生物合成对香豆酸大肠杆菌工程菌的构建

对香豆酸是一种具有预防心血管疾病、抗氧化和抗菌消炎等生物活性的酚类物质,同时,它也是高价值苯丙烷类保健营养品(如白藜芦醇)的前体。本研究希望创制出一种生物合成对香豆酸的方法,以缓解对香豆酸的供求问题。把带有粘红酵母(Rhodotorula glutinis)酪氨酸解氨酶(Rg TAL)基因的组成型表达载体转化大肠杆菌ATCC31884,并通过PCR鉴定后,获得重组菌株。对重组菌株进行发酵培养,对发酵液进行高效液相色谱检测,确定工程菌具有生物合成对香豆酸的能力。随后通过优化L-酪氨酸的添加量和工程菌的发酵时间,最终确定,底物L-酪氨酸的添加量为0.5 m M,发酵时间为36 h,检测发酵液中的对香豆酸含量最高,为161.23 mg/L。这表明,Rgtal基因在重组大肠杆菌中成功得到了表达,并且能利用自身代谢和外源添加的L-酪氨酸生物合成对香豆酸。     

高产靛蓝色素大肠杆菌工程菌的构建及靛蓝色素稳定性

目前国内外天然食用蓝色素资源稀缺,利用微生物发酵制备的靛蓝色素是天然蓝色素的重要来源之一。本文克隆了假单胞菌B3的苯乙烯单加氧酶基因sty AB,将其在大肠杆菌中进行了异源超量表达,构建了高产靛蓝色素的基因工程菌株E-AB,并研究了温度和光照等环境因素对靛蓝色素稳定性的影响。结果表明,工程菌以吲哚为底物合成靛蓝色素最高产量为68.9 mg/L,较野生型菌株提高约5.4倍。温度和光照条件对靛蓝色素色度稳定性具有显著性影响,低温和避光条件能显著延缓靛蓝色素的降解,而高温和紫外光则加速其降解;靛蓝色素降解反应较复杂,靛红是主要的降解产物之一。研究结果将为天然靛蓝色素的高效生物转化制备及应用提供了理论支持和技术指导。      

高产靛蓝色素大肠杆菌工程菌构建及其发酵转化条件

天然食用蓝色系色素是一类稀缺资源。本文克隆假单胞菌B3中苯乙烯单加氧酶基因sty AB,将其超量表达于大肠杆菌DH5α,构建高产靛蓝色素工程菌,研究色氨酸发酵转化生成靛蓝色素的影响因素,通过正交设计试验优化靛蓝色素发酵条件。结果表明,构建的sty AB基因过表达大肠杆菌DH5α-sty AB具有较高靛蓝色素合成能力,而野生菌DH5α中未检测到靛蓝色素生成;发酵液起始pH、温度、时间、底物色氨酸浓度等因素条件对DH5α-sty AB靛蓝色素合成代谢有一定影响。正交设计试验优化的发酵条件为:起始pH 6.8、色氨酸质量浓度1.2 mg/m L、发酵温度33℃、发酵时间28 h。在此条件下,靛蓝色素产量达到592.50 mg/L,较未优化前(414.61mg/L)提高了42.9%,接近理论值770.60 mg/L;工程菌DH5α-sty AB发酵底物吲哚的靛蓝色素产量为60.00 mg/L,表明色氨酸更适宜为靛蓝色素发酵底物。上述结果为天然靛蓝色素生物转化提供了理论依据和技术指导。     

不依赖IPTG诱导产木糖醇大肠杆菌工程菌的构建

该研究采用分子生物学技术构建不依赖异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导产木糖醇的大肠杆菌（Escherichia coli）工程菌,并研究启动子、质粒拷贝数、诱导剂IPTG的添加、基因xylA和xylB的敲除以及木糖含量对工程菌发酵产木糖醇的影响。结果表明,当转速为200 r/min时,E. coli AI07/pWYZ-1（启动子为lacP）的木糖醇产量是E. coli AI07/pAGI02（启动子为pflB-p6）的1.8倍;E. coli AI07/pWYZ-2（中拷贝质粒pBR322）的木糖醇产量高于E. coli AI07/pWYZ-1（高拷贝质粒pUC19）,分别为19.56 g/L、7.90 g/L;是否添加诱导剂IPTG对E. coli AI07/pWYZ-2产木糖醇影响不大,且在发酵96 h时,木糖醇产量极显著高于E. coli AI05/pWYZ-2（P＜0.01）,其在不添加IPTG的条件下,当木糖初始质量浓度为80 g/L,发酵时间为108 h时,木糖醇产量达48.7 g/L。     

乳酸菌细菌素plantaricin YKX对大肠杆菌生物被膜的抑制作用

大肠杆菌作为最主要的食源性致病菌之一,可形成生物被膜,增加环境抗性,造成食源性疾病。本文研究实验室前期筛选、制备所得乳酸菌细菌素plantaricin YKX对大肠杆菌ATCC25922生物被膜的抑制作用。结晶紫染色试验结果显示：plantaricin YKX质量浓度增到3/4MIC时,大肠杆菌ATCC25922生物被膜形成抑制率在50%以上。菌落计数试验结果表明亚抑菌浓度的plantaricin YKX能够减少生物被膜中的活菌数。扫描电镜观察发现经plantaricin YKX处理的大肠杆菌生物被膜分布稀疏,结构遭到破坏。激光共聚焦显微镜观察经plantaricin YKX处理的大肠杆菌ATCC25922的生物被膜,发现其活菌数量明显比未经plantaricin YKX处理的少。采用荧光染料标记结合荧光显微镜观察plantaricin YKX对生物被膜多糖黏附的影响,结果显示,与1/2MIC plantaricin YKX共培养的大肠杆菌ATCC25922胞外多糖分泌减少。本研究为食源致病菌大肠杆菌控制提供新方法、新途径。     

赤松花粉与普通玉米花粉有效成分的研究

本文叙述赤松花粉与玉米花粉有效成分对照及其价值。     

大肠杆菌工程菌产木聚糖酶工艺优化及酶学性质研究

对大肠杆菌工程菌产木聚糖酶的工艺进行优化,并对木聚糖酶的酶学性质进行研究。确定了提取工艺路线,即依次经过细胞破碎(高速珠磨法)、固液分离及除菌(中空纤维膜过滤)、超滤浓缩及烘干包衣步骤后得到肠溶木聚糖酶产品。该产品热稳定性好,在pH 2.5磷酸盐缓冲液中释放度为5.0%,在pH 5.5磷酸盐缓冲液中释放度为98.5%,产品外观光泽性好,能够很好地满足饲料酶市场要求。该木聚糖酶的最适pH值为6.4,最适温度为55℃。该酶具有较好的热稳定性,含水分17%的酶在90℃条件下2.5min仅失活13.6%。对木聚糖酶降解产物进行检测表明该木聚糖酶是一种内切酶。     

冬小麦膨胀素基因EXPB7工程菌构建及纤维素水解作用分析

为了寻找促进纤维素降解的有效方法来提高纤维素酶的降解效率。本研究以东农冬麦1号膨胀素基因EXPB7为供体,构建黑曲霉表达载体,以黑曲霉CICC2462为受体,采用农杆菌介导法遗传转化黑曲霉,构建膨胀素基因黑曲霉工程菌pSZHGS-EXPB7,并对该工程菌发酵液的纤维素水解促进作用进行分析。结果表明,黑曲霉重组膨胀素蛋白在对滤纸处理2 d后崩解效果明显,与出发菌株的分泌蛋白相比,具有一定的促进作用;重组菌株发酵液上清处理滤纸产生的还原糖含量显著高于出发菌株(P<0.05),与仅用酶液处理滤纸相比,能够将纤维素酶的水解效率提高32.9%。     

牛β-防御素BNBD11基因在大肠杆菌中的表达

探索牛β-防御素BNBD11原核表达及纯化的技术路线。根据已报道的BNBD11的氨基酸序列,兼顾大肠杆菌密码子偏好性,设计合成BNBD11基因。构建重组表达载体pET32a-BNBD11,转入E.coli BL21,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达。经SDS-PAGE检测融合蛋白结果显示,大部分表达产物以可溶形式存在,用Ni Sepharose柱层析纯化融合蛋白。融合蛋白经甲酸切割后,再次用Ni Sepharose柱层析去除带有His-Tag的杂蛋白,最终得到纯化的重组BNBD11。实验实现了BNBD11在大肠杆菌中的融合表达,并纯化了获得的重组BNBD11。     

大肠杆菌araE基因对典型苯丙素类化合物转运过程的影响

为了研究阿拉伯糖转运蛋白对大肠杆菌转运典型苯丙类素化合物的能力,采用基因过量表达和基因沉默技术,实现对蛋白质表达量进行控制,从而研究Ara E对苯丙类素化合物的转运过程机制。同时,用定量PCR技术在转录水平考察并验证了ara E基因的过量表达水平和基因抑制程度。通过测定菌体的生长动力学参数,衡量菌体对典型苯丙素类化合物的转运能力。结果表明,大肠杆菌ara E基因只参与了大肠杆菌对白藜芦醇的转运,对其他种类的苯丙素类化合物作用不明显。     

大肠杆菌—面包酵母种间耦合ATP再生系统中生物合成谷胱甘肽

利用混合悬浮培养的方法,构建了一个由重组大肠杆菌的谷胱甘肽生物合成酶系与面包酵母的糖酵解途径组成的ＡＴＰ再生系统,验证了该系统用于谷胱甘肽（ＧＳＨ）生物合成的可行性．研究了葡萄糖浓度、细胞量对耦合系统合成ＧＳＨ 能力的影响,讨论了所构建的ＡＴＰ再生系统中ＧＳＨ 合成能力较低的可能原因．     

Detection of Escherichia coli O157 in bovine meat products in northern Italy

Tests for Escherichia coli and E. coli O157 were carried out on meat samples collected from randomly chosen stores throughout the city of Bologna and suburban areas. The samples consisted of 25 g of loose minced beef, sometimes already shaped into meatballs or hamburgers, some of which were mixed with vegetables. The meat was purchased from retail outlets, open market stalls, and supermarket chains during 25 sampling visits from October 2000 to December 2001. For E. coli detection, Tryptone soya broth (TSB) supplemented with novobiocin and C-EC agar were used. Immunomagnetic separation with SMAC-BCIG-CT agar and chromogenic E. coli O 157 agar, API 20E system and agglutination latex test were used to detect E. coli O157; Vero cell assay and polymerase chain reaction (PCR) were used to assess toxin production and the presence of virulence genes.

E. coli were detected in 45 (30.2%) of the 149 samples examined, mainly in the hamburger samples mixed with vegetables and in the loose minced beef. E. coli O157 was found in one sample of hamburger and two samples of hamburger mixed with vegetables (2%) collected from three different butcher's stores between July and October. All the strains of E. coli O157 and most cases of E. coli were found in meat from small retailers.

The three strains of E. coli O157 were positive for verocytotoxin production. PCR analysis revealed genes coding for vt2 and one strain possessed the gene for eae A. Chromogenic E. coli O157 agar was found to be more selective and differential, allowing easier identification of suspected colonies with mixed flora and producing less false-positive colonies.     

表面活性剂对大肠杆菌产L-鸟氨酸的影响

系统研究了表面活性剂种类(Tween-40、Tween-60、Tween-80、曲通-X-100(Triton X-100)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化胺(CTAB))、表面活性剂添加浓度以及表面活性剂添加时间对大肠杆菌BW25113生长和发酵产L-鸟氨酸的影响。研究结果表明,发酵0h添加浓度范围为0.1g/L 2g/L的表面活性剂时,Tween-40、Tween-60、Tween-80、Triton X-100和SDS对大肠杆菌BW25113的生长和L-鸟氨酸的产量均无影响,而CTAB对L-鸟氨酸生物合成有一定的促进作用。CTAB的作用效果因CTAB的添加浓度和添加时间的不同而有所差异。发酵8h添加与0.1g/L为CTAB最适添加时间和最佳添加浓度。在该条件下,添加CTAB对大肠杆菌BW25113发酵产L-鸟氨酸的促进作用最大,L-鸟氨酸产量可达743mg/L并且几乎不影响大肠杆菌BW25113的生长。与不添加CTAB的对照组相比,L-鸟氨酸产量提高1.25倍,发酵周期也缩短10h。     

食品中大肠杆菌的快速检测方法

大肠杆菌是人及各种动物肠道中的正常寄居菌,食物或水中大肠杆菌的检出意味着直接或间接的近期粪便污染。大肠杆菌作为饮水、食品等的粪源性污染卫生细菌学指标;而且他在外界存活时间与一些主要肠道病原菌相近,它的出现也可能预示某些肠道病原菌（如沙门氏菌、志贺氏菌）的存在。大肠杆菌是国际上公认的卫生监测指示菌,因此大肠杆菌的检测技术显得十分重要,相应出现了大量的大肠杆菌的各种检测方法。     

芳樟醇对大肠杆菌的抑菌作用机制

源于天然植物中的芳樟醇具有抗菌作用,但其对食源性致病细菌的作用机制还不清楚。通过研究芳樟醇处理后大肠杆菌的形态、细胞内容物和ATP的变化,初步探究芳樟醇对大肠杆菌的抑菌机制,结果表明:芳樟醇对大肠杆菌有较好的抗菌活性,生长曲线结果显示1×MIC、2×MIC大肠杆菌生长完全受到抑制。细胞形态观察结果表明,膜电位下降近85%,胞内蛋白相较最初泄露达到238.64μg/mL,核酸相较最初泄露近81%,ATP含量下降至18.46μmoL/L,表明该抑制作用首先是从细胞膜开始的,芳樟醇的疏水作用使其聚集在细胞膜上,影响细胞膜的结构和功能,使细胞膜通透性增大,细胞内容物丢失,ATP含量下降,细胞功能异常,导致细胞死亡。芳樟醇具有显著抑菌效果,有望开发出一种新型天然抗菌剂。     

食源性大肠杆菌快速检测技术研究进展

大肠杆菌又称大肠埃希氏菌(Escherichia coli),其中有少数血清型可引起食源性疾病,对人类生命健康产生很大危害。因此,研究快速、灵敏、特异的食源性大肠杆菌检测方法对有效保障食品安全有着重要意义。本文对食源性大肠杆菌快速检测技术的研究进展进行了综述。      

酱油等调味品中大肠杆菌存活与分析

分析大肠杆菌在酱油中的存活特性,为酱油等调味品的卫生控制和检测提供技术指导。将购置的标准大肠杆菌菌株和从酱料中分离的野生型大肠杆菌人工接到大肠杆菌阴性的不同品种和厂家的瓶装酱油中,采用国家标准方法定期检测大肠杆菌的个数,计算大肠杆菌的存活时间,对大肠杆菌在不同品种和不同厂家酱油中的时间的存活率进行了研究。结果表明,不同种类大肠杆菌在酱油中存活时间不同,同种大肠杆菌在老抽系列酱油中的存活时间长于在生抽酱油的存活时间,时间长2 d~4 d,而在生抽中存活时间为1 d,存活时间短于以前的报道。同时普查了大肠杆菌在国内其他厂家酱油中的存活时间,发现存活时间多为1 d~2 d,并且不同种类存活时间存在差异。大肠杆菌在酱油中致死现象和机制有待进一步分析,该研究为当前控制酱油中大肠杆菌的污染问题提出了新的证据和启示。     

食源性大肠杆菌噬菌体的分离及其特性分析

目的从污水样品中分离致病性大肠杆菌的烈性噬菌体,分析其生物学特性,为食品中致病性大肠杆菌的控制提供参考。方法以标准菌株Escherichia coli EPEC(CICC10664)为宿主菌,采用双层平板法,从扬州市各地污水中分离纯化噬菌体,通过透射电镜观察其形态、测定最佳感染复数、一步生长曲线、裂解镨及其对宿主菌生物被膜的影响。结果分离到一株肠致病性大肠杆菌烈性噬菌体,命名为Ec.P01,电镜观察其为肌尾噬菌体,直径约为80 nm,最佳感染复数为0.01,一步生长曲线显示其噬菌体Ec.P 01的平均裂解量为48 PFU/m L,潜伏期约为10 min,裂解期约为90 min,热稳定性较好,对宿主菌生物被膜的形成有明显的抑制作用。结论本研究分离到一株肠致病性大肠杆菌烈性噬菌体,为治疗大肠杆菌感染疾病和治理食品及其环境污染提供新的思路与方法。     

二氧化氯(ClO2)对葡萄表面大肠杆菌杀灭效果的研究

用CiO2溶液浸泡已接种大肠杆菌的葡萄,观察处理时间、ClO2溶液体积与葡萄质量之比(v/m)、ClO2浓度对杀菌效果的影响.结果表明:处理时间从5min延长到10min杀菌效果上升2.35±0.18log,但进一步延长处理时间上升趋势变缓;v/m为2时的杀菌效果低于其为3、4、5时的杀菌效果,后3者之间无显著性差异(P＞0.05);ClO2浓度在很大程度上影响着杀菌效果,ClO2浓度增加杀菌效果明显提高.