单增李斯特氏菌快速检测方法的建立

建立单增李斯特氏菌的快速检测方法.针对单增李斯特氏菌virR基因序列设计特异性引物及探针,建立等温扩增法,并利用免疫金标试纸条对结果进行检测.用10株单增李斯特氏菌、6株李斯特菌属菌株及其他食源性致病菌24株进行特异性试验;通过定量DNA、纯菌液计数进行灵敏度验证.结果表明建立方法具有较好的特异性;增菌液检测灵敏度为102 cfu/test,DNA检测灵敏度为10°pg/test.建立的单增李斯特氏菌的快速检测方法特异性较好、灵敏度高,适合于单增李斯特氏菌快速筛选检测.     

单增李斯特菌与志贺氏菌多重PCR检测技术的建立

目的:为食品、卫生行业提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的单增李斯特菌(Listeria Monocyto-genes)与志贺氏菌(Shigella)多重PCR检测方法.方法:根据单增李斯特茵转录调节子基因prfA、志贺氏茵侵袭性质粒抗原H基因ipaH筛选出引物;优化多重PCR的引物浓度、退火温度及Mg2+等条件,分析单-PCR及多重PCR的特异性、灵敏度;结合24 h增茵培养.确定多重PCR检测人工污染脱脂灭茵乳的检出限.结果:多重PCR扩增出了预计的PCR产物,即单增李斯特茵(274bp)和志贺氏茵(421bp).该方法的灵敏度:78 pg单增李斯特茵基因组DNA、7.5pg志贺氏茼基因组DNA.多重PCR检测人工污染脱脂灭菌乳,单增李斯特茵与志贺氏茵的灵敏度分别为2cfu/25mL和1.6cfu/25mL.结论:该方法在食品、卫生行业具有很好的应用和开发前景.     

发酵面团中抗单增李斯特氏菌乳酸菌的筛选及鉴定

以单增李斯特氏菌为指示菌,通过牛津杯双层平板法对从发酵面团样品中分离出的54株乳酸菌进行抑菌试验。在排除有机酸,过氧化氢的干扰后,其中1株乳酸菌的发酵上清液对单增李斯特氏菌仍然表现出明显的抑制作用。其抑菌活性在酸性条件下较强,在加入蛋白酶K和胰蛋白酶以及100℃以上热处理时明显下降甚至消失,说明其代谢产物中含有蛋白质类抑菌物质,是一类细菌素。经Trcine-SDS-PAGE试验分析该细菌素分子质量为25 kDa;经过生理生化试验及16S rDNA序列同源性分析,该菌被鉴定为Lactobacillus curvatus。     

云南淡水鱼中单增李斯特氏菌污染状况及耐药性分析

目的 了解云南淡水鱼中单增李斯特氏菌污染状况及耐药情况.方法 从云南省昆明市、曲靖市、大理州、红河州4个淡水鱼主产区采集淡水鱼样品110件,参照GB 4789.30—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》分离鉴定单增李斯特氏菌,并进一步开展16S rRNA序列鉴定和同源性分析,对鉴定菌株...     

单增李斯特氏菌SureTect实时PCR检测方法的 比较研究

目的 评估食品中单增李斯特氏菌SureTect实时PCR检测方法的性能。     

ERIC-PCR技术对单增李斯特菌的溯源分析

以质控菌株ATCC 19115为对照,采用ERIC-PCR方法对从三个市场猪肉样品分离到的17株单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)进行了基因分型,探讨了单增李斯特菌基因型与区域分布及流行性的关联性.结果表明,17株单增李斯特菌菌株可分为六个主要基因类群,其中Ⅳ型菌株最多,为主要污染类群,而这些菌株来自于市场三;市场一和市场二分离到的菌株主要分别为Ⅰ型和Ⅳ型.因此,ERIC-PCR方法适用于对单增李斯特菌的溯源分析和流行病学调查,具有简单、方便、快捷、准确的特点.     

ERIC-PCR技术对单增李斯特菌的溯源分析

以质控菌株ATCC 19115为对照,采用ERIC-PCR方法对从三个市场猪肉样品分离到的17株单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）进行了基因分型,探讨了单增李斯特菌基因型与区域分布及流行性的关联性。结果表明,17株单增李斯特菌菌株可分为六个主要基因类群,其中Ⅳ型菌株最多,为主要污染类群,而这些菌株来自于市场三;市场一和市场二分离到的菌株主要分别为Ⅰ型和Ⅳ型。因此,ERIC-PCR方法适用于对单增李斯特菌的溯源分析和流行病学调查,具有简单、方便、快捷、准确的特点。      

MPCR方法检测食品中的伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特氏菌

为建立一种同时检测食品中的伤寒沙门氏菌(ST)、金黄色葡萄球菌(SA)和单增李斯特氏菌(LM)的快速检测方法,分别针对伤寒沙门氏菌的鞭毛抗原基因H1-d、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、单增李斯特氏菌溶血素O上的hlyA基因设计引物,进行特异性和灵敏性实验,结果表明3条特异性扩增片段分别为458bp、279bp和243bp,经DNA测序证明其序列与模板被扩增片段一致。该方法操作简便、快速,具有良好的灵敏性和特异性。     

单增李斯特菌免疫磁珠的制备研究

目的:制备可高效、特异地分离单增李斯特菌的免疫磁珠。探讨羧基修饰磁珠与多克隆抗体的不同偶联条件和免疫磁珠捕获单增李斯特菌的能力。方法:以单增李斯特菌作为抗原,免疫新西兰兔,获得兔源多克隆抗体,鉴定其与单增李斯特菌体的结合能力;选择6种不同的偶联缓冲溶液,设置了6个主要偶联时间和6组偶联温度,通过比较磁珠与抗体偶联后上清中剩余的抗体量来确定最佳偶联条件。结果:制备的多克隆抗体效价为1.3×105,该抗体与单增李斯特菌体有较好的结合,抗体与1mg羧基修饰磁珠在pH6.0的0.01mol/L一水吗啉乙磺酸缓冲溶液(MES)中,37℃偶联2h,偶联抗体的量为160μg;制得的免疫磁珠的捕获率可达77.0%。结论:获得羧基磁珠与抗体偶联的最佳条件,该免疫磁珠用于食品中单增李斯特菌的检测,与常规的平皿增菌培养显色法比较,检测时间至少缩短20h。     

单增李斯特菌增殖的影响因素研究

本实验研究在冷却肉中单增李斯特菌的增殖以及产溶血素情况,考查与冷却肉相关的各种理化和生物因素对单增李斯特菌增殖的影响。研究表明,单增李斯特菌在所选择的温度范围内,温度越低,增殖受到的影响越大,同时低于0.93的水分活度下或pH低于5.0,单增李斯特菌失去增殖的能力。另外,初始菌数和气体环境也对单增李斯特菌产生了影响,冷却肉中存在的腐败菌和20%以上浓度的CO2都抑制了单增李斯特菌的增殖。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在 李斯特菌检测和鉴定中的应用

为建立食品中各种李斯特菌的快速检测和鉴定方法,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对单增李斯特菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌和格氏李斯特菌5种李斯特菌进行检测,并与传统的生化鉴定方法(VITEK 2)和聚合酶链式反应(PCR)方法检测结果进行比较;用不同培养基和不同培养时间培养的单增李斯特菌对该方法进行检测,还对60份人工感染5种李斯特菌的食品样品分别进行MALDI-TOF-MS、PCR以及传统生化方法的检测和鉴定。结果表明：MALDI-TOF-MS能够快速、可靠地区分上述5种李斯特菌,而且具有很好的稳定性和重复性,在检测时间、重复性和准确性方面的总体表现优于传统生化鉴定方法。MALDI-TOF-MS技术适用于对李斯特菌等食源性病原菌进行高通量、低成本的快速鉴定。     

基于MALDI-TOF MS技术对李斯特氏菌属两种细菌的快速鉴定

为提高基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)在李斯特氏菌属鉴定中的分辨能力,建立快速准确鉴定单增和英诺克李斯特氏菌的质谱学方法。通过采集79株单增和57株英诺克李斯特氏菌的指纹图谱,利用Clin Pro tools软件对数据进行统计学分析,建立数学判别模型并验证其准确性。峰统计结果显示,两组数据峰强度差异显著的特征峰有16个,推测出单增李斯特氏菌生物标志物6个,英诺克李斯特氏菌10个,发现在单增李斯特氏菌中质量峰3985/7970 u和3972/7942 u是独立且连锁存在。基于遗传算法的判别模型交叉验证率和检测识别能力最强,分别为99.44%和100.00%,经验证准确率达到96%以上,可实现对单增和英诺克李斯特氏菌的快速准确鉴定。同时,利用Bruker Biotyper软件将以上菌株建库形成了实验室内部李斯特氏菌谱库,对8株未测李斯特氏菌进行搜库鉴定,匹配分数均高于商品化数据库,提升了MALDI-TOF MS对李斯特菌属的自动鉴定能力。     

MALDI-TOF-MS鉴定2008年辽宁省食源性疾病监测系统检出的沙门菌的初步研究

目的应用MALDI-TOF-MS技术对2008年辽宁省食源性疾病监测检出的24株沙门菌和2株沙门菌标准菌株进行鉴定,并对其中4种血清型的16株沙门菌进行种水平的鉴定。通过MALDI-TOF-MS的相关性分析,研究MALDI-TOF-MS与血清分型结果的相关性及MALDI-TOF-MS对实验的沙门菌的分型能力。方法考察并确定既适合菌株生长又适宜MALDI-TOF-MS分析的沙门菌培养基后,应用MALDI-TOF-MS的相关软件对沙门菌进行数据采集和图谱比对,所得鉴定结果与血清分型结果进行比较。对属于4个种的4株沙门菌的蛋白峰信息进行比较分析。通过生化鉴定及MALDI-TOF-MS的聚类分析及主成分分析讨论4株肠炎沙门菌同源关系。结果 MALDI-TOF-MS技术分别在属和种的水平上准确鉴定了沙门菌株,并且在种的鉴定水平上与血清分型结果具有极大相关性。MALDI-TOF-MS区分了属于4个种的4株沙门菌的蛋白峰之间的微小差异。而且,对相同血清型的4株肠炎沙门菌的聚类分析及主成分分析显示出其同源程度的差异。结论 MALDI-TOF-MS技术在属水平上鉴定沙门菌具有很高的准确性,在种水平上的鉴定也有着很好的应用前景。...     

Listeria monocytogenes: Strain Heterogeneity,Methods, and Challenges of Subtyping

Listeria monocytogenes is a food‐borne bacterial pathogen that is associated with 20% to 30% case fatality rate. L. monocytogenes is a genetically heterogeneous species, with a small fraction of strains (serotypes 1/2a, 1/2b, 4b) implicated in human listeriosis. Monitoring and source tracking of L. monocytogenes involve the use of subtyping methods, with the performance of genetic‐based methods found to be superior to phenotypic‐based ones. Various methods have been used to subtype L. monocytogenes isolates, with the pulsed‐field gel electrophoresis (PFGE) being the gold standard. Although PFGE has had a massive impact on food safety through the establishment of the PulseNet, there is no doubt that whole genome sequence (WGS) typing is accurate, has a discriminatory power superior to any known method, and allows genome‐wide differences between strains to be quantified through the comparison of nucleotide sequences. This review focuses on the different techniques that have been used to type L. monocytogenes strains, their performance challenges, and the tremendous impact WGS typing could have on the food safety landscape.     

单核细胞增生李斯特菌菌株分型与其致病潜力基因相关性研究进展

单核细胞增生李斯特菌是一种常见的食源性致病菌,该菌分型繁多。不同分型的单核细胞增生李斯特菌致病潜力不同,这与菌株所携带的抗性基因和毒力基因不同有关。本文综述了不同分型单核细胞增生李斯特菌与抗性基因和毒力基因的关系,结果发现与该菌抗性相关的基因,如热抗性、耐冷性、酸抗性、耐高渗、耐干燥、耐金属和杀菌剂及参与应激蛋白表达调控的基因较多,它们与分型之间的关系暂无明确相关性结论,但也发现应激生存岛（stress survival island,SSI）-1仅存在于谱系I和谱系II部分菌株中,SSI-2目前仅被发现在ST121菌株中携带。从功能毒力基因和李斯特菌毒力基因岛（Listeria pathogenicity islands,LIPI）两方面分述了毒力基因,LIPI-3和LIPI-4主要存在于谱系I菌株中。此外,ST5、ST8、ST9和ST121菌株的inlA基因中出现提前终止密码子,使得菌株的毒力降低。研究不同分型单核细胞增生李斯特菌致病潜力基因的差异有助于单核细胞增生李斯特菌的预警预测、防控,并为不同分型菌株致病机制的深入研究提供参考。     

Short communication: Identification of subclinical cow mastitis pathogens in milk by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry

Subclinical mastitis is a common and easily disseminated disease in dairy herds. Its routine diagnosis via bacterial culture and biochemical identification is a difficult and time-consuming process. In this work, we show that matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) allows bacterial identification with high confidence and speed (1 d for bacterial growth and analysis). With the use of MALDI-TOF MS, 33 bacterial culture isolates from milk of different dairy cows from several farms were analyzed, and the results were compared with those obtained by classical biochemical methods. This proof-of-concept case demonstrates the reliability of MALDI-TOF MS bacterial identification, and its increased selectivity as illustrated by the additional identification of coagulase-negative Staphylococcus species and mixed bacterial cultures. Matrix-assisted laser desorption-ionization mass spectrometry considerably accelerates the diagnosis of mastitis pathogens, especially in cases of subclinical mastitis. More immediate and efficient animal management strategies for mastitis and milk quality control in the dairy industry can therefore be applied.     

Identification of bovine-associated coagulase-negative staphylococci by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry using a direct transfer protocol

This study evaluated matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-ToF MS) for the identification of bovine-associated coagulase-negative staphylococci (CNS), a heterogeneous group of different species. Additionally, we aimed to expand the MALDI-ToF MS database with new reference spectra as required to fill the gaps within the existing commercial spectral library. A total of 258 isolates of CNS were used in the study, covering 16 different CNS species. The majority of the isolates were previously identified by rpoB gene sequencing (n = 219), and the remainder were identified by sequencing of 16S rRNA, hsp60, or both rpoB and hsp60. The genotypic identification was considered the gold standard identification. All MALDI-ToF MS identifications were carried out using the direct transfer method. In a preliminary evaluation (n = 32 isolates; 2 of each species) with the existing commercial database, MALDI-ToF MS showed a typeability of 81% (26/32) and an accuracy of 96% (25/26). In the main evaluation (n = 226 isolates), MALDI-ToF MS with the existing commercial Biotyper (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA) database achieved a typeability of 92.0% (208/226) and an accuracy of 99.5% (207/208). Based on the assessment of the existing commercial database and prior knowledge of the species, a total of 13 custom reference spectra, covering 8 species, were created and added to the commercial database. Using the custom reference spectra expanded database, isolates were identified by MALDI-ToF MS with 100% typeability and 100% accuracy. Whereas the MALDI-ToF MS manufacturer's cutoff for species-level identification is 2.000, the reduction of the species level cutpoint to ≥1.700 improved the species-level identification rates (from 64 to 92% for the existing commercial database) when classifying CNS isolates. Overall, MALDI-ToF MS using the direct transfer method was shown to be a highly reliable tool for the identification of bovine-associated CNS.     

Bovine mastitis bacteria resolved by MALDI-TOF mass spectrometry

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is a fast and reliable method to identify the most common pathogenic bacteria in humans and animals. The goals of this study were to amend a commercial database with additional species, evaluate the amended database for identification of bacterial genera and species causing bovine mastitis, and describe the plethora of species involved. In total, 500 udder pathogenic isolates were subjected to MALDI-TOF MS using bacterial or fungal colony material; 93.5% could be identified to the species level, and 6.5% were identified only to the genus level. Isolates identified to the genus level required further identification to the species level by conventional methods or 16S rDNA sequencing. Mass spectra from verified species were used to expand the MALDI-TOF MS database to improve future identification ability. A total of 24 genera and 61 species were identified in this study. Identified isolates were mainly staphylococci, streptococci, Enterobacteriaceae, and coryneforme bacteria. In conclusion, MALDI-TOF MS is a powerful, rapid, and reliable technique to identify the most common microorganisms causing bovine mastitis, and the database can be continuously expanded and improved with additional species.     

基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的 溶藻弧菌鉴定研究

目的建立快速检测和鉴定溶藻弧菌的方法,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOF-MS)和SARAMIS分析软件,对来自水产品中的溶藻弧菌进行了检测和鉴定。方法将从样品中分离得到的可疑菌落于37℃纯化培养24、48、72 h后,分别用微生物API生化鉴定系统和MALDI-TOF-MS方法进行分析鉴定,并对MALDI-TOF-MS鉴定方法的稳定性、准确性和重复性进行初步探讨。结果不同的培养时间,24、48和72 h对MALDI-TOF-MS检测的蛋白质谱图影响较小,鉴定值分别为94.10%,93.90%,92.70%;同时用微生物API-20E生化鉴定试剂盒进行辅助分析鉴定,培养24 h后,鉴定值为97.7%,T值为0.47,但培养72 h后,鉴定值为52.4%,T值为0.15。同一样品点样2次,得到的6张图谱显示出峰位置基本一致。用标准菌株大肠埃希菌ATCC 8739和溶藻弧菌ATCC 17749纯化培养24 h后,鉴定值分别为99.90%和97.60%。结论与传统的生化鉴定方法相比,MALDI-TOF-MS和SARAMIS软件分析方法具有较高的稳定性、重复性和准确性,可以快速、准确地鉴定溶藻弧菌,可用于水产品中溶藻弧菌的高通量、低成本的快速检测鉴定。     

进出境食品中单核增生李斯特菌的血清分型与脉冲场凝胶电泳分型分析

目的研究进出境食品中的单核增生李斯特菌(LMO)的血清分型与脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型的特性及其关系。方法采用标准方法对39株分离的LMO进行PFGE分型,分别用ApaI和Asc I酶切,电泳图谱进行聚类分析,以上菌株同时进行血清分型检测。结果 39株LMO分成6个血清型;经ApaI酶切后,分成29种带型,相似度在57.4%～100%;Asc I酶切后,分成34种带型,相似度在48.6%～100%。讨论 AscI酶切的PFGE分离效果优于ApaI酶切,与血清分型的一致性低于ApaI酶切;PFGE分型效果优于血清分型。