短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)脱毛蛋白酶基因的克隆与序列分析

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)UN-31-C-42菌株是从成都市生活垃圾中分离,并经多次诱变后得到的菌株。其发酵液具有很好的脱毛效果,且对皮革胶原没有损伤。通过对该菌株发酵液中的碱性蛋白酶DHAP的纯化与N′-末端氨基酸序列测定,以及对该序列的同源性分析后,设计出相应引物,用PCR方法扩增了该菌株的碱性蛋白酶基因AP。测序结果表明,该克隆基因全长1588bp,有一个全长1149bp的编码区序列,推测蛋白质序列长383个氨基酸残基,成熟肽分子量为27．8kD。推测的成熟蛋白酶N′-末端具有与DHAPN′-末端完全匹配的序列,说明克隆到的基因为脱毛蛋白酶基因。同源性分析表明,该基因序列与已报道的其他碱性蛋白酶基因有较高的同源性。     

慢生型大豆根瘤菌nfeC基因的克隆及序列分析

通过亚克隆,将重组质粒pGXN201中与nfeC基因同源的片段定位在4kbClaI XbaI片段上,序列分析表明该片段全长4038个碱基,该片段上含有一个完整的阅读框架,该阅读框架编码一个含275个氨基酸的多肽,与已报道的nfeC基因编码的蛋白质具有93%的同源性。     

华根霉(Rhizopus chinensis)前导肽脂肪酶基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达

通过3次PCR程序克隆得到了华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)脂肪酶全基因序列,该基因的开放阅读框长1170bp,不含内含子,编码一个389个氨基酸残基的蛋白质,包括26个氨基酸的信号肽,94个氨基酸的前导序列和269个氨基酸的成熟肽,其推断的氨基酸序列与一些已报道的根霉脂肪酶序列同源性为86%.在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中分泌表达前导肽序列.SDS-PAGE分析表明表达蛋白的分子量约37kD.N-端氨基酸序列分析表明该重组蛋白分泌过程中前导序列N-端的67个氨基酸被切割掉,表达的重组脂肪酶由前导序列C-端的27个氨基酸和成熟肽的269个氨基酸组成.发酵132h后上清中重组脂肪酶的表达量最高,蛋白含量约5.4mg/mL,橄榄油乳化法测水解酶活为161U/mL,其比活比野生型华根霉脂肪酶高约43倍.     

真鲷转铁蛋白基因的克隆与表达特征分析

采用同源克隆的方法,根据相近物种转铁蛋白(Transferrin,TF)基因的序列设计简并引物,在经感染真鲷的cDNA上进行PCR扩增,获得了真鲷TF的全基因编码序列(GeneBank Accession No．AY335444)。该序列由2444bp核苷酸组成,含31bp5’非编码区和340bp3’非编码区以及2073bp的开放阅读框,可编码691个氨基酸,预测分子量约为74．3kD,等电点为5．63。同源性分析表明,真鲷TF与鱼类TF的相似性很高,约为65％～75％;与哺乳类转铁蛋白和乳铁蛋白的相似性约40％～50％;与脊索动物海鞘和无脊椎动物昆虫也有一定的相似性。进化分析表明,该基因是转铁蛋白而不是乳铁蛋白。真鲷TF与其它动物TF结构相似,是由两叶相似的结构域构成的单一肽链;该基因有一信号肽序列,缺乏糖基化位点,在它的两个结构域上,分别有三个TF家族的标签序列及一个MHC分子标签序列;与哺乳类相比,参与蛋白二硫键形成的半胱氨酸以及铁离子结合位点高度保守。RT-PCR结果显示,真鲷TF在肝脏成组成型表达,但在其它组织中的表达可受病原调控,表现为经病原刺激后转铁蛋白基因的组织分布显著增多。     

植物抗体基因工程：Ⅲ.马铃薯Y病毒小鼠中和抗体链基因的序列分析及其...

序列分析表明，马铃薯Ｙ病毒小鼠中和抗体轻链基因（Ｋ６）全长为９５６个核苷酸碱基，其中包括５’端非编码区３１个核苷酸碱基，编码轻链信号肽的５７个核苷酸碱基，编码成熟蛋白的６５７个核苷酸基和３’端非编码区的２１１个核苷酸碱基。与已知的其它Ｋ轻链基因（ＭＲＫ１６）相比，核苷酸的序列同源性为９８．７％，由核苷酸序列所推导出的氨基酸序列同源性为９７．０％，其变异主要发生在三个抗原识别位点内（ＣＤＲ）。将完整     

节旋藻FACHB341 Rubisco基因部分序列的克隆和分析

以节旋藻FACHB34l为材料，对所克隆Rubisco基因进行了核苷酸序列测定和分析，由此推导出相应的氨基酸序列，并与部分其他蓝藻的同源基因进行了同源性分析。结果表明：所克隆DNA片段包含Rubisco大小亚基基因部分序列及rbcX基因序列，长度为2073bp，其中rbcL和rbcX基因之间存在两个转录茎环结构；大小亚基酸性氨基酸和碱性氨基酸的比例分别为13．14％和14．51％，疏水氨基酸的比例为42．16％；rbcL核苷酸序列与集胞藻PCC6803、Prochlorothrix hallandica、聚球藻PCC630l、Agmenellum quadruplicatum和鱼腥藻PCC7120同源序列的相似性分别为91．7％、79．9％、74．8％、77．2％和76．1％；rbcS核苷酸序列与鱼腥藻PCC7120同源序列的相似性为67．6％，而与PCC630l和集胞藻PCC7002同源序列的相似性分别为30．1％和63．8％。     

植物抗体基因工程：Ⅳ．马铃薯Y病毒小鼠中和抗体重链基因的序列分析及其植物表达

序列分析表明，马铃薯Ｙ病毒小鼠中和抗体重链基因（Ｇ９）全长为１５０５个核苷酸碱基（不包括Ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴），其中包括５＇端非编码区１６个核苷酸碱基、编码重链信号肽的５７个核苷酸碱基、编码成熟蛋白的１３２９个核苷酸碱基和３＇端非编码区的１０３个核苷酸碱基。与已知的小鼠抗体Ｍｏｐｃ２１的重链基因（γ１）相比，核苷酸的序列同源性为９４．４％，由核苷酸序列所推导出的氨基酸序列同源性为９２．６％，其中可变区内（ＶＨ）的氨基酸序列同源性达７４．５％，这表明二者起源于同一种系基因。将完整的抗体重链基因正向插入植物表达载体ｐＢⅠ１２１中的原ＧＵＳ基因位置上，置于花椰莱花叶病毒３５Ｓ启动子控制之下，获得了能够在植物细胞内表达马铃薯Ｙ病毒中和抗体重链基因的植物表达载体ｐＹＨ。     

植物抗体基因工程：Ⅲ．马铃薯Y病毒小鼠中和抗体链基因的序列分析及其植物表达载体的构建

序列分析表明，马铃薯Ｙ病毒小鼠中和抗体轻链基因（Ｋ６）全长为９５６个核苷酸碱基（不包括ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴），其中包括５＇端非编码区３１个核苷酸碱基，编码轻链信号肽的５７个核苷酸碱基，编码成熟蛋白的６５７个核苷酸基和３＇端非编码区的２１１个核苷酸碱基。与已知的其它Ｋ轻链基因（ＭＲＫ１６）相比，核苷酸的序列同源性为９８．７％，由核苷酸序列所推导出的氨基酸序列同源性为９７．０％，其变异主要发生在三个抗原识别位点内（ＣＯＲ）。将完整的抗体轻链基因正向插入植物表达载体ｐＢ１２１中的原ＧＵＳ基因位置上，置于花椰菜花叶病毒３５Ｇ启动子控制之下，获得了能够在植物细胞内表达马铃薯Ｙ病毒中和抗体轻链基因的植物表达载体ｐＹＬ。     

脆壁克鲁维酵母蛋白二硫化物异构酶KfPDI的结构分析

利用ＤＮＡ限制性内切酶图谱分析将一个带有脆壁克鲁酵母蛋白二硫化物异构酶基因（ＫｆＰＤＩ）的１０ｋｂ初始克隆缩短为４ｋｂ的亚克隆,并测定了该基因的ＤＮＡ全序列。经分析发现：（１）该基因编码产物由５２０个氨基酸重印箕组成。（２）它与乳酸克鲁维酵母蛋一太化物异构酶在氨基酸序列上的同不原性为７８％。（３）民其他物种的ＰＤＩ基因在核苷酸和蛋白持水平上的同源性较弱,但都存在有两个高度保守的异构酶活性位点。     

外来入侵生物福寿螺β-actin基因片段的克隆及表达分析

采用RT-PCR的方法首次对入侵我国福寿螺的β-actin基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并通过氨基酸序列分析推导与其他相关物种的亲缘关系.结果表明,获得的福寿螺β-actin基因cDNA片段大小为840bp,核酸编码有280个氨基酸序列,与其他物种具有高度的同源性.通过邻接法(NJ)构建的系统发育树显示,福寿螺首先与软体动物聚为一簇,然后与节肢动物聚为一簇,再与脊椎动物聚为一簇.此外,RT-PCR结果显示,β-actin基因在福寿螺的鳃、消化腺、肾和足部肌肉等4个组织内的表达基本一致,具有良好的稳定性.     

极大节旋藻(Arthrospira maxima)生物钟基因kaiC的克隆及分析

以kaiC基因簇部分已知序列为引物设计位点,采用PCR反应池法从节旋藻基因组fosmid文库中筛选到kaiC基因克隆,通过步移测序获得了kaiC基因全长序列。kaiC基因编码区长1554bo,基因GC碱基含量平均为41．76％,密码子第三位明显偏向于U。在基因上游385bp范围内发现一个可能的启动子序列和一些基因调控元件。KaiC蛋白分析发现了Walker A、DXXG、不完整的Walker B等重要模体和具有催化作用的功能位点。Southem杂交的结果证明kaiC基因在极大节旋藻中为单拷贝。极大节旋藻kaiC基因的特殊结构特征为研究kai基因簇的进化提供了重要的启示。     

表达绿色荧光蛋白基因的花鲈胚胎干细胞株的建立及其体外分化

以带有绿色荧光标记的基因(pCMV-EGFP)为报告基因,用Genejammer、Genejuice和Metafectene三种脂质体介导花鲈胚胎干细胞(LJES1)的基因转移.实验发现,Genejammer介导的细胞转化效率最高,高达27.3%,其余分别为12.1%和5.3%.转移绿色荧光蛋白(GFP)基因的LJES1细胞经过药物筛选和单克隆化培养,获得了表达GFP基因的阳性克隆细胞株,经PCR对GFP阳性细胞株的基因组DNA及提取的RNA扩增,获得了目的条带,证实了GFP基因已经整合到LJES1细胞的基因组中,并获得了正常的表达.通过体外诱导,GFP阳性细胞能够分化为神经细胞、肌肉细胞、成纤维细胞等,用悬滴法培养获得了GFP阳性细胞的拟胚体,证实了经过长期的药物筛选后,LJES1细胞仍然保持着发育的多能性.这一研究,为进一步利用海水鱼类胚胎干细胞进行遗传操作及基因工程的研究提供了方法上的探索.     

致病性鳗弧菌金属蛋白酶基因克隆及序列分析

从我国山东沿海发病的鲈鱼（Lateolabrax japonicus）分离到一株致病性鳗弧菌（Vibrio anguillarum）W-1，该菌的胞外蛋白酶活性为4226u/ml，部分纯化的胞外蛋白酶对海水养殖大菱鲆鱼有一定的毒性。应用PCR扩增，从鳗弧菌W-1染色体DNA扩增出一条长约1.925kb的特异性PCR产物，DNA序列分析表明：克隆的片段含有完整的金属蛋白酶基因阅读框，编码611个氨基酸残基的蛋白质，该金属蛋白酶基因与一株致病性鳗弧菌蛋白酶基因的核苷酸及氨基酸序列同源性为100%，而与解蛋白弧菌（V.proteolyticus)、创作弧菌（V.vulnificus）、霍乱弧菌（V.cholerae)、斑点气单胞菌（Aeromonas punctata），嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的氨基酸序列同源性分别为73%、70%、69%、53%、51%。     

海带配子体叶绿素a/c结合蛋白基因lhcf6的序列特征与系统发生分析

通过根据糖海带(Laminaria saccharina)叶绿素 a/c 结合蛋白基因 lhcf6 的 cDNA 序列设计的引物和 PCR 方法获得了海带(L.japonica)配子体 llwf6 基因的 cDNA 全长序列(GenBank 登录号:DQ250739).该序列的开放阅读框(ORF)与糖海带 lhcf6 编码序列的相似性高达 99%,而两非翻译区(UTR)序列的相似性只有94%.经推测,海带配子体 lhcf6基因序列的 ORF 编码一个含 218 个氨基酸的前体蛋白 LHCF6,其氨基端的 40 个氨基酸组成跨质体内质网和叶绿体膜的信号肽,跨膜酶切后变为含 178 个氨基酸的成熟蛋白,它的分子量为 19.3 kD,等电点为 4.88.预测的成熟蛋白 IJ-ICF6 高级结构存在 2 个保守性的β折叠和 3 个跨类囊体膜的 a 螺旋区.根据海带配子体 LHCF6 成熟蛋白以及 GenBank 中 12 个同源蛋白质的氨基酸序列所构建的 Neighbor-joining 分子进化树,显示藻类在光捕获蛋白氨基酸序列水平上存在着蓝藻与红藻、杂色藻类、裸藻与绿藻等三个方向的演化途径,其中裸藻和绿藻与高等植物的亲缘关系更近.     

鳗弧菌溶血素基因的克隆及突变株的构建

PCR扩增出鳗弧菌M3溶血素基因的保守区序列,根据保守区序列设计引物,利用反向PCR和巢式PCR扩增出溶血素基因的部分序列,结合构建的鳗弧菌M3的基因组文库,克隆出溶血素基因的全长序列。根据基因推测的氨基酸编码序列与已发表的血清型为A的鳗弧菌PT84057有86％的相似性。用自杀质粒对鳗弧菌M3染色体上的溶血素基因进行了插入突变,将突变株对金鱼进行肌肉注射,结果发现,突变株的毒力没有发生显著的变化,证明所克隆的溶血素基因对鳗弧菌M3的毒力没有直接的贡献。     

拟南芥CRY1基因C末端导入甘蓝型油菜的遗传及表达

通过卡那霉素抗性鉴定,对甘蓝型油菜westar转基因后代T2代株系进行了研究.结合PCR检测及序列比对验证,对拟南芥CRY1基因C末端导入甘蓝型油菜后的遗传表现进行了分析,并利用GUS染色和花色素苷积累量的比较,对CRY1基因C末端在转基因油菜中的表达进行了研究.结果表明:转化的外源目的基因多数以嵌合形式,少数以单拷贝和嵌合的混合形式整合到转基因油菜的基因组中;目的基因能稳定地遗传给后代,株系间遗传传递率为62.5%;T2代的遗传行为少数呈现孟德尔遗传,多数呈现非孟德尔遗传现象;拟南芥CRY1基因能在转基因油菜中表达,但也出现了沉默现象.     

小麦与高冰草体细胞杂种耐盐新品系的盐胁迫应答cDNA差异表达分析

用银染DDRT-PCR技术分析了小麦济南177和小麦与高冰草体细胞杂种耐盐品系杂3号在盐胁迫前后基因的差异表达情况。并通过反向Northern杂交筛选,获得27个阳性片段。从中选出10个候选片段进行序列分析,这些序列信息表明,其表达与盐胁迫应答有一定关系。Northern杂交验证了差异片段wrsi-1在耐盐品系杂3号的根中受盐诱导,可能为胁迫早期应答基因。