,又由于宿主菌WB600外分泌蛋白较少,因此具有明显的生产优势。     

Plackett-Burnan优化蜡样芽孢杆菌α-淀粉酶产酶条件

对蜡样芽孢杆菌发酵生产α-淀粉酶的产酶条件进行了优化研究,考查了11种因素对其产酶的影响.先利用单因素试验对培养基及培养条件进行优化,在此基础上利用Plaekett-Burnan (PB)试验设计法对影响α-淀粉酶产量的重要因素进行筛选.结果表明,以麸皮为碳源,黄豆粉为氮源,碳氮比为1/0.75,初始pH值为7.0,37℃培养时,产酶量最高.通过PB试验进一步筛选表明,装液量、培养时间和麸皮含量3个因素对产酶影响显著.试验初步优化了蜡样芽孢杆菌产α-淀粉酶条件,为日后进一步优化和生产奠定了基础.     

枯草芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶的纯化及性质

对枯草芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶采用硫酸铵分级沉淀、热处理、DEAE-SepharoseFastFlow离子交换层析进行纯化,经SDS-PAGE鉴定为单蛋白带,酶蛋白比活提高了15.5,回收率为20.3%。对酶学性质分析表明,分子量约为32kDa的单亚基酶;对热(40℃)敏感;最适pH值和稳定pH值均为7;以α-乙酰乳酸为底物时,α-乙酰乳酸脱羧酶的动力参数Km为232.6mmol/L和Vmax为7.1μmol/(μg·min);Mg2+,Mn2+,Zn2+,Fe2+,Cu2+等二价金属离子能激活酶的活性;加入EDTA后,酶活降低,用原子吸收分光光度计检测,发现只含有Zn2+(含量97.6nmol/mg蛋白)。     

α-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

α-淀粉酶基因经改造后,克隆到穿梭质粒pBE2中。在α-淀粉酶基因的上游连接枯草芽孢杆菌sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR),构建了含突变α-淀粉酶基因的分泌型诱导表达载体pBSAT,转化蛋白酶三缺陷枯草芽孢杆菌菌株DB403。含有pBSAT的菌株可将突变α-淀粉酶分泌到胞外,表明sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR)能很好的将枯草芽孢杆菌中的重组α-淀粉酶引导到胞外,完成分泌表达。分泌的α-淀粉酶具有较高的耐酸性及生物学活性。     

枯草芽孢杆菌纤溶酶的纯化及性质研究

以从牛肉酱中筛选的1株高产纤溶酶的枯草芽孢杆菌为材料,进行发酵产酶。其发酵液经过硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶过滤、C M SepharoseCL-6B离子交换层析和电泳制备,得到电泳纯的枯草芽孢杆菌纤溶酶;其分子质量为32.5ku;pI10.9～11.8;具有直接溶解纤维蛋白和激活纤溶酶原的双重作用;胰蛋白酶对此酶无降解作用,对其纤溶活性无影响;该酶在pH4.0～13.0稳定,对温度的适应范围较广。     

真菌α-淀粉酶酶学性质研究

真菌α-淀粉酶是淀粉生产麦芽了对比研究.结果表明:两种酶最佳试验稀释倍数为1000;最适pH值均为5.5;在50℃以下时热稳定性较好,高于60℃时酶活损失较多;Ca2 浓度在7mmol/L时对两种酶都有激活作用.     

枯草芽孢杆菌B.SUBT12酶学性质研究

考察分离得到的一株产中性蛋白酶枯草芽孢杆菌B.SUBT12最适作用温度、pH值以及温度、pH值、金属离子和表面活性剂对酶稳定性的影响。试验研究表明:该酶最适作用温度为55℃,最适作用pH为7.5,酶在55℃反应45min仍有50%的酶活力,热稳定性较好。金属Ca2+和表面活性剂Tween-80对酶有一定的激活作用,但激活作用不显著。     

枯草芽孢杆菌产淀粉酶培养条件的优化研究

通过单因素试验,评价了不同温度、pH、时间、碳源浓度、氮源浓度和摇床转速等6个因素对菌株产淀粉酶含量的影响。结果表明蛋白胨浓度、玉米粉浓度、pH和温度等因素对菌株产酶影响较大,其最佳组合为pH6.5、玉米粉浓度0.5%、蛋白胨浓度为0.5%、培养温度为37℃、培养时间为30h,在此条件下菌株产酶浓度为3.36U/ml,产淀粉酶菌株的培养条件得到了优化。     

耐高温α-淀粉酶的酶学性质研究

耐高温α-淀粉酶是淀粉生产麦芽糖的关键酶。本文对两种耐高温α-淀粉酶的酶学性质进行了对比研究。结果表明：两种酶的耐高温能力差别较大，酶活差别明显；最适pH值均为7．0，耐酸性较差：当Ca^2＋浓度在7～9mmol／L时，酶活提高明显。     

枯草芽孢杆菌淀粉酶高产菌株的复合诱变研究

该研究以实验室保存的枯草芽孢杆菌为出发菌株,利用紫外和硫酸二乙酯（DES）复合诱变的方法,从大量突变菌株中获取可高效发酵生产淀粉酶的菌株。又通过连续传代实验,确定了该突变菌株突变性状能稳定遗传。结果表明,菌株D-2具有较高的的淀粉酶活力,其淀粉酶活力可达N6．599U／mL,较出发菌株提高到4倍。并在连续培养5代后,仍具有较好的遗传稳定性。该文探讨了一种高效的发酵生产淀粉酶菌株的选育方法,为下一步菌种生长条件优化打下了基础。     

大麦β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中异源表达

该研究拟采用枯草芽孢杆菌异源表达大麦来源β-淀粉酶。选择枯草芽孢杆菌WB800作为宿主,采用同源重组的方法构建表达载体p P4 3NMK-amy B,获得重组枯草芽孢杆菌WB-amy B。重组枯草芽孢杆菌在摇瓶发酵条件下酶活最高可达386 U/m L,纯化后测得其比酶活为613 U/mg。重组酶的最适温度为55℃,最适p H值为5. 0。重组β-淀粉酶水解产麦芽糖能力与大麦β-淀粉酶相当,与普鲁兰酶联用时麦芽糖最大转化率可达81. 8%。重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵水平产酶量高于类似文献报道,重组β-淀粉酶的酶学性质与大麦β-淀粉酶相比几乎相同,完全可以替代大麦β-淀粉酶在工业上的应用。