利用海藻酸钠固定化米糠制备γ-氨基丁酸的研究

米糠是稻谷加工中的副产品,年产量很大但开发利用程度很低,其含有的谷氨酸脱磉酶(GAD)活力是植物中的佼佼者,该酶可以将谷氨酸转化为γ-氨基丁酸(GABA).本研究中将米糠固定化以达到固定化其中GAD的目的,得到最佳固定化条件:米糠6.0%、海藻酸钠溶液浓度2.5%、硬化时间1h、CaCl2溶液浓度10%,此时固定化米糠GAD酶活力回收率达到4894%.利用固定化米糠GAD制备的GABA制备液中GABA含量为3.06%,为植物法制备GABA提供又一种技术方法.     

利用米糠谷氨酸脱羧酶富集γ-氨基丁酸的新研究

通过一系列实验对传统的直接法与"提酶法"富集米糠γ-氨基丁酸(GABA)进行了比较,结果表明提酶法进一步提高了GABA的产率并且成本几乎没有增加."提酶法"即采用米糠谷氨酸脱羧酶(GAD)粗酶液外加谷氨酸钠来富集GABA,产率达到3 789.1 mg/100 g米糠,在此条件下可进一步采用固定化酶的方法固定化GAD粗酶液中的GAD,从而不仅很大程度上提高GAD的利用率,更方便了后期GABA的纯化工作,适合工业化生产要求.     

影响壳聚糖固定化谷氨酸脱羧酶的因素

以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂,制备固定化谷氨酸脱羧酶(GAD),并研究固定化反应中各个因素对固定化GAD活力的影响.结果表明,壳聚糖固定化谷氨酸脱羧酶的最佳条件为:戊二醛质量分数3%,处理时间16～24 h,处理温度40 ℃,酶吸附温度4 ℃、酶吸附时间24 h以上,给酶量为70.8 mg/g壳聚糖.     

米糠谷氨酸脱羧酶的分离纯化及酶学性质研究

利用(NH_4)_2SO,分级沉淀、DEAE-Sephrose FF离子交换色谱技术分离纯化米糠谷氨酸脱羧酶(GAD).米糠GAD纯化倍数为8.8,比活达到了30.1U/mg,酶活回收率为45.5%.同时对米糠GAD酶学性质进行了研究,结果表明.最适温度为40℃,耐热性较差;最适pH5.5,在pH5.5～9都可以保持较高酶活.米糠GAD对底物和辅酶PLP的K_m分别为28.45、1.13μmol/L.KI、Ag~+、SDS、乙酸对米糠GAD的活力有较大的抑制作用,而Ca~(2+)对米糠GAD的活性有较强的激活作用.     

米糠谷氨酸脱羧酶的酶学性质研究

研究了米糠谷氨酸脱羧酶(GAD)的酶学性质。结果表明:米糠GAD的最适温度为40℃,最适pH5.6,米糠GAD耐热性较差,60℃下保温0.5 h后,酶活下降至65%,保温1 h,酶活下降至48%,而70℃时酶就完全失活,而此酶在pH5.5～9都可以保持84%以上的酶活力。米糠GAD对底物和辅酶PLP的Km分别为0.028 45 mol/L和1.13μmol/L。KI、Ag~(2+)、SDS、乙酸对米糠GAD的活力有较大的抑制作用,而Ca~(2+)对米糠GAD的活性有较强的激活作用,提高了底物与米糠GAD的亲和力。     

利用米糠内源性蛋白酶和谷氨酸脱羧酶制备γ-氨基丁酸

研究了利用米糠内源性蛋白酶和谷氨酸脱羧酶富集γ-氨基丁酸(GABA)的工艺,通过正交实验得到最佳富集工艺条件是:温度44℃,料液比18∶,pH值5.2,时间6 h,反应中的限制性酶并非谷氨酸脱羧酶(GAD),而是米糠内源性蛋白酶。GA-BA的得率提高到242 mg/100 g米糠,经胶体磨作用,GABA的含量可达321 mg/100 g米糠。     

短乳杆菌GLB-127发酵制备γ-氨基丁酸

短乳杆菌(Lactobacillus brevis)为国家卫健委批准用于制备γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)的微生物菌种。利用短乳杆菌发酵表达谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase, GAD),将GAD全细胞用于催化L-谷氨酸生产GABA的研究具有重要意义。采用扫描电子显微镜与分子生物学手段鉴定了1株短乳杆菌GLB-127,构建了该乳酸菌的系统发育树。通过优化发酵及转化条件,包括培养转速、培养温度及全细胞催化酶加量等条件,初步确定了短乳杆菌制备GABA的工艺;然后又对发酵培养基进行了优化,使得GAD活力及GABA产量有了明显提升。经10 L发酵罐放大培养,GABA质量浓度达到了345.1 g/L,转化率为98.5%,GAD活力达315.9 U/g。该研究为新食品原料GABA的工业化生产奠定了基础。     

高活性果蔬谷氨酸脱羧酶的筛选及其酶学性质研究

比较芒果、荔枝、火龙果、香蕉、百香果、葡萄、猕猴桃、龙眼、黄皮果、西红柿、山竹、木瓜、苹果、菠萝等14种果蔬中的谷氨酸脱羧酶(GAD)的活力大小,并研究其中活性最高的GAD的部分酶学性质。采用高效液相法测定14种果蔬GAD粗酶液水解L-谷氨酸生成γ-氨基丁酸(GABA)能力的大小,确定各种果蔬GAD的活力。通过测定高活性GAD在不同温度、p H和金属离子存在条件下的酶活以及其最适反应条件下的动力学常数研究其酶学性质。在14种果蔬中,香蕉GAD的酶活最高,达到548.03±0.08 U/g;其最适温度为45℃,在25℃~40℃具有较高的耐热性,在40℃时,GAD剩余酶活仍有80%;最适p H 5.5,在p H 3.5~5.0范围内,具有较好的稳定性;对底物谷氨酸的Km值和Vmax分别为56.2 mmol/L和9.06μg/min;在浓度为2 mmol/L时,Mg2+、Na+、Cu2+、K+对香蕉GAD活性没有明显影响,Ca2+、Al3+、Mn2+、Zn2+对香蕉GAD活性稍有抑制,SDS和Ag+对香蕉GAD有明显的抑制作用。香蕉GAD的酶活较高,具备进一步开发应用的价值。     

米胚芽酶法制备γ-氨基丁酸的研究

研究了利用米胚芽中的谷氨酸脱羧酶转化谷氨酸制备γ-氨基丁酸(GABA)的方法。在最佳的酶反应条件下,米胚芽谷氨酸脱羧酶可以将添加的谷氨酸全部转化为GABA,转化率达到100%,米胚芽中的GABA为20.6g/100g。     

谷氨酸脱羧酶在枯草芽孢杆菌中的表达及应用

为了研究在枯草芽孢杆菌发酵过程中添加相对廉价的辅酶前体对谷氨酸脱羧酶(GAD)酶活力和催化效率的影响,将来源于Escherichia coli的谷氨酸脱羧酶基因gadB,通过构建重组质粒p HY300PLK-gadB,在枯草芽孢杆菌中重组表达,得到重组菌B. subtilis/pHY300PLKgadB。研究了分别在重组菌发酵过程中添加辅酶磷酸吡哆醛(PLP)、辅酶前体吡哆醛(PL)和吡哆醇(PN)对GAD酶活力的影响。当设置摇床转速200 r/min,发酵温度33℃,发酵培养基初始p H 7.0时,在发酵过程中分别添加PLP、PL、PN至终浓度0.5 mmol/L,诱导48 h后发酵液中总酶活分别达到25.40、28.14、15.55 U/mL,是对照总酶活的1.55、1.72、0.95倍。基于以上结果,进一步研究了发酵过程中PL的添加浓度对重组菌生长情况及GAD表达的影响。结果表明,发酵液中GAD总酶活随着PL浓度的增加而增加,当PL浓度为0.1 mmol/L时,总酶活最高达到28.28 U/mL。利用重组菌全细胞制备γ-氨基丁酸(GABA),结果表明,最适转化pH为5.0,最适转化温度为40℃,发酵过程中添加PL的重组菌(简称"GAD-PL")和发酵过程中不添加任何辅酶及辅酶前体的重组菌(简称"GAD-0")的最适加菌量(以酶活力单位计)分别是40 U/g(以谷氨酸计)和50 U/g(以谷氨酸计),当谷氨酸最终质量浓度达到400 g/L时,得到的GABA质量浓度分别为275.60 g/L和273.61 g/L。     

Purification of calmodulin from rice bran and activation of glutamate decarboxylase by Ca2+/calmodulin

BACKGROUND: γ‐Aminobutyric acid (GABA) is an important bioactive regulator, and its biosynthesis is primarily through the α‐decarboxylation of glutamate by glutamate decarboxylase (GAD). In plants, it was verified that the production of GABA is regulated, in part, via Ca²⁺/calmodulin (CaM). Our preliminary studies showed that rice bran GAD is probably also a Ca²⁺/CaM dependent enzyme; hence, in the current investigation, we purified calmodulin from rice bran, and studied the effect of the Ca²⁺/calmodulin complex on the activity of rice bran GAD in vitro. RESULTS: CaM was purified to homogeneity from the rice bran by a combined protocol involving TCA precipitation, heat treatment, and hydrophobic interaction chromatography, with the purification fold and recovery of 851.7 and 55.6%, respectively. This protein had similar amino acid composition as the CaMs from other higher plants. The rice bran GAD was found to be quite sensitive to the Ca²⁺/CaM complex at pH 7.0, and addition of exogenous EGTA or TFP efficiently inhibited the stimulatory effect of Ca²⁺/CaM complex. At a separate concentration of Ca²⁺ and CaM of 200 µmol L^?1 and 150 nmol L^?1, the rice bran GAD was significantly enhanced 3‐fold. Moreover, upon binding Ca²⁺, CaM underwent a conformational change that facilitated a more obvious emergency of phenylalanine and tyrosine residues. CONCLUSION: This investigation provided preliminary information for the development of a GABA‐based, cost‐effective rice bran GAD‐related functional food. Copyright © 2010 Society of Chemical Industry     

高酸值油脂酯化脱酸新工艺的研究

首先在2MPa充氮的反应釜内对高酸值米糠油进行预酯化处理,预酯化温度180℃、时间4h,在此条件下米糠油的FFA从20.5%降到13.8%;然后得出2MPa充氮条件下固定化脂肪酶酶法酯化脱酸反应的最优条件:酯化温度55℃,甘油添加量为0.31g,酯化时间8h,固定化脂肪酶添加量为油重5%,干燥剂添加量为油重1.5%,在此条件下米糠油的FFA由13.8%降至2.2%。     

乳酸菌发酵米糠产γ-氨基丁酸最适条件的研究

使用乳酸菌发酵米糠,以菌种、菌种添加量、发酵温度、发酵时间为单因素研究其对米糠发酵液中γ-氨基丁酸(GABA)含量的影响,在最适条件下,采用混料设计法,使用混合乳酸菌发酵米糠,以发酵液中GABA含量为指标,确定乳酸菌发酵米糠的最优条件为:在混合菌种嗜热链球菌S1添加量为1.55%,保加利亚乳杆菌L1添加量为1.45%,50℃下发酵米糠14h,发酵液中GABA含量最高,为287.975mg/100g。     

过热蒸汽处理对米糠营养性质和储藏稳定性的影响

采用120~160℃的过热蒸汽(SS)处理米糠1~5 min,以脂肪酶活性为指标,选取钝化脂肪酶效果好的米糠样品,以原米糠为对照,考察SS处理对米糠的营养性质(总酚含量、总抗氧化性、酚酸组成变化、α-生育酚含量、γ-谷维素含量)和储藏稳定性(脂肪酸值、过氧化值、羰基值)的影响。结果表明:经120,130,140,150,160℃的SS分别处理4,4,3,3 min和2 min后米糠脂肪酶活性不再发生显著变化,此时的米糠称为最佳钝酶点米糠,其脂肪酶活性分别降至30.99%~13.41%。与原米糠相比,最佳钝酶点米糠的总酚含量、总抗氧化性、总酚酸含量显著提高,且主要贡献为阿魏酸和对羟基苯甲酸的显著增加;α-生育酚和γ-谷维素含量无显著降低。SS处理显著提高了米糠的稳定性,在第25周时,最佳钝酶点米糠的脂肪酸值、过氧化值、羰基值分别只有BR的36.0%~21.9%、50.0%~44.3%、30.3%~22.1%,有效延长了米糠储藏期。综合考虑米糠营养性质和储藏稳定性,在130℃,4 min处理条件下获得的米糠最佳。     

Purification and biochemical characterisation of a novel glutamate decarboxylase from rice bran

BACKGROUND: Glutamate decarboxylase (GAD) is a useful enzyme whose main function is to catalyse the irreversible α‐decarboxylation of L ‐glutamate to produce γ‐aminobutyric acid. The cheap and abundant rice‐processing by‐product rice bran contains a high amount of GAD, the purification and characterisation of which have not yet been reported. In this study, research on rice bran GAD was initiated. RESULTS: Rice bran GAD was purified to homogeneity via a combined purification protocol of ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography and two gel filtrations, with a purification fold of 128.6 and an activity recovery of 21.3%. The enzyme was active at pH 5.5 and 40 °C and retained 80% of its original activity in the pH range 5–9 and the temperature range 30–50 °C. GAD activity was significantly enhanced in the presence of Ca²⁺ but strongly inhibited by Ag⁺, Hg²⁺, sodium dodecyl sulfate and CH₃COOH. Kinetic determination of the apparent K_m for L ‐glutamate and pyridoxal 5′‐phosphate gave values of 27.4 mmol L^?1 and 1.16 µmol L^?1 respectively. CONCLUSION: Considering that rice bran is cheap and commercially available and that rice bran GAD is relatively stable, the development of cost‐effective rice bran GAD‐related functional foods would seem to be feasible. Copyright © 2010 Society of Chemical Industry     

米糠中产γ-氨基丁酸细菌分离及其接种发酵研究

利用薄层层析初步筛选出米糠中产γ-氨基丁酸（GABA）能力较强的菌株,对其16S rDNA序列进行分析,确定菌株种类;用氨基酸自动分析仪进一步筛选出高产GABA菌株;将高产GABA菌株接种到米糠进行发酵试验。结果表明,陈米糠更有利于分离到高产GABA菌株;筛选到产量较高的菌株16S rDNA序列分别与屎肠球菌（Enterococcus faecium）、棉子肠球菌（Enterococcus raffinosus）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）和宋内志贺杆菌（Shigella sonnei）相似性最高;接种单菌种发酵不能明显提高米糠中GABA含量,但混合接种地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）DY和乳酸菌L-44A可以使其含量达到184.6 mg/100 g（干质量）;利用蛋白酶处理米糠后接种乳酸菌L-44A可以使米糠中GABA含量达到245.8 mg/100 g（干质量）。     

发芽糙米与稻谷的谷氨酸脱羧酶活力及γ-氨基丁酸含量比较

比较了糙米与稻谷发芽期间及培养结束后的静置过程中谷氨酸脱羧酶(GAD)活力、γ-氨基丁酸(GABA)及谷氨酸(Glu)含量变化情况。结果表明,糙米和稻谷在(32±1)℃条件下,以1.2 L/min的通气量,用含有0.1%L-谷氨酸、0.1%抗坏血酸的培养液浸渍发芽,生长速率和呼吸速率均以糙米为快。培养结束时,发芽糙米中GABA含量和Glu含量分别比发芽稻谷增加64.05%和14.68%,空气中放置8 h后发芽糙米中GABA含量比发芽结束时增加了24.32%,整个发芽和静置期间发芽糙米中GAD活力始终高于发芽稻谷。     

原料米对广东客家黄酒发酵及产γ-氨基丁酸的影响

该文研究不同原料米(糯米、粳米、籼米)对客家黄酒发酵过程中总糖、总酸、氨基酸态氮、γ-氨基丁酸(GABA)含量及谷氨酸脱羧酶(GAD酶)活性的影响。结果表明,在总糖、总酸、氨基酸态氮指标方面,糯米、粳米、籼米都适合酿制客家黄酒,但糯米黄酒、粳米黄酒总糖、总酸和氨基酸态氮含量较高;发酵过程中,GABA含量糯米黄酒最高,粳米黄酒次之,籼米黄酒最低;贮藏一个月后,糯米黄酒GABA含量达到260.45 mg/L,分别为粳米黄酒、籼米黄酒的1.13、1.44倍。糯米、粳米黄酒的GAD酶活性较大且两者接近,而籼米GAD酶活性较小,与糯米、粳米相差较大。综上所述,对比三种原料米,糯米最适合发酵客家黄酒及产GABA,粳米次之,籼米较不利。     

Gamma-aminobutyric acid and glutamic acid contents,and the GAD activity in germinated brown rice (Oryza sativa L.): Effect of rice cultivars

The γ-aminobutyric acid (GABA) and glutamic acid (Glu) contents, and the glutamate decarboxylase (GAD) activity in brown rice (BR) and germinated BR (GBR) of the 5 Thai rice cultivars KDML105, PT1, CN1, SP1, and PL2 were investigated. BR was soaked at 35°C for 12 h and then germinated for 24 h to produce GBR. Amounts of GABA and Glu, and the GAD activity in samples were determined. The GABA content and GAD activity in GBR samples of all cultivars were increased 7–50× and 10–100× over levels in BR. The GABA content in BR had no effect on GABA accumulation in GBR. There was no trend in changes in the Glu content for different cultivars after soaking and germination. Variation in the GABA amount in GBR was due to both the GAD activity and the amount of Glu. These two parameters affected accumulation of GABA in all cultivars.