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XJT-9503高温中性蛋白酶基因Gp1的克隆、表达及序列分析 总被引:1,自引:0,他引:1
试验根据地衣芽孢杆菌XJT9503的高温中性蛋白酶酶蛋白所测定的N-端及部分肽段氨基酸序列及质谱分析结果设计了PCR引物,用PCR方法从地衣芽孢杆菌XJT9503中扩增了高温中性蛋白酶基因Gp1,对所获得的基因进行序列分析测定,并与蛋白酶的氨基酸序列分析对比。GP1基因全序列共1129bp,包括整个阅读框,共编码376个氨基酸。将扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体pET-28a中,构建成重组分泌型表达载体pGp1。并在大肠杆菌宿主BL21中得到表达。SDS-PAGE分析显示产物的分子量为27.0×103,同核酸序列测定所推导的值相符。同时,对地衣芽孢杆菌XJT9503中性蛋白酶基因序列进行了测定和比较分析,发现与地衣芽孢杆菌6816丝氨酸蛋白酶和地衣芽孢杆菌1411T角蛋白水解酶基因的同源性为97%。 相似文献
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本文介绍了杆菌属中蛋白酶基因的结构及其在工业、科学研究中的广泛应用。杆菌属中的蛋白酶基因具有典型的“pre┐pro┐成熟酶前体”编码特征。其中pre┐序列编码信号肽,pro┐序列编码一段为蛋白酶形成具有生物活性的合适构象所需的肽链。pre┐与pro┐序列都在蛋白酶前体从细胞中分泌出来后被切去。具有相同性质的蛋白酶即使来源于不同菌种,在基因结构上仍具有很高的同源性;而性质不同的蛋白酶,即使来自同一菌种,它们在氨基酸组成,在pre┐、pro┐序列上都存在着很大差异。克隆的蛋白酶基因可用以构建具有蛋白酶高表达活性的基因工程菌,也可被用来研究蛋白酶的结构与性能的相互关系,还可被用于构建具有特殊功能的克隆载体。 相似文献
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碱性蛋白酶是一类重要的工业酶制剂。为进一步提高碱性蛋白酶在高温碱性条件下的活力,增强其工业应用价值,本文从地衣芽胞杆菌CCTCC M2018539中首先通过PCR扩增获得碱性蛋白酶编码基因aprE539并克隆入表达载体pND-113中,在枯草芽胞杆菌WB600中实现碱性蛋白酶AprE539的表达;重组酶AprE539经硫酸铵沉降(30%~70%)、透析、DEAE阴离子交换和超滤获得纯酶,并以SDS-PAGE电泳测定AprE539的分子量大小。结果表明,AprE539的分子量大小为30 kDa。进一步对其酶学性质研究表明:AprE539的最适作用pH为11.0,最适作用温度为65~70℃;在pH6.0~12.0范围内具有较好的稳定性;在60℃保温1 h后酶活剩余70%;Cu2+、Mn2+、Ca2+和Mg2+对酶活有明显促进作用。AprE539在氨基酸序列上仅有2个氨基酸残基与碱性蛋白酶2709存在差异,但其酶学特征差异明显,为后续进一步探究其酶学性质差异性奠定基础。 相似文献
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以蛋白酶高产菌株B.subtilis ML为供体菌,提取其染色体DNA,经限制性内切酶BamHI完全酶切后,插入枯草杆菌载体pNQ122的相同酶切位点,连接后转化中性碱性蛋白酶基因双缺陷型菌株B.subtilisDB104。从含有氯霉素的酪蛋白平板上获得了20个具有蛋白酶活性的克隆。 相似文献
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高温碱性蛋白酶菌株的选育及酶性质研究 总被引:7,自引:0,他引:7
从西藏当雄温泉附近土样中分离到1株高温碱性蛋白酶产生菌株LH 2 2 ,其生长温度范围为4 0~6 5℃,生长pH范围5 0~11 0 ,最适生长pH6 0~8 0 ,经初步鉴定为芽孢杆菌。以LH 2 2为出发菌株,用NTG与紫外线复合诱变的方法,筛选到1株碱性蛋白酶活性显著高于出发菌的正突变株CH 17,其产酶水平比出发株提高4 6 1 2 % ,达到2 380U/mL。该酶的最适作用温度为6 0℃,最适pH值为9 5 ,具有良好的热稳定性,并与去污剂有很好的相容性,酶活性受PMSF的强烈抑制。 相似文献
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综述了乳蛋白基因多态性和检测方法以及其对乳品加工及人类营养影响的研究进展。酪蛋白的基因型较多,除了基因差异外,还有磷酸化水平与糖基化程度等其他影响因素。乳清蛋白部分,β-乳球蛋白(-βLG)的基因型较多,而α-乳白蛋白(-αLA)的基因型较少。乳蛋白基因多态性可从蛋白水平和基因水平两方面进行检测。乳蛋白基因型会显著影响乳的加工特性,包括热稳定性、凝乳性能及干酪的产率和品质。乳蛋白基因与人类营养息息相关,随着分子技术的发展,基因多态性的应用会更广,需进一步的研究来更好地描述多态性与乳品加工及营养之间的关系。 相似文献
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从自制的酒酿利用酪蛋白培养基分离纯化到了一株产凝乳酶的微小毛霉菌株(ZZMZ-19),从ZZM-19菌株的cDNA文库筛选到了两个凝乳酶基因chl和ch2并实现了凝乳酶基因ch1和ch2在枯草芽孢杆菌菌株(ZZMZ-01)中的的克隆与表达。chl和曲2阳性克隆菌株在酪蛋白培养基r1]发酵30h左右的时间凝乳酶酶活达到最人,分别为48.27SU/mL和41.02SU/mL,相比出发菌株发酵时间缩短了15h。用交联葡聚糖凝胶柱G100分离纯化其发酵卜清液后,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测得CHII和cHIII分子草分别为32ku和30ku。 相似文献
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为获得高效表达的产漆酶工程菌,将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的漆酶(cotA)基因在大肠杆菌中表达。用PCR的方法从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QM11基因组中扩增cotA基因,连接载体pET22b构建成表达载体pET22b-cotA,转化至E.coli BL21(DE3)进行诱导表达,最终通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况。克隆得到的cotA基因含有1542个核苷酸,由513个氨基酸组成,预测相对分子量为58 ku,理论等电点为5.91,无信号肽,二级结构以β-折叠和无规卷曲为主,其中β-折叠占26.71%,无规卷曲占52.05%,与NCBI已公布的Bacillus subtilis漆酶cotA基因(Gen Bank:GQ184294.1)碱基序列有12个碱基的差异,其编码的氨基酸序列有4个发生了改变。通过SDS-PAGE检测,目标蛋白相对分子质量约为54 ku,与预测相对分子量基本相符。 相似文献
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以细菌型豆豉工业发酵菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ3-2为材料,根据NCBI中菌株B. subtilis 168的胺氧化酶(AMO)基因序列设计同源引物,克隆获得菌株B. subtilis BJ3-2的胺氧化酶基因YobN序列。测序结果显示,YobN基因开放阅读框(ORF)长为1 437 bp,编码478个氨基酸,分子质量为53.79 ku,与菌株B. subtilis 168同源性达98%。目的基因克隆至原核表达载体,获得重组菌pET28a-YobN/BL21,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,浓度为1.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)22 ℃诱导5 h,表达量最高达1.30 mg/mL。该研究为AMO活性的研究奠定了基础,对豆类发酵食品中生物胺的控制具有重要意义。 相似文献
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以一株高产中性蛋白酶的Bacillus amyloliquefaciens BS5582基因组DNA为模板,PCR扩增获得结构基因npr,构建质粒pPIC9K-npr,并转化到表达菌株毕赤酵母GS115中得到重组菌。经甲醇诱导发酵,测定中性蛋白酶活性。结果表明,目的基因大小为1566bp,在宿主中得到了成功表达,重组菌酶活力为9.17×103U/g,酶学性质分析表明,重组中性蛋白酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为7,在40℃中保温1h后仍能保持85%左右活性,在pH4~9的范围内稳定性较好,Ca2+、Mg2+、Mn2+离子对该酶有激活作用。 相似文献
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在摇瓶发酵条件下,利用响应面法优化枯草芽孢杆菌BS3菌株产蛋白酶的培养基,在单因素实验的基础上,采用Plackett-Burman实验设计(PB)对影响枯草芽孢杆菌BS3产蛋白酶的培养基组分进行了筛选,确定主要影响因子为玉米浆、氯化铵和玉米淀粉.然后通过最陡爬坡实验、中心组合实验设计和响应面分析法,确定了主要的影响因子及其浓度.优化后的培养基组成为:玉米淀粉1.586g/100g,玉米浆3.170/100g,氯化铵1.998/100g,其他组分维持低添加量,在此培养基条件下,活菌数为12.640×109cfu/g,蛋白酶活为162.309U/g. 相似文献
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从合浦珠母贝肠道中分离鉴定到酶菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HS18,将枯草芽孢杆菌HS18的发酵液,经过硫酸铵盐析、DEAE-Sephadex A-50柱层析、Sephadex G-100柱层析3步纯化后得到了单一的酶蛋白,回收率为11.4%;经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得酶蛋白分子量约为31ku;该蛋白酶最适反应温度为50℃,最适pH10.0;K+及Na+对酶有明显激活作用;丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂(PMSF)能强烈抑制酶活性。表明所纯化到的蛋白酶为丝氨酸碱性蛋白酶。 相似文献