人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体在CHO K1细胞中的表达及鉴定

目的 CHO K1细胞中表达人源化抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)单克隆抗体,并进行鉴定。方法采用电穿孔转染法将含编码人源化抗VEGF单克隆抗体轻、重链全基因的真核表达质粒DGV-K11转染至CHO K1细胞,经L-蛋氨酸亚砜(methionine sulfoxide,MSX)加压筛选和有限稀释克隆筛选,获得分泌表达人源化抗VEGF单克隆抗体的K11细胞株。利用生物反应器培养K11细胞,采用MabSelect SuRe、DEAE Sepharose FF和Eshmuno S凝胶色谱纯化培养液,以贝伐珠单抗(Bevacizumab)作为阳性对照,分析人源化抗VEGF单克隆抗体的纯度、电荷异质性、相对分子质量、N-末端序列、等电点及生物学活性。结果人源化抗VEGF单克隆抗体还原和非还原型CE-SDS分析图谱峰形及电荷异质性与阳性对照相似,轻、重链N-末端氨基酸序列一致;人源化抗VEGF单克隆抗体及阳性对照的SEC-HPLC单体纯度分别为97.46%和97.08%,完整相对分子质量分别为149 201.76和149 201.81,主峰等电点分别为7.31和7.32,生物学活性分别为0.993×10~4和0.960×10~4 U/mg。结论于CHO细胞中成功表达了人源化抗VEGF单克隆抗体,与贝伐珠单抗(Bevacizumab)具有相似的纯度、电荷异质性及生物学活性,本实验为CHO细胞大规模表达人源化抗VEGF单克隆抗体奠定了基础。     

抗血管内皮生长因子鼠-人嵌合抗体真核表达载体的构建及在CHO DG44细胞中的表达

目的构建抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)鼠-人嵌合抗体真核表达载体,并在CHO DG44细胞中进行表达及初步鉴定。方法分别采用鸡胚尿囊膜试验和小鼠肿瘤抑制试验检测鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5对VEGF促血管生成和肿瘤增生的抑制作用;采用RT-PCR法从鼠源性抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞2E5中扩增抗VEGF抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),利用IMGT数据库进行序列比对分析,筛选出功能性基因;采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)将VH基因与人Ig G1重链恒定区基因连接,VL基因与人Ig G1轻链恒定区基因连接,分别构建嵌合抗体重链基因和轻链基因,将嵌合的重链基因连入p Opti VECTM-TOPO誖TA载体,轻链基因连入pc DNATM3.3-TOPO誖TA载体,构建重链表达质粒p Opti VEC-H和轻链表达质粒pc DNA 3.3-L;采用脂质体法将重链和轻链表达质粒共转染CHO DG44细胞,经缺陷性培养基筛选和抗性标记筛选、MTX加压后,利用有限稀释法挑选单细胞株,ELISA法检测嵌合抗体的表达量;取批次培养的嵌合抗体细胞株上清液,经Mab Select Sure亲和纯化和陶瓷羟基磷灰石纯化后,对纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE和高效液相色谱分析,并测定N-端序列、分子量和解离常数。结果鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5能抑制VEGF的促血管生成和肿瘤生长。嵌合表达载体p Opti VEC-H和pc DNA 3.3-L经菌落PCR及测序证实构建正确。经缺陷性培养基筛选、抗性标记筛选、MTX加压及单克隆筛选后,嵌合抗体的表达量可达68.5μg/ml。纯化的嵌合抗体纯度达99%以上;N-端测序结果与预期重、轻链N-端氨基酸序列一致;质谱法测定分子量为149 290;解离常数为2×10-9 mol/L。结论成功构建了抗VEGF鼠-人嵌合抗体轻、重链表达载体,在CHO DG44细胞中表达了嵌合抗体,经层析纯化的嵌合抗体纯度较高,与VEGF抗原具有较强的亲和力,为后续进行抗VEGF单克隆抗体的人源化改造奠定了基础。     

~(60)Co γ-射线辐照新生牛血清对细胞培养的影响

目的研究新生牛血清(newborn calf serum,NBCS)经~(60)Coγ-射线辐照后对细胞培养的影响。方法用20 k Gy~(60)Coγ-射线辐照NBCS后,培养Vero和CHO-K1细胞,通过连续传代培养及绘制低密度生长曲线,比较辐照前后的促细胞生长效果。结果 Vero细胞的传代培养结果与未辐照前接近,生长曲线峰值略低于未辐照组,辐照前后细胞的最大增殖密度为73.38×10~4和65.33×10~4个/ml(P0.05),倍增时间为24.38和25.33 h(P0.05);CHOK1细胞传代培养无未辐照组致密,生长曲线较未辐照组平缓,辐照前后细胞的最大增殖密度为80.03×10~4和79.3×10~4个/ml(P0.05),倍增时间为19.73和23.62 h(P0.05)。结论 NBCS经20 k Gy ~(60)Coγ-射线辐照后,对Vero细胞影响不明显,使CHO-K1细胞生长速度变慢。     

抗人肿瘤坏死因子-α人源单克隆抗体在CHO细胞中的表达及鉴定

目的在CHO细胞中表达抗人肿瘤坏死因子(human tumor necrosis factor-alpha,h TNF-α)人源单克隆抗体,并对抗体纯化后进行鉴定。方法将含有编码抗h TNF-α人源单克隆抗体轻、重链可变区及恒定区基因的真核表达质粒p HL,利用脂质体Lipofectamine TM 2000转染CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选和单克隆筛选,获得分泌表达抗h TNF-α人源单克隆抗体的CHO细胞株。应用Mab Select Su Re和Capto adhere两步层析纯化抗体后,分析抗体的纯度、N-末端序列、结合动力学平衡常数及中和活性。结果经两步层析后,抗h TNF-α人源单抗经SDS-PAGE分析,可见纯度较好的抗体重链、轻链和完整抗体条带,SEC-HPLC纯度为98.79%;抗体的轻、重链N-末端氨基酸序列与预期一致,其结合动力学平衡常数(KD)为1.34×10-10 M,能拮抗TNF-α对L929细胞的杀伤作用,对TNF-α细胞毒的中和率达90%左右。结论在CHO细胞中成功表达了具有较好中和活性的抗h TNF-α人源单克隆抗体。     

人α_1型干扰素工程菌表达质粒拷贝数的研究

本文采用荧光测试技术对人a_1型干扰素工程菌在高密度发酵条件下表达质粒拷贝数进行了测定,并对其表达量和菌体生长进行了研究,结果表明在高密度发酵条件下工程菌的表达质粒拷贝数十分稳定,约为每细胞100拷贝左右,为摇瓶发酵的1.6倍。本文还研究了发酵过程中菌体密度和表达量的关系。     

高表达抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体细胞株的建立及其表达产物的分析

目的建立高表达抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体的工程细胞株。方法将构建的抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体基因真核表达载体转染CHO细胞,并采用DHFR/MTX基因扩增策略,经反复加压和克隆筛选,提高抗体的表达量。用ELISA、Westernblot和体外中和试验分析比较抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体与鼠亲本单抗的特性。结果获得的表达抗人TNF-α嵌合抗体的转染细胞系2F5,在静止培养4d后工程抗体的表达量约80mg/L。所表达的工程抗体优于鼠亲本单抗F7/2,并具有良好的特异性和中和活性,其相对亲和力约为2.1×10-10mol/L。结论已成功建立了高表达的嵌合抗体工程细胞株,其抗体具有潜在的临床应用前景。     

产青蒿二烯的人工酵母细胞的构建及发酵优化

为了异源合成抗疟疾药物青蒿素重要前体青蒿二烯, 以酿酒酵母作为底盘细胞, 利用基因工程手段构建功能人工酵母细胞。为提高基因拷贝数, 并增加重组菌株基因型的稳定性, 选择酵母基因组中多拷贝位点Delta为整合点, 实现酿酒酵母内源基因tHMGR和ERG20的过表达以及外源基因ADS的整合。过表达tHMGR和ERG20基因增加了酵母体内半萜类物质共同前体法尼基焦磷酸FPP的积累量;而导入外源基因ADS, 实现了酵母生产青蒿二烯。经过摇瓶发酵优化实验, 人工酵母菌株青蒿二烯产量为225.3 mg·L^-1;为了进一步提高青蒿二烯产量, 经过发酵过程优化和补料策略, 人工酵母菌株在5 L发酵罐中青蒿二烯产量达到1.05 g·L^-1。     

复合型阴离子交换层析填料Capto adhere纯化工艺的优化

目的优化复合型阴离子交换层析填料Capto adhere的纯化工艺,并进行验证。方法利用中心复合设计(central composite design,CCD)法对影响复合阴离子交换层析的3个因素(上样液pH值、上样液电导率值、上样量)进行优化,拟合出响应曲面,找出最优参数范围。将优化的Capto adhere层析工艺与亲和层析相结合,纯化CHO细胞表达的IgG1单抗培养液,验证工艺参数的稳定性。结果优化的Capto adhere层析工艺为:上样液pH值6.9,上样液电导值率6.3 mS/cm,上样量300 mg/ml gel;CHO细胞表达的IgG1单抗培养液先经蛋白A亲和层析柱初步纯化,再经优化的Capto adhere层析工艺进一步纯化后,样品纯度达98.9%,蛋白A残留量为0.000 52%,宿主细胞蛋白残留量为0.015%,与预测值比较,结果偏差小于10%,且均符合质控标准,两步层析总收率达86.7%。结论优化了复合型阴离子交换层析填料Capto adhere的纯化工艺,利用亲和层析与Capto adhere复合阴离子交换层析两步法纯化单抗是有效、简便、可行的。     

不同信号肽对GLP-1-Fc融合蛋白表达的影响

目的探讨不同信号肽对GLP-1-Fc融合蛋白表达的影响。方法对含7种不同信号肽(A～G)GLP-1-Fc融合蛋白的谷氨酰胺缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHOK1SV GS-KO)进行流加培养,评估含各信号肽细胞的比生长率,并检测融合蛋白的表达量、反相纯度、电荷异质性组成、降解比例及糖型。同时对含最优信号肽GLP-1-Fc融合蛋白的细胞进行高密度发酵,并检测生物活性。结果含信号肽E的重组细胞比生长率略低,相应的融合蛋白表达量也略低,但反相纯度较高,酸性异构体比例较低,主峰含量最高,且降解比例较低,糖型G0F/G0F含量最高,整体质量较好,因此确定其为最佳信号肽。含信号肽E的细胞在1 L和7 L细胞反应器中发酵,RP-HPLC纯度分别高达89. 66%和89. 76%,生物活性与市售参比制剂一致。结论信号肽的筛选和优化需综合评估信号肽对融合蛋白表达量和产物关键质量属性的影响。     

PLCε调节肾细胞癌血管生成的作用机制

目的探讨血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在PLCε-NF-κB信号通路中影响肿瘤血管生成的作用机制。方法将PLCε-shRNA表达质粒pGenesil-PLCε转染人肾透明细胞癌786-0细胞株,沉默磷脂酶Cε(Phos-pholipase C epsilon,PLCε)基因的表达,采用RT-PCR及Western blot检测转染细胞中PLCε、NF-κB和VEGF基因mRNA及蛋白水平表达的变化;应用NF-κB特异性抑制剂BAY11-7082处理细胞后,采用MTT法检测BAY11-7082对786-0细胞增殖的抑制作用,RT-PCR和Westernblot检测VEGF基因mRNA和蛋白水平表达的变化。结果重组质粒pGenesil-PLCε可明显抑制PLCε基因mRNA和蛋白水平的表达,抑制率分别为71.43%和50.01%,并明显下调NF-κB和VEGF基因mRNA和蛋白水平的表达;BAY11-7082可明显抑制786-0细胞增殖,且呈剂量和时间依赖性;应用BAY11-7082后,VEGF基因mRNA和蛋白的表达均被明显抑制。结论 PLCε可能通过抑制NF-κB基因的表达,从而抑制NF-κB依赖性基因VEGF的表达,进而影响肾细胞癌血管生成。     

治疗性肝癌单克隆抗体HAb18生产用种子细胞的质量控制

目的进行治疗性肝癌单克隆抗体HAb18生产用种子细胞的质量控制研究。方法用细胞计数、ELISA和FCM分别检测细胞生长、抗体生成速度和抗原结合活性;冻存细胞复苏后及体外传代3个月,检测抗体分泌稳定性和克隆阳性率;进行无菌检查、细胞核型和同工酶谱分析,了解细胞遗传稳定性、外源因子污染和细胞间交叉污染情况。结果肝癌单克隆抗体HAb18生产用种子细胞的细胞生长和抗体生成速度分别为0.047~0.052/h和1.1~1.4 pg/cell.h,与靶细胞FHCC98结合的阳性率达99%,平均荧光强度在200以上。冻存细胞复苏后及体外连续传代3个月后,其特异性抗体生成速度维持在1.0 pg/cell.h以上,培养上清抗体效价仍为1∶1 000。不同批次的生成细胞核型均符合杂交瘤细胞特征,外源因子检查阴性,无细胞间交叉污染。结论HAb18生产用种子细胞的细胞生长和抗体生成速率、抗体稳定性和特异性均符合已建立的规模化放大培养的种子细胞质控标准。     

人α_1型基因工程干扰素单克隆抗体及亲和层析柱的研制

应用杂交瘤技术建立了稳定分泌抗rHu-IFN-α_1的单克隆抗体细胞系,体外连续传代8个月以上,在BALB/c鼠体内连续传代6个月以上,分泌抗体能力不变,特异性专一。11D_2单抗为IgG_2b,17D_9单抗为IgG_1。采用不同方法提纯抗体均得到90％纯度。11D_2单抗中和效价为1024,17D_9单抗为65534。制备亲和层析柱的最佳抗体浓度为5mg/ml,凝胶与抗体体积比为1:2,偶联率均达到95％～98％。11D_2单抗亲和层析柱提纯粗制rHu-IFN-α_1干扰素不易被洗脱,不适宜制备亲和层析柱。17D_9单抗亲和层析柱提纯粗制rHu-IFN-α_1结合的抗原容易被洗脱,适宜制备亲和层析柱。粗制rHu-IFN-α_1经17D_9单抗层析柱后,获得了电泳纯级制品,比原纯度增加15倍,平均收率93％,比活性平均值为6.5×10~6IU/mg。残余鼠IgG量符合规程要求。     

牛坏死杆菌43K OMP单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备牛坏死杆菌43KOMP单克隆抗体,并鉴定其生物学特性.方法 经IPTG诱导表达重组43KOMP,纯化后免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗43K OMP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗43K OMP单克隆抗体进行效价、亚类、免疫原性及特异性鉴定.结果 获得3株稳定表达抗43...     

抗黄曲霉毒素B1重链IgG2b亚型单克隆抗体的制备及应用

目的制备抗黄曲霉毒素B1(AFB1)的重链IgG2b亚型单克隆抗体,并建立黄曲霉毒素B1的间接竞争ELISA检测方法。方法采用AFB1-BSA偶联物为免疫抗原,AFB1-STI偶联物为检测抗原,利用间接竞争ELISA筛选分泌抗AFB1单抗的细胞株,并对抗体进行鉴定。结果筛选到1株能分泌特异性抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其染色体数目为(90±10)条;所分泌的单抗亚类重链为IgG2b,轻链为λ;间接ELISA检测该株杂交瘤细胞分泌上清效价在1∶12800～1∶25600,纯化腹水效价为1∶105～1∶106。传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;建立的间接竞争ELISA检测方法的最低检出限为0.001ng/ml,校正曲线的线性范围为0.005～5ng/ml,IC50为0.01ng/ml;与AFB1的结构类似物AFM1和化学结构有差异的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的交叉反应率分别为1.4%和<1%。结论所制备的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体具有高度特异性和稳定性,可应用于间接竞争ELISA检测方法。     

单克隆抗体制品中残余SP2/0细胞蛋白含量ELISA检测试剂盒的验证

目的对单克隆抗体制品中残余SP2/0细胞蛋白含量ELISA检测试剂盒进行验证。方法对Cygnus Technologies公司制备的SP2/0Host Cell Protein(sHCPs)ELISA试剂盒进行灵敏度、精密性验证及基质干扰试验和样品稀释回收试验,并采用该试剂盒对本公司制备的10批单抗制品原液及冻干品进行检测。结果标准蛋白含量的对数与相应的光吸收值的对数,在2～200ng/ml范围内呈线性关系;该试剂盒检测限可达0.6ng/ml,定量限可达2ng/ml,灵敏度符合要求;检测低、中、高3个浓度的SP2/0HCPs样品试验内及试验间变异系数分别为15.4%、3.0%、2.1%及12.0%、3.3%、1.5%;样品基质对检测无明显干扰;单抗样品检测不存在Hook效应;检测本公司10批单抗制品原液和冻干品中SP2/0细胞蛋白残留率均小于0.01%。结论该试剂盒灵敏度高,精密性好,可用于单抗制品中残余SP2/0细胞蛋白含量的测定。     

抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段单克隆抗体的制备

目的制备抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段(sTRAIL)的单克隆抗体。方法用重组sTRAIL免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,捕获ELISA筛选阳性克隆,制备腹水抗体。间接ELISA测定单抗效价,并进行单抗亚类、特异性鉴定及杂交瘤细胞染色体和单抗识别位点分析。将杂交瘤细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后,检测细胞培养上清的效价。结果3株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgG1型,腹水单抗效价均高于10-6,杂交瘤细胞染色体数介于94～98条之间,均识别sTRAIL分子上线性表位。细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后的上清效价保持稳定。结论已成功制备了3株可稳定分泌抗sTRAIL单克隆抗体的杂交瘤细胞,为TRAIL的定性定量检测及组织表达分析奠定了基础。     

人源化叶酸受体α抗体质控方法的建立

目的建立人源化叶酸受体α抗体的质控方法。方法应用基于表面等离子体共振(Surface plasmon resonance,SPR)技术的BIAcore3000系统测定人源化叶酸受体α单抗与重组人叶酸受体α的亲和力,从而反映该抗体的功能;采用ELISA法测定其抗原结合力;SDS-PAGE和SEC-HPLC测定其纯度;紫外分光光度法测定其蛋白含量;毛细管等电聚焦电泳法测定等电点;其他各项指标检测按《中国药典》三部(2005版)要求进行。结果人源化叶酸受体α单抗成品的平均相对百分效价为105%,RSD为6.0%。单抗成品及参考品与叶酸受体的结合力均存在量效关系,且符合四参数方程式:Y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D,其曲线相关系数在0.98以上,成品经3次测定,相对抗原结合力平均值为97%,RSD为25%。还原SDS-PAGE分析显示,单抗成品的IgG重链和轻链百分比为98.2%;非还原SDS-PAGE分析显示,完整IgG百分比为96.7%;SEC-HPLC分析显示,单抗成品单体为99.1%,聚合体为0.9%。其他各项指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求。结论已初步建立了人源化叶酸受体α抗体的质控方法,为该制品的质量控制奠定了基础。     

牛心肌肌钙蛋白T的提取、纯化及其单克隆抗体的制备

目的提取、纯化牛心肌肌钙蛋白T(Cardiac troponin T,cTnT),并制备其单克隆抗体。方法采用组织匀浆、蛋白层析技术提取、纯化牛cTnT,紫外分光光度法检测其浓度;SDS-PAGE检测其纯度;间接ELISA法检测其反应特性。将纯化的牛cTnT免疫小鼠,进行细胞融合,间接ELSIA法筛选阳性杂交瘤细胞株,采用小鼠体内法制备腹水。结果纯化的两批牛cTnT浓度分别为0.246和0.336 mg/ml;相对分子质量约为37 000,纯度分别为86.02%和93.77%;纯化的cTnT蛋白可与鼠抗牛cT-nT单克隆抗体结合。共获得5株分泌抗牛cTnT单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中,阳性杂交瘤细胞株3B10腹水抗体效价达1∶10 240。结论已成功提取、纯化了牛cTnT,并建立了稳定分泌抗牛cTnT单抗的杂交瘤细胞株,为cTnT检测试剂盒的国产化奠定了基础。     

血管内皮细胞生长因子的表达及其单克隆抗体的制备

目的表达、纯化血管内皮细胞生长因子(VEGF165)蛋白,并制备其单克隆抗体。方法将pGEX-4T-1/VEGF165表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达GST-VEGF165融合蛋白,并采用十二烷基肌氨酸钠溶解,亲和层析纯化。用获得的GST-VEGF165蛋白免疫小鼠,制备抗GST-VEGF165单克隆抗体,并进行鉴定及初步应用。结果表达的GST-VEGF165融合蛋白相对分子质量约为45000,表达量约占菌体总蛋白的20%,纯化后蛋白纯度大于90%,并具有与其受体结合的活性,亲和力约为109L/mol。免疫小鼠后,获得1株抗GST-VEGF165的单克隆抗体,反应原性良好,亚类为IgG2a,解离常数为2×10-9mol/L。以此单抗为包被抗体,建立了双抗体夹心ELISA法,VEGF165的最佳检测范围为1.5625～25ng/ml。结论成功表达、纯化了VEGF165蛋白,并制备出VEGF165单克隆抗体,为VEGF检测试剂盒的研制奠定了基础。     

戊型肝炎病毒重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒的制备

目的制备戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒。方法以4型HEV ORF2重组蛋白P179免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,有限稀释法进行克隆化培养,制备腹水,并对杂交瘤细胞进行染色体计数,鉴定单抗亚类及特异性、并检测稳定性;经SDS-PAGE分析抗体纯度,以兔抗179抗原多抗作为包被抗体,HRP标记P179单抗作为酶标抗体,建立双抗体夹心ELISA法,制备试剂盒,并进行最佳线性范围测定、准确性、精密性和稳定性验证。结果获得4株能稳定分泌抗P179抗原单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3A10、3F8、4E9和5G6,腹水抗体效价分别为1∶10-7、1∶10-6、1∶10-6和1∶10-7,染色体数分别为96、98、101和99条;亚类分别为IgG2a、IgG2a、IgG1和IgG2b;4株单抗连续传代3个月,液氮冻存1年抗体效价未发生变化;制备的试剂盒有良好的线性(R2>0.950 0)、准确性、精密性,试验内变异系数为4.17%～6.26%,回收率在87.9%～114.8%之间,试验间变异系数为5.82%～8.01%,回收率在90.8%～108.9%之间;于37℃及4℃放置3 d,仍具有良好的稳定性。结论成功制备了戊型肝炎病毒P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒,可用于戊型肝炎疫苗生产中定量检测疫苗抗原。