副溶血弧菌多克隆抗体的制备及其特性分析

确定了副溶血弧菌多克隆抗体的制备方法:用体积分数0.05%甲醛于30℃灭活副溶血弧菌4 h制备抗原,并将此抗原分多次,以不同剂量免疫新西兰大白兔获得特异性多克隆抗体,以山羊抗兔IgG-HRP作为酶标二抗,通过间接ELISA法测定其多克隆抗体的效价、敏感性和特异性。结果表明:在免疫的第5周产生大量高效价抗体,效价最高可达1.6×105;此多克隆抗体对副溶血弧菌检测灵敏度为1×105CFU/mL;交叉反应和阻断试验结果显示,此多克隆抗体具有很强的特异性。     

弧菌外膜蛋白Ompk基因序列分析及其多克隆抗体的制备

弧菌外膜蛋白（outer membrane protein,OMP）OmpK不仅可激发机体的体液免疫和细胞免疫,而且可在不同血清型菌株之间产生免疫交叉反应。本研究利用克隆测序和查找GenBank获得20 株弧菌的Ompk基因序列并构建Ompk系统进化树,对比分析20 株弧菌Ompk基因序列;利用原核表达系统表达野生株Vibrio parahaemolyticus B的OmpK,纯化OmpK后制备兔多克隆抗体;采用酶联免疫吸附分析法和蛋白质印迹法（Western-blotting）分别检测抗体效价和特异性。系统进化树和基因序列比对结果显示Ompk基因在弧菌中高度保守,核苷酸序列相似性在77%以上;原核表达系统成功表达了弧菌OmpK,蛋白经纯化后成功制备的兔多抗效价达1∶16 000;Western-blotting实验证实抗体具有很好的特异性;OmpK多克隆抗体在弧菌中普遍存在免疫交叉性。因此,弧菌Ompk基因序列分析及其抗体研制,不仅为弧菌快速免疫学检测提供可能性,也为以OmpK为靶点的水产疫苗研制奠定了基础。     

双酚A的酶联免疫检测方法的建立

将双酚A(BPA)半抗原与牛血清白蛋白(BSA)共价偶联后,制备兔抗双酚A多克隆抗体,建立了双酚A间接竞争酶联免疫(icELISA)检测方法,并对其进行了方法学评价。结果表明:最佳的抗体稀释度为1∶1600,双酚A竞争标准曲线在0.3～100μg·mL-1之间具有良好的线性关系,最低检测浓度为0.001μg·mL-1,重现性实验变异系数均小于10%。交叉反应实验中,与双酚酸和双酚B的交叉反应率分别为20.0%和10.0%;与双酚E和4-枯基苯酚的交叉反应率均在5%以下。水样的添加回收实验,回收率范围为92.5%～107.7%。     

副溶血弧菌的磁珠捕获及检测

建立结合免疫磁珠和PCR快速检测副溶血性弧菌的新方法.本研究选用副溶血弧菌作为抗原免疫日本大耳兔制备了多克隆抗体,用ELISA法检测抗体效价.利用辛酸硫酸铵沉淀结合逆向吸附对多抗血清进行纯化,经SDS-PAGE和斑点杂交检测验证纯化后抗体的特异性.将纯化后的抗体偶联于羧基化修饰的纳米磁珠表面,用来进行菌体的捕获.结果表明,抗体的效价达到106,纯化获得只与副溶血弧菌发生反应的高纯度抗体.制备的免疫磁珠捕获率在55％ ～70％之间,且稳定性较好,盐离子浓度(3.5％ NaCl、4.5％ NaCl)对捕获率的影响不大,在pH5～9之间,磁珠捕获差异也较小.在对纯培养物的检测实验中,本方法最低检测限为102cfu/mL;而在鱼肉糜样本中的检测限为103cfu/mL,且样品中高浓度杂菌的存在不影响检测灵敏度.免疫磁珠结合PCR用于副溶血性弧菌的检测具有很高的灵敏度和特异性,具有广阔的前景.     

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)鞭毛蛋白FlaA的重组表达与多克隆抗体制备

副溶血性弧菌是广泛存在于水产品中的革兰阴性致病菌。鞭毛蛋白FlaA是副溶血性弧菌的一种特异性的蛋白质,以该蛋白质作为抗原所制备到的抗体可以作为检测副溶血性弧菌的探针。该研究通过分子生物学方法构建了重组FlaA的表达载体pET28a-flaA,并采用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导实现FlaA的大量表达。该重组蛋白以可溶性形式存在,经Ni-NTA亲和柱纯化后对家兔进行免疫,得到浓度为24.32 mg/mL、效价为1∶125,000的抗FlaA抗体。通过间接ELISA实验,测得该抗体与副溶血性弧菌反应的灵敏度为1.0×104CFU/mL,且该抗体与5种其他常见致病菌无明显交叉反应。     

基于近红外免疫层析技术的食源性副溶血弧菌快速检测方法研究

建立一种应用近红外荧光免疫层析技术快速检测副溶血弧菌的方法。采用近红外荧光标记副溶血弧菌单克隆抗体,将副溶血弧菌多克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体喷涂于硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线,研制检测副溶血弧菌的近红外免疫层析试纸条及配套标准物质。研究表明,所建立的近红外免疫法对检测副溶血弧菌具有良好的特异性和较高的灵敏度,最低检测限为1.2×10~2 CFU/mL,与沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌无交叉反应。通过效果评价试验发现,与传统检测方法相比较,所建立的近红外荧光法检测时间时间最短,检测限与RT-PCR法接近。近红外荧光法在45 min内即可完成检测,可用于食品中副溶血弧菌的高效检测,为食品安全监管提供可靠的技术支持。     

副溶血性弧菌单克隆抗体的制备及特性鉴定

为制备特异性强的副溶血性弧菌的单克隆抗体,解决单克隆抗体对免疫学检测产品研发的制约,以副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ATCC 17802标准菌株免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、间接酶联免疫吸附测定法筛选,获得稳定分泌抗副溶血性弧菌(ATCC 17802)菌株的单克隆杂交瘤细胞株3F7D7E8C4,通过体内诱生腹水大量制备抗体,用亚类试剂盒测定抗体亚类为Ig G1;采用辛酸硫酸铵沉淀法以及亲和层析柱对腹水进行纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳实验鉴定单克隆抗体的纯度。制备得到腹水抗体效价为1∶16 000,纯化后抗体效价为1∶8 000,抗体敏感性IC_(50)达到10~6 CFU/m L。纯化后的抗体与12株副溶血性弧菌均能特异性结合,与其他9种非副溶血性弧菌的食源性致病菌均无交叉反应。     

鼠伤寒沙门氏菌特异性多克隆抗体的纯化方法

以福尔马林灭活的鼠伤寒沙门氏菌免疫雌性日本大耳兔,制备抗沙门氏菌的多克隆抗体。分别通过辛酸-硫酸铵沉淀法、磁珠偶联抗原吸附法纯化抗体,所制备的抗体效价为3.2×105,纯度较高,但交叉反应现象较严重。本实验以杂菌抗原反向吸附法纯化抗体,有效消除了抗体与杂菌的交叉反应,初步建立了一种高特异性多克隆抗体的纯化方法。     

副溶血性弧菌多克隆抗体制备及应用

以热灭活副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP ATCC17802)免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,用间接酶联免疫吸附法测定抗血清效价,纯化后的多克隆抗体效价为512000。该抗体与5株副溶血性弧菌均能特异性结合,但与其他12株非副溶血性弧菌无交叉反应。在此基础之上建立了间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA),并优化了抗原抗体浓度、二抗浓度、封闭液等条件。结果表明,该法的线性范围为5×10^4~107CFU/m L,线性回归方程为y=0.21x-0.74(R2=0.99),IC50为106CFU/m L,最低检出限为1.7×10^4CFU/m L,板内变异系数为2.61%~4.15%,板间变异系数为4.71%~8.74%。用建立的ic-ELISA检测市场中鱼、贝类养殖水和实验室用水中的VP,实验结果与国标检测方法的结果一致。该方法快速便捷,灵敏度高,准确性好,为进一步研究VP的快速检测奠定了基础。     

检测阪崎肠杆菌间接ELISA方法的建立

建立阪崎肠杆菌(Enterobacter Sakazakii,ES)特异性抗体间接ELISA检测方法,以期作为融合后杂交瘤细胞株的筛选体系。应用灭活的阪崎肠杆菌菌体为抗原,筛选最佳反应条件,建立检测该病原菌的酶联免疫吸附检测方法。通过对ELISA反应条件优化,确定菌体抗原包被的最适工作浓度为2×105mL-1,4℃包被过夜;5%脱脂奶粉进行封闭;血清最佳稀释比为1∶2 000;酶标抗体最适稀释度为1∶1 000倍;最后确定37℃显色10 min,检测灵敏度达到103mL-1。该方法的建立为阪崎肠杆菌单克隆抗体制备过程中阳性杂交瘤细胞株的筛选提供有效手段和奠定实验基础。