苏云金芽孢杆菌cry3Aa启动子的克隆和营养期表达载体的构建

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt)的绝大多数杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins,ICPs)基因是在芽孢形成期（sporulation phase)表达的,而只有少数基因如cry3Aa是在营养期表达的。在本研究中,根据已知的cry3Aa基因启动子序列设计了一对引物（Ep-5s和Ep-3n),利用这对引物从拟步虫甲亚种（Bt subsp.tenebrions)中扩增出一个与预期大小（1．1kb)一致的DNA片段。序列测定及分析结果表明,这个DNA片段含cry3Aa启动子全序列,包括上游AT富含区、两个启动子区、两个SD序列及两组反向重复序列。经过一系列的克隆之后将这个片段克隆到穿梭载体pHT3101上,最后构建成一个Bt的营养期表达载体pHPT。     

苏云金芽孢杆菌cry1Aa核心毒素基因转化烟草及其杀虫活性

将苏云金芽孢杆菌cry1Aa的C端编码区截短,获得编码N端609个氨基酸约1.8kb的核心毒素基因,将其构建到植物表达载体转化烟草,研究直接表达的活性ICP核心毒素被昆虫取食后的杀虫效果.T1代种子发芽的抗生素抗性分离和PCR检测证实cry1Aa核心毒素基因整合到了烟草基因组,Western 杂交检测表明转化烟草能够正常表达大小为75.6kD的核心毒素蛋白.生物测定结果表明,转化烟草对初孵棉铃虫平均有高于60%的致死率,对初孵甜菜夜蛾平均达到70%的致死率,最高致死率均可达到90%以上,并对昆虫的生长发育有明显的抑制作用.     

苏云金芽孢杆菌cry1Aα核心毒素基因转化烟草及其杀虫活性

将苏云金芽孢杆菌cry1Aα的C端编码区截短，获得编码N端609个氨基酸约1.8kb的核心毒素基因，将其构建到植物表达载体转化烟草，研究直接表达的活性ICP核心毒素被昆虫取食后的杀虫效果。T1代种子发芽的抗生素抗性分离和PCR检测证实cry1Aα核心毒素基因整合到了烟草基因组，Western杂交检测表明转化烟草能够正常表达大小为75．6kD的核心毒素蛋白。生物测定结果表明，转化烟草对初孵棉铃虫平均有高于60％的致死率，对初孵甜菜夜蛾平均达到70％的致死率，最高致死率均可达到90％以上，并对昆虫的生长发育有明显的抑制作用。     

嗜热芽孢杆菌产耐热蛋白酶稳定性的研究

实验室成功地分离保存了一株产蛋白酶的耐热芽孢杆菌.该菌所产的蛋白酶最适pH 7.5,在pH4.0~9.0时较稳定.最适温度为70℃,80℃以下时热稳定性较好,在稳定的pH或温度下能保持1 h以上活性不变.通过添加Ca2+,Li+,Co2+,Mg2+等12种金属离子证实该酶为金属激活蛋白酶,其中Li+提高该酶活性最显著.氧化剂过氧化氢可以提高该酶的活力,表面活性剂如Tween 80和Triton X-100对酶活力影响不大.该蛋白酶对各种常用的商品洗涤剂耐受能力较强,在洗涤工业中具有较好的应用前景.     

枯草芽孢杆菌植酸酶基因在大肠杆菌中的表达及其对酶热稳定性的影响

采用PCR法,获得不含有信号肽序列的来源于枯草芽孢杆菌的植酸酶phyC基因的非融合和融合表达片段,分别构建带有T7lac启动子的大肠杆菌的植酸酶pET30NFphyC和pET30FphyC表达载体,并转入大肠杆菌BL21(DE3)。大肠杆菌分别在30℃和25℃经IPTG诱导后实现了植酸酶的表达,非融合和融合植酸酶的表达量分别约占菌体总蛋白的13％和15％,分子量分别为40．13kDa和43．27kDa。表达产物具有植酸酶的生物学活性,非融合植酸酶和融合植酸酶的最适反应温度分别为50℃和75℃,经90℃处理10min,残留酶活性分别为37℃时的31．9％和75．7％。分析表明,含13个氨基酸残基的融合片段有助于植酸酶的表达和酶热稳定性的提高。     

海洋芽孢杆菌碱性酯酶BSE-1的纯化与性质研究

海洋芽孢杆菌酯酶发酵液通过低温高速离心(10000r/min,30min,4℃)、乙醇-硫酸铵双水相沉淀和Q-Sepharose HR 阴离子交换层析等技术进行了纯化,最终得到电泳纯的酯酶BSE-1.SDS-PAGE电泳结果表明,该酶表观分子量为30kDa.以对硝基苯磷酸酯(PNPP)为底物对BSE-1进行了理化性质研究,结果表明,BSE-1的最适反应温度为60℃,最适pH值为10.0,为嗜热碱性酯酶;该酶在60℃以下、pH 7～11范围内具有良好的热稳定性;与常见酸根离子、有机溶剂的配伍性较好,但金属离子对酶活影响较大,Li~+、Mg~(2+)、Ca~(2+)对BSE-1有激活作用,1mmol/L的Ca~(2+)使酶活提高2倍以上;Ba~(2+)、Fe~(3+)、Ag~+、Sr~(2+)对BSE-1有抑制作用,1mmol/L Ba~(2+)存在下酶活仅能保持10%左右.     

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)脱毛蛋白酶基因的克隆与序列分析

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)UN-31-C-42菌株是从成都市生活垃圾中分离,并经多次诱变后得到的菌株。其发酵液具有很好的脱毛效果,且对皮革胶原没有损伤。通过对该菌株发酵液中的碱性蛋白酶DHAP的纯化与N′-末端氨基酸序列测定,以及对该序列的同源性分析后,设计出相应引物,用PCR方法扩增了该菌株的碱性蛋白酶基因AP。测序结果表明,该克隆基因全长1588bp,有一个全长1149bp的编码区序列,推测蛋白质序列长383个氨基酸残基,成熟肽分子量为27．8kD。推测的成熟蛋白酶N′-末端具有与DHAPN′-末端完全匹配的序列,说明克隆到的基因为脱毛蛋白酶基因。同源性分析表明,该基因序列与已报道的其他碱性蛋白酶基因有较高的同源性。     

利用血红蛋白基因提高短小芽孢杆菌在低氧条件下的碱性蛋白酶产量

将透明颤菌血红蛋白基因vgb成熟肽编码区序列分别与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P43双启动子和短小芽孢杆菌(B. pumilus)碱性蛋白酶基因启动子wBp连接,利用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4分别构建组成型表达质粒pSUP43Vgb和pSUwBpVgb,将其分别转化短小芽孢杆菌UN-31-C-11.SDS-PAGE和CO差异光谱检测表明,融合基因在UN-31-C-11中均得到了表达,并且表达质粒使重组菌株在低氧条件下的生长量在对数生长后期超过对照菌株20%以上,同时促进了短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的表达,其产量高于对照30%以上.     

两段杨树叶绿体DNA片段的克隆及叶绿体定点转化载体的构建

利用PCR方法,从毛白杨（Populus tomentosa C.）叶绿体基因组中克隆了1．7kb和1．6kb的相邻DNA片段,对其进行序列分析表明,扩增片段分别具有1766个和1601个核苷酸,前者包括3′rps12,rps7基因的编码区及其边界序列,后者包含ndhB基因的第一外显子和内含子。本文还构建了杨树这两个片段的限制酶切图谱,并以这两个相邻片段为同源重组片段,分别将绿色荧光蛋白（GFP）基因和苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白（Bt）基因,及其原核表达框插入其间,构建了杨树叶绿体定点转化载体pPZG和pPZB。这两个特异性载体将定位整合到杨树叶绿体基因组中反向重复区的rps7和ndhB基因的间隔区,并高效表达GFP和Bt基因。迄今为止,本文所报道的内容在国内、外尚属首次。     

自然发酵酱油酱醅中产香芽孢杆菌的筛选及其产酶性能研究

运用培养法及16S rDNA序列分析鉴定从传统技艺酿制的高盐固态发酵型酱油——先市酱油酱醅中分离到9株细菌,均为芽孢杆菌属.牛津杯水解圈法分析此9株芽孢杆菌在高盐环境中产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶能力,以及罗丹明B平板法分析其产脂肪酶能力显示,所分离菌株均能分泌蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶,其中6株能够分泌脂肪酶.HS-SP...     

枯草杆菌Ki－2－132高表达遗传工程系统的研究

利用芽孢杆菌多效调控基因ｈｐｒ、ｄｅｑＱａ、ｄｅｇＲ、ｄｅｇＵ／５３２（Ｈｙ）等和枯草杆菌Ｋｉ－２－１３２自身的积生孢、感受态相关基因的协调作用，构建了系列的高表达遗传工程宿主。这些宿主对于ＡＰｒＥ都实现了较高水平的表达。其中，由ｈｐｒ和ｃｏｍ、ｓｐｏ等配合的宿主表达ＡｐｒＥ的能力比野生型宿主提高了１００—２００倍。     

The determination of post yield stresses from strains measured on strain hardening materials

The paper examines the computational techniques of Mendelson¹ and that proposed by Moreton-Moffat² to derive post yield stresses from strain gauge readings and compares them with the fundamental Prandtl-Reuss approach. Although the approach by Mendelson is extensively used in one form or another in elasto-plastic analysis its application in the experimental stress analysis field is less common. Moreton-Moffat highlighted this application and modified Mendelson's method claiming that it was unnecessary to use the post yield constitutive law. In this latter respect their approach is shown in general to be inadequate. The technique based on the Mendelson approach¹ is found to be an accurate and useful solution especially when modified to incorporate the slope of the constitutive law at the mean stress of any particular finite step. Although the method is an approximate strain analogue of the Prandtl-Reuss equations the approximation is excellent for practical step sizes.     

两面可构视图的空间构形方法研究

重点研究了两面单框可构视图及两面多框可构视图的空间构形设计方法。对于两面单框可构视图的空间构形应在最大公共点群域内来构造形体,且构造的形体应随同面点集形状的变化而变化;对于两面多框可构视图的空间构形,应在各封闭图框的最大公共点群域内来构造形体,构造的形体也应随各同面点集形状的变化而变化。     

基于神经网络集成的第三方物流客户满意度测评

针对第三方物流企业客户满意度评价中的动态、多输入、非线性等问题,从第三方物流服务的视角出发,在分析客户满意度各影响因素的基础上,采用神经网络集成的方法,构建第三方物流客户满意度神经网络集成模型;运用华润物流公司的客户满意度评价数据对模型进行训练和测试,并将训练好的模型应用到公司制定改进客户满意度方案中.实例研究结果表明:该模型对于第三方物流客户满意度测评的精度较高,且具有较好的泛化能力,能够应用到研究影响企业客户满意度的主要因素中,为公司制定改进客户满意度保障方案提供依据,具有较高的实践应用价值.     

荆楚文化视域下的湖北水彩画群体研究

水彩画源于西方,发展之初受西方国家的影响,创作的作品带有明显的西方色彩。近年来,我国当代艺术发展趋于成熟,艺术家渐渐意识到中国传统文化在艺术创作中的重要地位,逐渐在创作中融入传统文化元素。荆楚文化是古代楚国存在八百多年的智慧产物,带有强烈的东方古国神秘色彩,是一支绚丽多姿的民族特色文化。在水彩画的发展历程中,荆楚文化对湖北的水彩画有深刻影响,其深厚的底蕴和丰富的内涵时刻熏陶着湖北艺术家的审美和创作理念,作者通过楚地水彩画的发展历程和具体表现对其进行研究。     

动态视角下城市通勤路径优化研究

针对城市上班族“通勤难”的问题,考虑到交通拥堵发生的不确定性,以动态视角研究基于实时交通信息的通勤车动态路径优化问题,同时将停靠点选址问题作为其影响因素优先进行分析。建立以行驶路径最短为目标的初始路径优化模型,并重新制定路线更新规则,将路口交叉点作为新的关键点引入更新策略。通过实证分析得到,动态优化后无拥堵状态下的通勤效率可以提高35.7%,存在拥堵的状态下通勤效率可以提高40%,证明了模型和算法的有效性。     

空间微重力条件下生长LiIO3、GaAs晶体的研究进展

综述了空间微重力环境下生长GaAs、α-LiIO3晶体的研究进展,展望了其应用前景.     

14Ni3CrMoV锻钢的回火脆性研究

对14Ni3CrMoV锻钢的回火脆性进行研究的结果表明,回火脆性可以通过对冲击试样断口观察、晶界腐蚀、透射电镜分析和俄歇电子能谱分析等方法来判断,该锻钢的回火脆性与磷在晶界的偏聚和连续第二相在晶界的析出有关。