灵芝超高压突变株漆酶的纯化和酶学性质

灵芝超高压突变株G1502的发酵液经浓缩、DEAE-纤维素柱层析,纯化出一种漆酶。其最适作用温度为45℃,在不高于45℃的条件下保存5 h,残余酶活在97%以上;最适pH为4.4,在pH=3.8~6.6内保存,残余酶活在80%以上。漆酶催化愈创木酚的υmax和Km分别为2.28μmol.L-1.min-1和1.94×10-4mol.L-1。金属离子K+和Cu2+对酶有激活作用,Fe2+、Co2+、Ca2+、Na+、Ba2+对酶活有很大的抑制作用。     

灰树花漆酶的酶学性质及其脱色作用研究

通过对液体发酵灰树花漆酶的酶活、Km常数、温度和p H值的测定,探讨了Cu2+、Fe3+、Ca2+对漆酶酶活的影响,观察了漆酶对5种染料的脱色作用效果。结果表明:灰树花发酵液中漆酶氧化ABTS的Km为1.35×10-5mol·L-1,在p H值2~6的范围内均表现酶活,最适p H值为3.0,在25~70℃温度时范围内均有酶活,在50~55℃时酶活性最高。Cu2+、Fe3+、Ca2+对漆酶的活性均有抑制作用,Ca2+离子的抑制作用较弱。灰树花漆酶对甲基橙、甲基红、溴甲酚绿、甲基蓝和亚甲基蓝染料的脱色率分别为85.77%,81.10%,72.68%,22.02%和4.22%。介体ABTS对漆酶处理甲基蓝的脱色有促进效果,而对亚甲基蓝、溴甲酚绿和甲基红的脱色促进效果较弱,对甲基橙的脱色无促进作用。结论:本研究中灰树花漆酶最适p H值为3.0,在50~55℃时酶活性最高;灰树花漆酶对甲基橙、甲基红、溴甲酚绿染料的脱色效果理想。     

恶臭假单胞菌腈水解酶的生物催化特性

以丙烯腈为底物,对产腈水解酶菌株Pseudomonas putida XY4在静息细胞状态下的催化特性进行了研究,考察了p H、温度、金属离子、底物浓度对酶的影响,以及该酶的p H与温度稳定性、底物特异性等,同时对丙烯腈的生物转化过程进行考察。结果表明,腈水解酶的最佳催化条件为p H=7.2,30℃,底物浓度150 mmol/L;Ag+、Cu2+和Fe3+对酶具有强烈的抑制作用;该腈水解酶对3-氰基吡啶等芳香族杂环腈具有较高的特异性,其次是甘氨腈和丙烯腈,对酰胺类物质无特异性。该研究对利用腈水解酶生物催化丙烯腈制备丙烯酸的应用提供借鉴。     

漆酶催化偶氮染料酸性橙脱色的研究

利用米曲霉菌漆酶对偶氮染料酸性橙进行脱色实验,考察反应时间、pH、加酶量、温度、染料质量浓度等因素对脱色率的影响。结果表明,漆酶催化酸性橙的适宜条件为:反应时间为50 min、pH=6、加酶量为2 mL、反应温度为50℃、染料质量浓度为0. 1 g/L,最适条件下酸性橙的脱色率达88. 32%。同时研究了金属离子、酶抑制剂对酸性橙脱色的影响,结果发现十二烷基硫酸钠(SDS)显著抑制漆酶的催化活性,Fe²⁺对漆酶脱色有完全抑制作用; Mg²⁺对脱色有一定的促进作用。     

漆酶及其在有机合成中应用的研究进展

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,可催化酚类、芳胺类等单体聚合,也可催化合成多种具有生物活性的物质,且唯一的副产物是水,因其催化过程对环境污染小而受到青睐。本文综述了漆酶的催化结构特征、生产现状及其在有机合成中的应用,着重探讨漆酶结构上的特征和漆酶氧化还原电势的影响因素,以及漆酶介质体系中的反应机理;分类介绍了漆酶催化的聚合反应、酚类和芳胺类底物及非酚类底物的氧化反应。并对目前漆酶的研究现状和发展趋势进行了评述。     

漆树漆酶催化单宁酸的氧化反应研究

用分光光度法考察漆树漆酶催化单宁酸的氧化情况,探讨了pH值、反应温度、单宁酸浓度、有机酸和金属离子等对催化反应的影响.结果表明,当反应温度为30℃时,漆树漆酶催化反应效果较好;在pH值为4.2～ 9.8的范围内,反应速率随pH值增大而加快;单宁酸浓度在1.47×10-5 ～ 2.94×10-4 mol·L-1时,反应速率随底物浓度的增大呈线性增加;Cu2 、Mg2 和Ni2 三种金属离子对催化反应有激活作用,其中Cu2 影响最大;而柠檬酸和乙二胺四乙酸对酶催化反应均有抑制作用.     

非水相酶催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯

研究了不同脂肪酶在有机溶剂体系中催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯,确定了较有效的脂肪酶和溶剂体系,对影响产物浓度的几种主要因素进行了讨论,确定最适反应条件为叔丁醇为溶剂、催化剂Novozyme435脂肪酶的质量浓度10g·L-1、底物棕榈酸与Vc摩尔比3∶1、反应温度59℃和反应时间50h。纯化后产物的纯度可达95%。     

糙皮侧耳菌漆酶的分离纯化及部分性质研究

对糙皮侧耳菌5.42产生的漆酶粗酶液通过超滤浓缩、DEAE-Cellulose和SephadexA-50纯化,得到纯化18.1倍漆酶,得率36%,用PAGE检测为单一条带,用SDS-PAGE证明漆酶的分子量为61.4 kD,而用经过高效液相色谱分离的酶液进行质谱检测分子量为60.5 kD。该酶最适温度为40℃,最适pH为5.0。金属离子对酶活有很大的影响,其中K+、Mn2+、Cu2+有明显促进作用,Hg2+、Ag+、Ba2+等对酶活有明显的抑制作用。该酶与果胶酶按比例组合在一起,对荨麻生物脱胶取得良好的脱胶效果——木质素去除率为85%。     

铜(Ⅱ)离子对白腐菌Panus conchatus产木素降解酶的调控

研究了在培养基中铜离子存在以及浓度的变化对白腐首Panusconchatus产漆酶和依赖锰过氧化物酶的影响。结果表明依赖锰过氧化物酶的产生受Cu2+浓度的影响不大,而漆酶的产生却显著受CU2+的调控,没有Cu2+存在时,漆酶的活性很低,增加Cu2+浓度漆酶的活性增大,但是过多的Cu2+又会对漆酶的产生有抑制作用,使酶活降低。     

L-谷氨酸氧化酶生物合成α-酮戊二酸的工艺优化

利用表达L-谷氨酸氧化酶(LGOX)的工程菌进行全细胞催化L-谷氨酸钠合成α-酮戊二酸,考察了各无机离子对酶活的影响,结果表明1mM Mn2+和Mg2+分别对酶活有22%和15%的提高,而Fe2+、Cu2+和Ba2+对酶活有不同程度的抑制。正交实验设计考察催化反应中的影响因素,包括温度、pH、投菌量(固定底物浓度为100g/L)、过氧化氢酶添加量,结果表明最优工艺为温度为30℃、pH值为6.5、投菌量2%、过氧化氢添加量为2%,反应15h,摩尔转化率为99%,该工艺结果对α-酮戊二酸的酶催化工艺有很强的指导作用。     

腈水合酶固定化方法和催化特性的研究

以一种能够产生腈水合酶诺卡氏菌为研究对象,针对原来的海藻酸盐包埋法存在的固定化细胞强度较小、通透性较差等问题,改进了对酶的固定化方法,并对固定化腈水合酶的催化特性:最适反应温度、pH值、底物丙烯腈浓度、和表面活性剂性质和丙烯酰胺累积浓度对酶活性的影响等五个方面进行了研究。其中固定化腈水合酶最适反应温度在15~25°C;pH 7.0左右;底物丙烯腈浓度为3%~4%;Triton X-100对酶活性基本无影响,而Tween 80和Tween 60对酶活力有抑制作用;固定化腈水合酶在丙烯酰胺累积浓度为15%~20%之间时,酶活性较好。     

邻苯二酚在水相胶束中的酶促聚合

在十二烷基苯磺酸钠(SDBS)的水相胶束体系中,利用漆酶催化聚合邻苯二酚。探讨了反应体系的温度、pH、底物摩尔比以及邻苯二酚浓度对聚合反应的影响。通过FTIR、GPC、DSC和TGA对产物进行表征。结果表明:漆酶催化邻苯二酚聚合的最适条件为温度40℃,pH=5.5、邻苯二酚浓度为5 mmol/L、SDBS与邻苯二酚摩尔比为2∶1。聚合产物相对分子质量(简称分子量,下同)约为810,热分析表明,聚合物玻璃化转变温度为95℃。     

固定化假丝酵母99-125脂肪酶催化酯化脂肪酸低碳醇酯反应条件的研究

以硅藻土和纺织品为载体 ,采用吸附法制备固定化脂肪酶 ,研究了固定化假丝酵母 99 1 2 5脂肪酶在有机溶剂中催化脂肪酸低碳醇酯酯化合成过程中 ,有机溶剂性质、脂肪酸与低碳醇的结构、pH值、反应温度和体系含水量、低碳醇的抑制作用等因素对酯化过程的影响。试验结果表明 :底物低碳醇需要采用流加方式加入体系 ,石油醚是最适宜的有机溶剂 ,脂肪酸与醇的碳链越长 ,越易于酯化 ;固定化脂肪酶对直链醇的选择性优于支链醇。以石油醚为有机溶剂 ,在反应温度为 40℃、pH值为 7时 ,硬脂酸与甲醇的酯化率达 95 % ;反应后期应除去体系中的水以避免酶失活。固定化酶间歇催化油酸与甲醇的酯化时 ,重复使用 1 5次 (每次 2 4h) ,其操作半衰期约为 360h。     

苯乙基间苯二酚抑制黑色素形成的机理研究

采用药物替代法,分别阻断黑色素生成过程中的酶催化和非酶催化两个阶段,探究苯乙基间苯二酚抑制黑色素形成的作用机理。在p H=6.8的磷酸盐缓冲溶液中,分别以L-酪氨酸和L-多巴为底物,37℃反应后在475 nm处测定吸光度,研究苯乙基间苯二酚对酪氨酸酶催化反应进程的影响,计算抑制动力学参数;通过分子对接技术分析苯乙基间苯二酚抑制酪氨酸酶作用的分子机制。结果表明,苯乙基间苯二酚对黑色素生成过程中的酶催化反应具有抑制作用,是酪氨酸酶抑制剂;对非酶催化过程无影响;对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶的半抑制浓度IC_(50)分别为0.28和31μmol/L;对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用表现为非竞争性抑制,抑制常数K_m=1.1;分子对接结果显示,苯乙基间苯二酚与酪氨酸酶活性中心的MET A:280形成氢键,并伴有疏水作用。     

重组酪氨酸酚裂解酶全细胞催化合成L-酪氨酸

利用基因工程手段重组表达了弗氏柠檬酸杆菌来源的酪氨酸酚裂解酶(TPL),以丙酮酸和L-丝氨酸为底物全细胞催化合成L-酪氨酸,考察了pH、温度、表面活性剂、金属离子、铵盐种类和氯化铵浓度等因素对L-酪氨酸合成的影响,并比较了两种底物合成L-酪氨酸的转化率。结果表明,TPL的最适反应条件是45℃,pH=8.0,4mmol/L PLP,氯化铵浓度350 mmol/L。1 mmol/L triton-x 100对TPL酶活有促进作用,金属离子对TPL酶活都有明显的抑制作用。0.1 mol/L丙酮酸的转化率约是L-丝氨酸的1.8倍。     

不同离子对漆酶酶活的影响

设置一系列不同种类、不同浓度的离子溶液,探究其对漆酶酶活的影响。结果表明,阳离子中Fe~(2+)、Fe~(3+)对漆酶的抑制作用显著,并分析了离子浓度对漆酶的影响以及不同离子对漆酶的抑制机理。分析表明Fe~(2+)可能是通过与2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基结合影响漆酶酶活,Fe~(3+)可能是通过影响或置换漆酶中的部分铜离子影响漆酶活性,其中因为漆酶的活性中心是由四个铜离子组成,特别分析了Cu~(2+)对漆酶活性的影响,Cu~(2+)可能是通过与漆酶中的酸性氨基酸残基作用或通过影响漆酶的电荷平衡影响漆酶活性。在常见的阴离子溶液中,CO_3~(2-)抑制漆酶酶活,NO_3~-和SO_4~(2-)对漆酶有一定程度的激活,Cl~-轻微抑制漆酶酶活。分析表明阴离子的抑制作用可能是通过与底物分子竞争Ⅱ铜中的某一个位点来实现,激活作用可能是通过修饰漆酶氨基酸残基来实现。还研究了不同类型离子的复配,结果显示不同类型的复配对漆酶的影响方式也不同,但主要是通过作用于漆酶活性位点来影响酶活。     

Cu2+改性SBA-16固定化漆酶的研究

以介孔分子筛SBA-16为载体,用浸渍法将Cu2+负载于SBA-16上制备了Cu/SBA-16,然后用吸附法固定化漆酶,以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐为底物考察了漆酶的最适pH值、固定化体系中的载酶量以及Cu2+对固定化漆酶活性的影响。结果表明,在p H值为3时,漆酶具有较高的活性;固定化漆酶的活性随着酶和载体质量比的升高先快速升高然后趋于稳定,当酶和载体质量比为96 mg/g时,固定化漆酶的活性达到较高值;负载Cu2+后,Cu/SBA-16固定化漆酶的活性与Cu2+负载量呈现一定的正相关性。     

在有机溶剂中猪胰脂肪酶催化合成己酸乙酯的研究

研究了有机溶剂中猪胰脂肪酶催化正己酸和无水乙醇合成己酸乙酯的反应。以正己酸和无水乙醇在各种反应介质中进行酶催化反应,用气相色谱检测生成的己酸乙酯,考察反应介质、底物浓度、底物摩尔比、加酶量、反应时间对产率的影响。发现在高底物浓度和低底物浓度的条件下,有机溶剂介质对反应的影响是不同的。采用中等底物浓度,选择lgP值适中的溶剂为介质最合适。适当的反应条件为:以环己烷为反应介质,正己酸浓度0.6mol/L,n(正己酸)∶n(无水乙醇)=1∶1.25,加酶量15g/L,反应温度37℃,反应24h后,产率达到90.5%。该文的底物浓度较高,是文献[1,10,11,17]报道的1.5～3.0倍,获得了相近的产率。     

拟南芥腈水解酶催化合成普瑞巴林中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸

普瑞巴林是治疗神经病理性疼痛、部分癫痫发作和焦虑症的重要药物。本文以外消旋异丁基丁二腈(IBSN)为底物,筛选获得了能够立体选择性合成普瑞巴林手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的拟南芥腈水解酶NiT。考察了该腈水解酶催化IBSN水解的最适催化温度、pH、不同IBSN浓度及金属离子对酶催化反应的影响。结果表明,该酶的最适催化温度为30℃,最适pH为8.0,最适底物浓度为250mmol/L。在此条件下反应6h,(S)-3-氰基-5-甲基己酸的产率和光学纯度分别达到43%和95%。     

不同培养条件对云芝(Coriolus versicolor)木质素降解酶产酶影响的研究

本文研究了不同培养条件对云芝（Coriolusversicolor）三种木质素降解前产酶的影响，发现三种木质素降解酶即水质素过氧化物酶（Lip）、赖锰标木质素过氧化物酶，（Mnp）和漆酶的产生和培养条件关系很大，添加黎芦醇（VOH）能显著地提高三种酶的产量，当VOH浓度为1mmol／L时，可使木质素过氧化物酶产量提高10倍，添加Mn2＋对赖锰木质素过氧化物酶有促进作用，但对木质素过氧化物酶有抑制作用。提高其它微量元素（Cu2+，Fe2+,Zn2+，Ca2+）等同样能显著促进三种酶的产生。采用30信浓度时，赖锰木质素过氧化物酶的量要比1培浓度时提高6倍。三种酶的最适产酶pH相差很大，木质素过氧化物酶在pH4．5～5．5左右，赖锰木质素过氧化物酶在PH5．5～6.5左右，而漆酶则抵达pH3．5～4．0．Tween80在低浓度时（0.01％-0.02％）有一定的促进作用，而在高浓度则有抑制作用。C／N比则是影响产酶的另一因素，低碳培养基比低氮培养基更适宜三种木质素降解酶的产生。同时，在低氮培养基和低碳培养基下，上述因素对三种酶产生的影响也存在显著差异。这有可能是云芝的木质素降解酶在不同的C／N下其产生机理存在差异。