实时荧光定量PCR法检测阪崎肠杆菌和肠杆菌科

使用全新实时荧光定量PCR的方法与传统的国家标准方法共同对180个样品中的阪崎肠杆菌以及肠杆菌科进行检测。包括婴幼儿配方奶粉(包括含益生菌或谷物的婴幼儿配方食品以及环境样品等)。分别从重复性,排除死亡细菌的干扰(假阳性)以及相对准确性、相对灵敏性和相对特异性等方面进行对比研究。结果表明,使用两种方法所得结果完全一致,并且实时荧光定量PCR方法有着明显的时间短,易操作等优点。     

阪崎肠杆菌分子检测研究进展

对分子生物学法检测阪崎肠杆菌的研究进展及在分子检测中内部扩增参比（内参）的应用作一综述。     

阪崎肠杆菌分子检测研究进展

对分子生物学法检测阪崎肠杆菌的研究进展及在分子检测中内部扩增参比(内参)的应用作一综述.     

进口乳制品中克罗诺阪崎肠杆菌分离株耐药性研究

目的 对进口乳制品中克罗诺阪崎肠杆菌分离株的耐药性进行研究.方法 采用纸片扩散法对99株克罗诺阪崎肠杆菌分离株和1株标准菌株进行药敏性试验,共选择7大类20种抗生素.结果 所测试的100株菌株对美洛西林、亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素、氯霉素、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他啶、环丙沙星和诺氟沙星敏感;对苯唑西林产生耐药;对头孢噻吩、氨苄西林、头孢唑啉、和四环素具有不同程度的耐药性,耐药率分别为65.0％、17.0％、3.0％和2.0％;对头孢唑啉、头孢噻吩、氨苄西林、头孢曲松和四环素中介率分别为25.0％、23.0％、6.0％、2.0％和1.0％;13株对3种抗生素耐药,4株表现多重耐药性.结论 进口乳制品中克罗诺阪崎肠杆菌分离株对所测试的大多数抗生素敏感,但对苯唑西林全部耐药,对部分抗生素出现较高的耐药和多重耐药性,因此克罗诺阪崎肠杆菌的耐药性应引起广泛的社会关注.     

基于内参系统的阪崎肠杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据阪崎肠杆菌ompA靶基因设计特异性引物和探针,并加入内参(IAC),建立能够实时监控反应过程的荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法对阪崎肠杆菌基因组DNA的最低检测限为1pg;对细菌的最低检测限为1×10~4 CFU;对含有靶基因质粒的最低检测限为10~3拷贝;Ct值与模板拷贝数均呈良好的线性关系(R~2=0.999)。人工污染试验结果表明,在初始菌量为10CFU/25g奶粉样品时,采用水洗加试剂盒法和水煮法提取DNA,阪崎肠杆菌均在增菌10h时检出。研究结果为进一步优化和完善阪崎肠杆菌分子生物学方法的标准化提供了参考。     

奶粉中阪崎肠杆菌PCR和荧光PCR检测方法的研究

建立了奶粉中可致婴幼儿高死亡率的阪崎肠杆菌的PCR和荧光PCR检测方法。利用细菌16S和23SrDNA的保守区设计通用引物,对6株阪崎肠杆菌16S-23SrDNA间区序列(ITS)进行扩增和测序,在比对阪崎肠杆菌ITS序列的基础上,设计了11条PCR和荧光PCR检测引物,组合成30对PCR引物,并筛选出一对种特异性引物,建立了奶粉中阪崎肠杆菌PCR和荧光PCR检测方法。用10株阪崎肠杆菌,18株近源菌株验证实验表明,本文所建立的PCR和荧光PCR方法特异性强;加菌实验表明,奶粉样品中阪崎肠杆菌检测低限为(2.2～5.4)CFU/100g,灵敏度高;新建的PCR和荧光PCR方法与FDABAM(美国食品及药品管理局微生物分析手册)方法比对实验表明,三种方法的检测结果完全一致。由于PCR和荧光PCR检测方法快速、可靠,因此可替代传统检验方法。     

奶粉中阪崎肠杆菌的风险评估

阪崎肠杆菌能引起脑膜炎、NEC和菌血症等，约2．5％～14％婴儿配方奶粉含有阪崎肠杆菌，0％～12％的普通奶粉含有阪崎肠杆菌，含量从0．36-66．0cfu／100g。婴幼儿奶粉中的阪崎肠杆菌问题已受到了全世界的普遍关注。本文基于大量研究和调查数据，从奶粉中阪崎肠杆菌的危害识别、奶粉中阪崎肠杆菌的暴露评估、奶粉中阪崎肠杆菌危害特性以及阪崎肠杆菌的检测方法等方面客观地对奶粉中阪崎肠杆菌进行风险评估，并对降低我国婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌风险提出建议。     

恒温实时荧光法快速检测奶粉中阪崎肠杆菌方法的建立

为实现奶粉中快速检测阪崎肠杆菌,本文建立了检测阪崎肠杆菌的恒温实时荧光法。针对阪崎肠杆菌16S r RNA设计三组LAMP引物,采用Deaou-308C恒温实时荧光检测平台,选取常见病原菌标准株进行引物特异性检测;选取阪崎肠杆菌标准菌株进行基因组DNA灵敏度和最低检测限测定,同时利用人工污染方式检测此方法在脱脂和全脂奶粉中的灵敏度和最低检测限,利用Real Amp法和国标法对20份市售奶粉进行对比实验。结果显示,引物组16S-11扩增效率最优,与常见病原菌无交叉反应,对阪崎肠杆菌基因组DNA、阪崎肠杆菌污染的脱脂和全脂奶粉的灵敏度分别达到102 CFU/m L、102 CFU/m L和103 CFU/m L;对阪崎肠杆菌基因组DNA和阪崎肠杆菌污染的脱脂和全脂奶粉的最低检测限分别达到103 CFU/m L、103 CFU/m L和104 CFU/m L;在20份市售奶粉样品中Real Amp检测结果与传统国标培养结果一致,表明本文建立的阪崎肠杆菌Real Amp检测方法适用于阪崎肠杆菌的快速检测。     

一种新的等温扩增技术检测阪崎肠杆菌

目的:建立一种新型阪崎肠杆菌快速筛选检测方法——交叉引物恒温扩增结合免疫金标检测方法。方法:针对阪崎肠杆菌16S-23S rDNA间区序列设计特异性引物及探针,建立交叉引物等温扩增法,利用免疫金标试纸条对结果进行检测。用18株阪崎肠杆菌及其他36株近源菌进行特异性试验;通过定量DNA、纯菌液计数、添加干扰菌检测进行灵敏度验证。结果:建立方法具有很好的特异性;增菌液检测灵敏度为10~1CFU/mL,DNA检测灵敏度为10~0fg/test。结论:建立的交叉引物恒温扩增结合免疫金标检测方法特异性好、灵敏度高,不需要复杂仪器,对口岸快速筛查、基层或偏远经济不发达地区顺利开展检测具有实际意义。     

食品中阪崎肠杆菌分析及其检测

阪崎肠杆菌是G^-杆菌,属于肠杆菌属中的一个种,是食源性的条件致病菌。主要危害免疫力低下的婴幼儿,导致脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎等疾病。依据FDA提供的“三管”增菌法和DFI改进法,均可以检测出样品中微量的阪崎肠杆菌。该菌具有一定耐热性,广泛分布于食品和周围环境中。通过提高原料质量、改善环境卫生和加大检测力度．可有效降低阪崎肠杆菌的污染．确保婴幼儿的身心健康。     

食源性阪崎肠杆菌耐药性分析及超广谱β-内酰胺酶检测

利用药敏纸片方法,对19株食品来源的阪崎肠杆菌进行16种常规抗生素药敏检测。结果显示,19株阪崎肠杆菌对苯唑西林以及头孢噻吩的耐药率分别为100%和78.95%,而均对其余种类抗生素敏感。采用PCR方法结合纸片扩散法对分离菌株进行分属于四大类β-内酰胺酶中的共10种超广谱β-内酰胺酶检测,结果未发现超广谱β-内酰胺酶阳性菌株。综合以上结果,目前食品中存在的阪崎肠杆菌仍为耐药性较弱的菌种,短时期内将不会对临床治疗带来较大威胁。     

应用多重实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌毒力基因

目的:建立一种快速、准确、简便的蜡样芽胞杆菌毒力基因检测方法,为蜡样芽胞杆菌更深入的研究提供依据和便利。方法:采用TaqMan探针法设计了三重hblA,hblC,hblD基因,三重nheA,nheB,nheC基因,三重ces,entFM,bceT基因的多重实时荧光PCR体系检测蜡样芽胞杆菌毒力基因。结果:多重体系对蜡样芽胞杆菌毒力基因的检测具有良好的特异性和灵敏性,其最低检出限为63 CFU/mL。结论:利用上述体系对蜡样芽胞杆菌的毒力基因进行检测能够省时省力,特异性、灵敏性良好,具有实际应用价值。     

多重实时荧光定量PCR同时检测冷冻蔬菜中4种食源性致病菌

目的 建立一种基于TaqMan探针的多重实时荧光定量PCR(multiplex quantitative real-time PCR, multiplex qPCR)同时检测冷冻蔬菜中4种食源性致病菌的方法。方法 针对金黄色葡萄球菌nuc基因、痢疾志贺菌rfc基因、沙门氏菌invA基因、单增李斯特氏菌hly基因, 设计4对引物和探针, 优化反应体系, 建立稳定的多重qPCR反应体系。通过阳性菌株污染的方法验证体系的特异性, 并确定了冷冻蔬菜样品在细菌水平的检出限。结果 各对引物和探针对目标菌有较强的特异性, 对其他非目标菌进行检测均未检出, 人工污染冷冻蔬菜中志贺菌的检出限为102 CFU/g, 沙门氏菌和单增李斯特氏菌的检出限均为103 CFU/g, 金黄色葡萄球菌的检出限为104 CFU/g。结论 本研究可以实现冷冻蔬菜样品中4种致病菌qPCR高效检测。     

肉制品中沙门氏菌invA基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

针对沙门氏菌invA基因设计一对特异引物,建立SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性检测。结果表明,所建立的沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法,特异性良好,组间组内重复性良好,沙门氏菌检测下线为101CFU/mL。本研究建立了沙门氏菌特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR检测方法,为沙门氏菌的快速诊断奠定了基础。      

实时荧光PCR方法在食品真伪辨别中的应用

实时荧光PCR技术以其特异性、灵敏性、简便、快速的优点,广泛应用于食品鉴伪检测。本文阐述了实时荧光PCR的原理以及其在肉制品、高价值食品、乳制品、果汁、水产品和油脂鉴伪检测方面的应用情况。      

溶藻弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立溶藻弧菌（VA）的快速检测方法,本研究以VA Collagenase基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针,建立了实时荧光定量PCR快速检测VA的方法。结果显示,对15株实验菌株进行荧光定量PCR检测,只有VA菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为18 cfu/m L;稳定性和重复性实验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值的变异系数均小于2%;利用该检测方法对采集的165份样品进行检测,共计检出2份VA阳性样品,与SN/T2564-2010行标法检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。      

基于vvhA基因检测创伤弧菌实时荧光PCR方法的建立

为建立创伤弧菌(VV)的快速检测方法,根据vvhA基因序列设计合成引物和探针,建立实时荧光PCR方法。结果显示:所建立的方法能特异扩增出VV标准阳性菌株,而对其它14种菌株没有扩增;该方法的灵敏度为15CFU/mL;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值(循环阈值)的变异系数均小于2%;利用该检测方法对采集的156份样品进行检测,共计检出2份VV阳性样品,与行标法(SN/T 1870—2007)检测结果一致。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。     

食源性MRSA双色荧光PCR检测方法建立

目的建立快速检测食源性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)Taqman探针双色荧光PCR方法。方法根据金黄色葡萄球菌种属鉴定nuc基因和MRSA决定因子mec A基因,设计合成引物探针,建立双色荧光PCR扩增体系。利用所建立的方法检测特异性及灵敏度。将金黄色葡萄球菌依次传代培养,检测不同代次的菌株验证方法的稳定性,并对实际样品分离株进行检测验证方法的可行性与实用性。结果该方法可准确并特异性检测出MRSA和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptible Staphylococcus aureus,MSSA),检测MRSA的nuc基因和mec A基因的灵敏度可达2.7×103 CFU/m L,不同代次的菌株的检测结果一致。结论本实验所建立的双色荧光PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏度及稳定性,可用于快速检测食源性MRSA。