甲型肝炎病毒抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的：建立快速检测甲型肝炎病毒(HAV)抗原含量的双抗体夹心ELISA方法,并进行验证及初步应用。方法：用HAV多克隆抗体和HAV单克隆抗体酶结合物建立双抗体夹心ELISA法,检测HAV抗原含量。对建立的方法进行特异性、线性(标准曲线)、准确度、精密度、灵敏度验证,对不同生产厂家生产的HAV疫苗(人二倍体细胞)与不同工艺阶段的HAV疫苗(人二倍体细胞)中间产品进行适用性检测。结果：HAV多克隆抗体的最佳包被浓度为8μg/mL,酶标抗体最佳稀释度为1∶10 000,封闭剂为1%BSA。该方法与其他人用疫苗和辅料成分无交叉反应;线性范围0.546 875～17.500 000 IU/mL,R²> 0.99;准确度验证回收率80.1%～123.7%;精密度验证变异系数<8.3%。检测不同厂家的HAV疫苗(人二倍体细胞)和不同工艺阶段的HAV疫苗(人二倍体细胞)中间产品呈良好的剂量依赖效应。结论：建立了适用于HAV抗原含量检测的双抗体夹心ELISA方法,符合定量检测的需求,可用于不同毒株生产的HAV疫苗(人二倍体细胞)检测,可用于甲肝病毒收获液、浓缩液、纯化液...     

淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体多重荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用

目的建立淋病奈瑟菌(Neisseria agonorrhoeae,NG)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)、细小脲原体(Ureaplasma parvum,UP)多重荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)检测方法。方法选择NG保守基因porA、解脲支原体(Ureaplasma urealytieum,UU)保守基因ure及CT保守基因trp作为目标检测基因,设计引物及TaqMan探针,制备重组质粒标准品,绘制标准曲线,建立多重FQ-PCR检测方法,并验证其敏感性、特异性及重复性。用建立的方法对203份泌尿生殖道感染NG、CT、UP的临床样本进行同步检测,并与单重FQ-PCR法、常规PCR法及基因测序结果进行比较。结果重组质粒标准品经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;建立的标准曲线起始DNA拷贝数与Ct值之间的线性关系良好,相关系数为0.998~1.000;该方法检测NG、CT和UP的灵敏度均可达102copies/ml,检测范围可达109~102copies/ml,相关系数分别为1.000、0.999和0.995;不与生殖道其他菌群如阴道霉菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、人型支原体、单纯疱疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型及人乳头瘤病毒(16/18型)发生交叉反应;检测的203份样本中,多重FQ-PCR检测NG、CT、UP的阳性检出率分别为34.48%、30.54%、18.71%,与单重FQ-PCR法、基因测序法比较,差异无统计学意义(P0.05),3种方法阳性检出率均高于常规PCR法;与基因测序法相比,多重FQPCR法灵敏度为100%,3种病原体检测特异性均高于98.50%。结论已成功建立NG、CT、UP多重FQ-PCR检测方法,该法检测时间短,特异性强,灵敏性高,适合于临床快速诊断。     

乙型流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及验证

目的 建立乙型（B/Yamagata和B/Victotria系）流感病毒荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法,并进行验证及初步应用。方法 根据乙型流感病毒（B/Yamagata和B/Victotria系）血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸（neuraminidase,NA）遗传差异,构建含B/Yamagata系流感病毒HA(120 bp)、NA(122 bp)及含B/Victotria系流感病毒HA(147 bp)和NA(141 bp)目的序列的重组标准品质粒,并设计特异性引物和探针,绘制标准曲线,建立qRTPCR检测方法。验证该方法的灵敏度、特异性和重复性,并利用建立的方法检测不同年份乙型流感病毒疫苗株和临床分离的季节性乙型流感病毒。结果 B/Yamagata系病毒（HA和NA序列）获得的标准曲线方程为Y=-3.370 1 X+41.061,R2=0.996,B/Victotria病毒（HA和NA序列）获得的标准曲线方程为Y=-3.318 85 X+40.952,R2=0.996。该方法具有高度特异性,能够区分乙型流感病毒,对甲型流感病毒（A/H1N1和A...     

TaqMan MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA方法的适用性验证及应用

目的对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行适用性验证及应用。方法对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行特异性、灵敏度、精密性、准确性验证,并应用该方法检测3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液、纯化液和原液中Vero细胞残余DNA含量,计算Vero细胞残余DNA去除率。结果 Taq Man MGB探针实时定量PCR能够特异性扩增Vero细胞基因组DNA长串连重复序列;DNA浓度在10-1~10-6 ng/μl范围内标准曲线线性良好,相关系数为0.996,扩增效率为93.54%;检测灵敏度为10-6 ng/μl,高于斑点杂交法;检测高(10-2 ng/μl)、中(10-4 ng/μl)、低(10-6 ng/μl)浓度阳性对照DNA模板的试验内变异系数(CV)为0.145%~3.110%,试验间CV为0.624%~2.359%;检测不同浓度阳性对照DNA的回收率在101.5%~109.4%之间,均在定量方法可接受的回收率范围内;在斑点杂交检测灵敏度范围内,同一样品采用Taq Man MGB探针实时定量PCR法与斑点杂交法半定量检测的结果吻合。3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液纯化后可有效去除Vero细胞残余DNA,总去除率约为100%。结论 Taq Man探针实时定量PCR法特异性、精密性、准确性良好,灵敏度高,可作为斑点杂交法的替代方法,用于实验室内部的质量控制。     

应用核酸探针检测甲型肝炎疫苗的滴度

应用甲型肝炎病毒(HAV)cDNA 片段作为探针,分别以同位素、异羟基洋地黄毒苷配基和生物素标记该探针,对甲肝疫苗病毒培养过程中不同时期、不同接种量的病毒浓度进行了滴定,并以 ELISA 作对照。结果表明,各种标记探针检测的灵敏度均高于 ELISA。而不同标记的探针检测的结果无显著差异。     

牛副流感病毒3型TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立检测牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)的Taq Man荧光定量PCR方法。方法根据GenBank中公布的BPIV3序列,选取P基因上保守区域设计特异性引物及TaqMan-MGB探针。优化反应体系,建立实时荧光定量PCR方法,并对方法的特异性、重复性和敏感性进行验证。结果标准曲线在104~108copies/μl范围内具有良好的线性关系,R~2达到0.999,斜率为-3.203,扩增效率为105.2%。利用该方法对BPIV3a及BPIV3c进行检测,结果为阳性,对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(infectioils bovine rhinotraeheitis virus,IBRV)进行检测,结果呈阴性。3个浓度质粒标准品,重复3次检测,CV均小于1.5%。建立的方法对质粒的最小检出量为1.0×10~2 copies/μl。结论建立了能够检测BPIV3a及BPIV3c的TaqMan-MGB探针实时定量PCR方法,该方法特异性较强,重复性及敏感性良好,为早期诊断及定量分析提供了更快速、稳定、可靠的方法。     

乙型肝炎病毒基因组C区启动子突变位点新型检测方法的建立、验证及初步应用

目的利用错配扩增和荧光PCR技术,建立一种针对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因组C区启动子(basal core promoter,BCP)1762/1764突变位点的新型检测方法,并对该方法进行验证及临床评价。方法根据NCBI登录的HBV A-H型基因序列(以GenBank号为AB033556.1的C基因型作为标准参考序列)合成野生型和突变型标准品序列,测序后连接至pMD-18T载体上,构建质粒标准品,设计引物、探针及合适的突变检测体系,确定检测的线性范围;对建立的方法进行灵敏度、重复性、特异性、稳定性验证;分别用本实验建立的ARMS-PCR法和基因Sanger测序法(金标准)检测132份慢性乙型肝炎患者血液样本的基因位点是否发生突变,并分析ARMS-PCR法的灵敏度和特异度。结果 ARMS-PCR法能检测1×102~1×109 copies/ml的野生型和突变型质粒;野生型和突变型样本检测的Ct差值(ΔCt)在7以上,且能检出最低达1%突变含量的混合质粒和样本;该方法灵敏度较高,重复性、特异性、稳定性良好;其检测132份慢性乙型肝炎患者血液样本1762/1764位点突变阳性率为41.7%,明显高于Sanger测序法检测结果(P0.05)。结论建立的ARMS-PCR法能很好地用于评估乙肝患者患肝癌的风险,且较Sanger测序法检测精度更高,更适合于临床推广。     

甲型肝炎病毒的RT-PCR-ELISA检测法

目的建立一种半定量检测甲型肝炎病毒(HAV)RNA的RT-PCR-ELISA方法。方法将5′端磷酸化的特异性探针包被在氨基化的微孔板上,以生物素标记的探针为引物,提取样品中的HAVRNA,反转录并扩增HAVDNA,变性后的PCR产物与探针杂交,并被捕获在微孔板上,再与酶标亲和素结合,显色测定。结果所建立的方法结果判断客观,灵敏度比凝胶电泳法高一个数量级,分析不同时间检测结果,差异无显著意义。结论已建立了半定量检测HAVRNA的RT-PCR-ELISA方法。     

森林脑炎病毒滴度检测蚀斑法的建立及验证

目的 建立原代地鼠肾(primary hamster kidney,PHK)细胞适应的森林脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)株(简称PHKT株)感染性滴度检测的蚀斑法，并对建立的方法进行验证。方法 将主代鼠脑适应株TBEV感染原代地鼠肾PHK细胞，连续传12代。分别采用蚀斑法(将不同代次PHKT以不同稀释倍数感染单层BHK-21细胞，中性红染色，计算蚀斑数)和小鼠脑内攻毒滴定法(将不同代次PHKT以不同稀倍数经脑腔攻击小鼠，0.03 mL/只，连续观察14 d,Reed-Muench方法计算半数致死量)检测PHKT滴度，并对两种方法检测结果的相关性进行分析。对建立的检测TBEV滴度的蚀斑法进行专属性、重复性和中间精密度验证。结果 PHKT病毒蚀斑滴度最高达8.9 lgPFU/mL；蚀斑法与小鼠脑内攻毒滴定法检测结果相关性较好(r=0.92)；蚀斑法检测PHKT病毒感染性滴度专属性良好，重复性和中间精密度变异系数(CV)均<5%。结论 建立了检测PHKT感染性滴度的蚀斑法，可作为小鼠脑内攻毒滴定法的替代方法。     

水样中痕量铜的富集和测定的研究

铜离子与1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚(PAN)反应,生成疏水性的络合物,在助溶剂乙醇的作用下,被萃取到三氯甲烷相中,用分光光度法测定三氯甲烷相中的Cu2+-PAN,建立了析相富集-分光光度法测定水样中痕量铜的分析方法。对影响络合反应和相分离的各种条件进行了优化。在选择的实验条件下,铜的质量浓度在0.50～15μg/mL范围内与吸光度呈线性关系,相关系数为0.999 57,方法的检出限为0.089μg/mL,对铜浓度为5.0μg/mL的样品溶液进行7次平行测定,相对标准偏差为1.67%。该方法用于水样中铜的测定,回收率在95.6%～101.5%之间。     

高效液相色谱法同时测定食品中的5种添加剂

建立同时检测食品中β-胡萝卜素、安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠等5种添加剂的高效液相色谱（HPLC）分析方法。实验采用等浓度洗脱,以Shim-pack VP-ODS色谱柱,选用紫外检测器,以体积比V（0.02 mol/L乙酸铵）∶V（甲醇）=95∶5为流动相,吸收波长为237 nm,流速为1.0 mL/min对康师傅水蜜桃汁、美年达葡萄味汽水进行检测,一次进样在15 min内完成5种添加剂的测定。该方法的线性范围为0.01～0.1 mg/mL,线性相关系数范围为0.994 5～0.999 9,样品的加标回收率在95%～103%,相对标准偏差为2.01%～4.15%。该方法灵敏度高,重现性好,操作方便,检测快速,是检测食品添加剂的有效方法。     

ICP-AES法测定闪锌矿中微量元素

采用电感耦合等离子体发射光谱法同时测定了闪锌矿中的钙、铁、铜、铅等微量元素。在选定的最佳测定条件下测钙、铁、铜、铅的检出限分别为6.1、8.6、2.2、1.5 ng/mL,回收率为95.4%~108.0%,相对标准偏差为1.6%~3.4%。该法准确、快速、简便,应用于闪锌矿中微量元素的测定,结果满意。     

LC-MS法测定复方药物中苯磺酸氨氯地平和阿托伐他汀钙的含量

建立了液相色谱-质谱(LC-MS)法测定复方药物中苯磺酸氨氯地平(AML)和阿托伐他汀钙(ATO)的含量。选择C18柱为分离柱;柱温:25℃;流动相为0.1%甲酸水和乙腈溶液;流速1.0 m L/min;进样量20μL;三重四极杆质量分析器检测。结果表明:AML的线性范围为2.5~500.0μg/kg,R~2=0.999 8,定量限为0.125μg/kg,平均回收率分别为87.57%~95.73%,相对标准偏差为3.6%~9.1%;ATO的线性范围为0.5~500.0μg/kg,R~2=0.9997,定量限为0.05μg/kg,平均回收率分别为87.74%~98.27%,相对标准偏差为5.6%~8.7%。该方法灵敏度高,线性范围宽,检测限低,适用于复方药物中有效成分含量的测定。     

苯醚甲环唑在柑橘和土壤中的残留分析方法研究

建立了苯醚甲环唑在柑橘和土壤中的残留分析方法。样品经丙酮、乙酸乙酯或丙酮、石油醚提取,中性氧化铝柱净化,GC-ECD检测。方法在0.2～20.0μg/mL范围内有良好的线性关系,柑橘和土壤中苯醚甲环唑最低检测质量分数为0.001 mg/kg。样本中添加量为0.02～1.0 mg/kg时(n=5),平均回收率为72.90%～101.5%,相对标准偏差为1.36%～12.9%;方法的准确度和精密度均满足农药残留分析的要求。     

钌催化高碘酸钾氧化偶氮胂I动力学光度法测定痕量钌

在 H3 PO4、90± 0 .5°C水浴条件下 ,Ru( )催化高碘酸钾氧化偶氮胂 I的褪色反应基础上 ,提出了测定钌的新催化光度法。钌质量浓度在 0～ 0 .0 8μg/1 0 m L范围内符合比尔定律 ,检出限为3.47× 1 0 -4μg/m L。对 0 .0 5 μg/1 0 m L Ru( )测定的相对标准偏差为 1 .47% ( n=1 0 )。该催化反应是一级反应 ,表观活化能为 5 8.82 k J/mol。此法已用于了某些冶金产品和矿石中钌的测定 ,相对标准偏差为 1 .73%～ 2 .0 3% ,标准加入回收率为 97%～ 1 0 5 %。     

泡沫塑料吸附原子吸收光谱法测定矿石中金的含量

建立了泡沫塑料吸附-原子吸收光谱法联用测定矿石中微量金含量的新方法。研究了泡沫塑料形状、处理方法、吸附酸度、吸附时间及王水浓度等实验条件对金吸附及测定灵敏度的影响。在优化实验条件下测定金含量,金的浓度为0~80μg/mL范围内线性关系良好,所得工作曲线回归方程为y=0.0058x＋0.0052,相关系数r为0.9991,回收率在97%～102%,相对标准偏差（RSD）在3.24%～7.87%（n=11）范围内。方法用于矿石中微量金含量的测定,获得满意结果。     

基体改进剂在《GB 5009.12-2010食品中铅的测定》中的应用

探讨了硝酸镍对石墨炉吸收法测定食品中铅的基体改进作用。实验表明:在200mg/L硝酸镍的基体改进剂存在下,仪器信号灵敏度提高3倍;在最佳测试条件下,铅特征质量为4.1pg/0.0044A,检出限为0.001mg/kg;12.5ng/mL铅标准溶液11次测定的RSD为1.2%;10μg/mL的Ca、Cd、Cr、Cu、Fe、K、Zn、Mg、Mn和Sn对12.5ng/mL铅标准溶液的测定无干扰作用。该法克服了国家标准《GB 5009.12-2010食品中铅的测定》第一法石墨炉原子吸收光谱法信号灵敏度低、稳定性差、重复性低等缺点。     

全自动阴离子表面活性剂测定仪与手工测定比较

为了使亚甲蓝分光光度法测定水体中阴离子表面活性剂的试验更节省劳动力并提高萃取效率,可采用全自动阴离子表面活性剂测定仪替代手工测定。该测定仪按照GB/T 7494—1987中的试验方法及步骤,测定饮用水、地表水、生活污水和工业废水中低浓度亚甲蓝活性物质时,其线性相关系数、准确度、稳定性、样品平行性以及加标回收率的测定结果均优于手工测定。测定仪的检出限为0.015μg/mL,符合国家标准要求的0.05μg/mL。手工测定的标准曲线相关系数平均值为0.999 4,而全自动仪器的相关系数平均值为0.999 8。在准确度测定中,质控液理论值为0.802 5μg/mL,全自动仪器测定结果为0.802 0μg/mL,手工测定结果为0.776 0μg/mL,全自动仪器更接近真值。由于水样浓度本身低于方法检出限浓度,水样稳定性的手工测定和全自动仪器的检测结果相差无几,但全自动仪器的检测结果波动更小,稳定性更好;全自动仪器的回收率在97.87%～100.71%,而手工测定的加标回收率在92.20%～95.04%。     

毛细管色谱法同时测定异戊二烯中环戊二烯、甲基吡咯烷酮和二甲基甲酰胺

用毛细色谱法建立异戊二烯中各组分定性分析方法及环戊二烯,N-甲基吡咯烷酮,N,N-二甲基甲酰胺的测定方法。气相色谱条件:采用OV-1701毛细管气相色谱柱,50 m×0.32 mm×0.53μm。程序升温60℃保持5 min后,以10℃/min升至190℃,保持3 min。氮气(纯度99.999%)为载气,柱前压为69 kPa。分流进样,分流比1∶100。进样口温度200℃,FID检测器,检测器温度为200℃。结果表明,异戊二烯中各组分均达到良好分离。环戊二烯、N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺的线性范围均为0.5~1 200μg/mL;回收率分别为96.0%~98.5%,95.0%~102%,96.0%~99.6%;检出限均达到0.5μg/mL。其方法简单、快捷且灵敏度高,可以用于异戊二烯中杂质含量的控制。