小鼠多能干细胞对小鼠肝脏电离辐射损伤的作用

目的探讨小鼠多能干细胞(mouse pluripotent stem cells,miPS)对小鼠肝脏电离辐射损伤的作用。方法采用医用电子直线加速器进行单次全身性照射(电子辐射线源为6 MeV,照射总剂量为8 Gy,照射剂量率为1. 0 Gy/min)。辐射组于辐射后12和24 h,经小鼠尾静脉注射生理盐水(200μL/只);治疗组于照射后12和24 h,经尾静脉注射mi PS细胞悬浮液[3×106个/(200μL·只)];对照组小鼠不进行辐射,仅注射生理盐水(200μL/只)。末次注射后1、3、7、14 d,记录小鼠体重、计算肝脏指数,并检测小鼠肝脏中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平;末次注射后14 d,观察小鼠状态,并采用组织病理学方法观察肝脏病理形态学变化。结果与对照组比较,辐射组小鼠精神状态和食欲状况均不佳,体重显著降低(P <0. 05),肝脏指数差异无统计学意义(P> 0. 05),肝脏中SOD活性显著降低(P <0. 01),MDA水平显著升高(P <0. 05);与辐射组比较,治疗组小鼠体重明显升高(P <0. 05),肝脏指数差异无统计学意义(P> 0. 05),肝脏中SOD活性显著升高(P <0. 05),MDA水平显著降低(P <0. 01)。对照组小鼠肝脏组织无明显病变;辐射组小鼠肝细胞发生明显肿胀及肝细胞索紊乱等明显病理变化;治疗组小鼠肝细胞索排列整齐,肝细胞轻度肿胀,病理变化得到改善。结论 miPS可通过其增殖分化减少小鼠体内氧化应激产生的细胞凋亡,对电离辐射造成的小鼠肝脏损害有明显的修复作用。     

农用杀菌剂吩嗪-1-羧酸的生物合成与基因调控

吩嗪-1-羧酸是一种安全、广谱的微生物源农药，可以抑制多种植物病原真菌，有效防治作物病害。本文对假单胞菌中吩嗪-1-羧酸的生物合成途径及吩嗪-1-羧酸衍生物的形成等进行了阐述，分析了吩嗪-1-羧酸合成的基因调控方式以及环境因素变化对其合成的影响。吩嗪-1-羧酸已广泛应用于生物防治．具有良好的应用前景。     

Na+/K+ ATPase β1亚基对乙型肝炎病毒复制的影响及其作用机制

目的 探讨Na+/K+ ATPase β1亚基(ATP1B1)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的影响及其作用机制.方法 将稳定表达HBV的质粒pHBV1.3分别与质粒VR1012-ATP1B1及siRNA ATP1B1序列共转染HepG2细胞,EUSA法检测细胞培养上清中HBsAg的含量...     

过表达BRIT1基因对鼻咽癌HNE-1细胞凋亡的影响及其机制

目的研究BRIT1(BRCT-repeat inhibitorof h TER expression)基因对鼻咽癌HNE-1细胞凋亡的影响,并初步探讨其相关的分子机制。方法利用免疫组织化学法检测30份鼻咽癌组织及30份鼻咽正常组织中BRIT1蛋白的表达;利用质粒pc DNA3.1(-)/BRIT1及pc DNA3.1转染HNE-1细胞,TUNEL法、Hoechst33342染色法及流式细胞术检测细胞的凋亡情况,Western blot法检测转染细胞中BRIT1蛋白及caspase-3、active caspase-3、Bax、bcl-2蛋白的表达。结果 BRIT1在鼻咽癌组织中的BRIT1蛋白表达水平低于鼻咽正常组织(P0.05);转染质粒pc DNA3.1(-)/BRIT1的HNE-1细胞中,BRIT1蛋白水平明显上调(P0.05);过表达BRIT1明显促进HNE-1细胞的凋亡,并导致抗凋亡蛋白caspase-3、bcl-2表达下调(P0.05),促凋亡蛋白active caspase-3、Bax表达上调(P0.05)。结论BRIT1基因通过调控线粒体凋亡途径相关基因的表达,促进鼻咽癌细胞HNE-1凋亡的发生。     

小鼠MUC1基因的克隆及其在大肠杆菌DH5α中的表达

目的构建表达小鼠MUC1基因的工程菌,并纯化重组小鼠MUC1融合蛋白。方法通过RT-PCR扩增小鼠MUC1基因片段,连入pMAL-p2原核表达载体,并转化大肠杆菌DH5,αIPTG诱导表达,经Western blot鉴定,Amylose Resin亲和层析纯化。结果获得了小鼠MUC1 708bp DNA片段,并构建了pMAL-mMUC1表达载体。表达产物相对分子质量约为67000,经Western blot鉴定,与兔抗MBP多克隆抗体产生特异性反应。纯化的融合蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带。结论成功构建了表达小鼠MUC1蛋白的工程菌。     

基因重组HIV-1 P24抗原的应用分析

目的 分析重组HIV-1-p24抗原,以便研制HIV-抗体诊断试剂。方法 以纯化重组P24为包被抗原,应用ELISA检测HIV-Ab国家参比品和正常人血清。结果20份阳性HIV-Ab检出阳性19份,符合率为95％;20份阴性HIV-Ab检出阴性18份,符合率为90％;50份正常人血清检测结果均为阴性。结论 所研制的重组P24抗原具有较高的特异性和敏感性,可用于制备HIV抗体诊断试剂。     

小鼠骨髓间充质干细胞对异基因肝移植模型大鼠移植区域组织损伤的修复作用

目的观察小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)注入后在异基因肝移植模型大鼠移植区域的迁徙、定居及组织修复作用,探讨MSCs诱导异基因移植免疫耐受的可能性。方法将昆明小鼠肝组织块埋入Wister大鼠肝脏切口,制备异基因肝移植大鼠模型;体外分离、纯化并培养昆明小鼠乳鼠MSCs;经DAPI标记后,尾静脉注入模型大鼠,通过激光共聚焦显微镜,分别在24h、5d及10d观察MSCs在肝脏移植区域的迁徙及定居;采用HE染色观察肝移植区域组织损伤情况。结果MSCs尾静脉注入后,24h即出现在肝移植区域,5d时分布于血管周围,10d时扩散至移植区域血管及周围组织;MSCs治疗5d,HE染色显示移植区域浸润的炎性细胞减少,可见肝组织结构。结论小鼠MSCs可在大鼠体内存活,并参与损伤区血管及组织的修复。     

老年急性心肌梗死患者血清可溶性细胞间粘附分子-1和心肌营养素-1的变化

目的探讨可溶性细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和心肌营养素-1(CT-1)在老年急性心肌梗死患者血清中的变化及其意义。方法研究对象为老年急性心肌梗死患者48例、稳定型心绞痛患者及体检正常者各30例,分别测定其血清ICAM-1及CT-1浓度,比较AMI患者不同时间点的及不同组间血清含量变化。结果老年心肌梗死组发病第1天血清ICAM-1、CT-1均明显高于健康对照组,与稳定性心绞痛组发病第1天比较差异具显著性意义(均为P<0.001)。老年心肌梗死组发病后第1天血清ICAM-1、CT-1均明显增高,第7天降低,第14天基本恢复正常,3个不同发病时间点之间比较差异有显著性(P<0.05)。老年急性心肌梗死患者血清CT-1与ICAM-1呈正相关(r=0.613,P<0.001)。结论监测老年急性心肌梗死患者血清ICAM-1与CT-1水平,对本病的诊断、判定病程的进展及临床疗效均具有一定的作用。     

ERK1/2抑制对沙门菌侵袭小鼠胃癌细胞后小鼠β-防御素-2表达的影响

目的探讨ERK1/2抑制对沙门菌侵袭小鼠胃癌(mouse forestomach carcinoma,MFC)细胞后小鼠β-防御素-2(mouseβ-defensin-2,m BD-2)表达的影响及作用机制。方法采用RNA干扰的方法抑制MFC细胞中ERK1/2的表达,并经G418筛选稳定细胞株,经RT-PCR和Western blot法检测ERK1/2基因的抑制效率。用10~3个/ml的沙门菌对干扰组及对照组(未转染)的MFC细胞分别作用4、8及12 h,通过Western blot法检测m BD-2蛋白表达及Rsk~(90)的磷酸化水平。同时采用MTT法检测沙门菌作用两组MFC细胞12、24及48 h时的生长情况。结果RT-PCR和Western blot法检测结果表明,ERK1/2基因抑制效果显著。沙门菌作用MFC细胞后4、8和12 h后,各时间点间干扰组细胞中m BD-2蛋白表达及Rsk~(90)蛋白磷酸化水平差异无统计学意义(P0.05),且均显著低于各时间点的对照组(P0.05)。沙门菌作用12和24 h,干扰组细胞的抑制率明显高于对照组(P0.05),作用48 h时,两组细胞的抑制率差异无统计学意义(P0.05),细胞几乎全部死亡,且干扰组细胞抑制率的增加速度较快,作用24 h时已达97.7%。结论ERK1/2抑制可明显降低沙门菌侵袭MFC后m BD-2的表达水平,表明ERK1/2可调控m BD-2的表达。     

小鼠骨髓间充质干细胞对异基因肝移植大鼠淋巴细胞增殖的抑制作用

目的观察小鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植后,在异基因肝移植模型大鼠胸腺、脾脏及骨髓中的迁徙、定居情况及对淋巴细胞增殖的抑制作用,以探讨MSCs诱导异基因移植免疫耐受的可能性。方法体外分离、纯化并培养小鼠MSCs;将小鼠肝组织块埋入大鼠肝脏切口,建立异基因肝移植大鼠模型;经尾静脉移植DAPI标记的小鼠MSCs,通过激光共聚焦显微镜观察24 h及5 d时,MSCs在模型大鼠胸腺、脾脏及骨髓内的迁徙及定居;采用体外淋巴细胞增殖实验检测小鼠MSCs对异基因肝移植大鼠淋巴细胞增殖的抑制作用。结果MSCs移植后,24 h即散在分布于胸腺、脾脏及骨髓内,5 d时集中在血管周围;经MSCs治疗后,大鼠胸腺和脾脏淋巴细胞增殖均受到抑制,与未经治疗的模型大鼠相比,差异有显著意义。结论小鼠MSCs可迁徙至异基因肝移植大鼠免疫器官内,并具有抑制淋巴细胞增殖的作用。     

共济失调毛细血管扩张突变基因缺陷对小鼠心肌梗死后心脏重塑的影响

目的 观察共济失调毛细血管扩张突变基因(ataxia telangiectasia mutated,ATM)单倍体缺陷对小鼠心肌梗死后心脏重塑的影响,并探讨其相关机制.方法 将ATM单倍体基因缺陷小鼠(ATM+/-)和同窝野生型小鼠(ATM+/+)通过结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,同时设立假手术组.术后7 d,...     

日本血吸虫重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂对小鼠心肌梗死预后的影响及其免疫调节机制

目的 探讨日本血吸虫重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂(rSjcystatin)对小鼠心肌梗死(myocardial infarction,MI)预后的影响及其免疫调节机制.方法 建立小鼠MI模型,分别于术后1、3、5、7、14、28 d经腹腔注射PBS及10、25 μg rSjcystatin.术后28 d,记录MI小鼠的生存...     

小鼠Hes1基因过表达逆转录病毒载体的构建及其在小鼠Lin~-造血细胞中的表达

目的构建过表达Hes1基因的逆转录病毒载体,并通过感染相对原始的小鼠Lin-造血细胞检测其感染效率。方法通过RT-PCR法从B6小鼠骨髓细胞中扩增Hes1基因功能区,将扩增产物连接入逆转录病毒载体MSCV-ICN1-IRES-GFP,构建重组逆转录病毒载体MSCV-Hes1-IRES-GFP,瞬时转染293T细胞,设转染空载体的细胞为对照组,流式细胞仪检测转染效率,Realtime PCR检测Hes1基因的表达;将重组逆转录病毒载体MSCV-Hes1-IRES-GFP及空载体与Lipofectamine 2000混合后,转染293T细胞,包装重组逆转录病毒,稳定感染小鼠Lin-细胞,设感染空载体病毒的细胞为对照组,流式细胞仪检测感染效率,Realtime PCR检测Hes1基因的表达。结果测序证实重组逆转录病毒载体构建正确;转染293T细胞后第3天,重组逆转录病毒的转染效率约为95%,Hes1基因表达量约为对照组的5倍;病毒上清感染Lin-细胞后第4、5天,重组逆转录病毒的感染效率约为7%,Hes1基因的表达量约为对照组的6倍。结论已成功构建了过表达Hes1基因的重组逆转录病毒载体,并在小鼠Lin-细胞中稳定表达,为研究白血病环境下Hes1对造血干祖细胞的作用奠定了基础。     

人C-反应蛋白重组真核表达质粒的构建及其对人脐静脉内皮细胞LOX-1和TF表达的影响

目的构建人C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)重组表达质粒pTracer CMV2-CRP,并观察其在人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelical cells,HUVEC)中的表达及其对凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(Lectin-type oxidizedLDL receptor-1,LOX-1)、组织因子(Tissue factor,TF)表达的影响。方法以质粒pCR-BluntⅡ-TOPO-CRP为模板,PCR扩增CRP基因CDS序列,克隆至pTracer CMV2载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α,构建重组表达质粒pTracer CMV2-CRP,转染HUVEC,设实验组(转染pTracer CMV2-CRP)、阴性对照组(转染pTracer-CMV2)及正常对照组,各组细胞经G418抗性筛选,RT-PCR及Western b1ot检测CRP基因的过表达效应及CRP的表达对HUVEC中LOX-1和TF转录及蛋白水平的影响。结果重组真核表达质粒pTracer CMV2-CRP经双酶切鉴定及测序证明构建正确。实验组细胞中,CRP基因过表达,且LOX-1和TF基因的转录及蛋白水平明显高于正常对照组和阴性对照组(P<0.05)。结论已成功构建人CRP基因重组真核表达质粒pTracerCMV2-CRP,并在HUVEC中过表达CRP,且明显上调HUVEC中LOX-1和TF的表达,为进一步阐述CRP在动脉粥样硬化形成过程中的作用提供了新的实验依据。     

乙型肝炎病毒X蛋白对小鼠胚胎肝干细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

目的研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X蛋白(HBx)对小鼠胚胎肝干细胞(embryonic liver stemcell,ELSC)凋亡及相关蛋白Bcl2、Mcl1、Bax表达的影响。方法采用表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的腺病毒载体系统将HBx基因转入小鼠胚胎肝干细胞ELSC14.5中,采用RT-PCR和Western blot法检测细胞中HBx基因mRNA的转录和蛋白的表达;Hoechst33342染色法观察细胞核的改变;TUNEL法和流式细胞术检测细胞的凋亡情况;Real-time PCR和Western blot法检测抗凋亡因子Bcl2、Mcl1和促凋亡因子Bax基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果重组腺病毒Ad-GFP-HBx能有效感染ELSC14.5细胞,HBx基因和蛋白均能特异性表达;感染的ELSC14.5细胞核呈现固缩,且边缘化的细胞数减少,细胞凋亡率降低;细胞中Bcl2和Mcl1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均增高,而Bax的表达降低。结论 HBx可通过调节Bcl2家族中抗凋亡因子和促凋亡因子的比例失衡,来抑制小鼠胚胎肝干细胞的凋亡,促进其存活。     

LFA-1基因对胶原诱导小鼠关节炎关节局部引流淋巴结T细胞活性的影响

目的探讨淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)在类风湿性关节炎形成中的作用。方法采用Ⅱ型胶原诱导小鼠关节炎模型,观察LFA-1基因敲除小鼠引流淋巴结T细胞增殖和细胞因子水平。结果LFA-1基因敲除小鼠在应用Ⅱ型胶原免疫后,引流淋巴结和关节局部Th1型细胞因子IFN-γ和IL-12p40mRNA水平明显低于野生型对照小鼠,Th2型细胞因子IL-4mRNA水平无明显变化。LFA-1基因敲除小鼠引流淋巴结来源的CD4+T细胞在体外受Ⅱ型胶原刺激后,其特异性增殖和细胞因子IFN-γ的产生也明显低于野生型对照小鼠。结论LFA-1基因缺失抑制了辅助性T细胞的活化和向Th1方向的分化,进而抑制关节炎的发生。     

神经干细胞的三维培养及其在神经疾病中应用的研究进展

作为从二维(two-dimensional,2D)培养衍生出的新技术,神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的三维(threedimensional,3D)培养不仅能够模拟脑内微环境,更好地维持NSCs增殖及分化能力,还能进一步形成脑类器官。3D培养NSCs及脑类器官均可作为有效的体外细胞模型,不仅能模拟神经疾病的发病过程,还可应用于高通量药物筛选;另外,利用NSCs移植及定向分化等特征修复和替代死亡的神经细胞,可延缓或抑制阿尔茨海默症(alzheimer disease,AD)等神经系统疾病。NSCs的3D培养将有助于研究者更好地理解大脑发育过程,以及神经系统疾病特别是神经退行性疾病的发病机制,同时有助于寻找药物靶点和药物开发。由此可见NSCs的3D培养展现出巨大的优势,具有良好的应用前景。本文对NSCs的特性和3D培养方式,及其在神经疾病中应用的最新研究进展作一综述。     

丙型肝炎病毒中和抗原表位与乙型肝炎病毒S抗原嵌合基因重组真核表达质粒的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)中和抗原表位与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)S抗原嵌合基因真核表达质粒,并在293T细胞中进行表达。方法从含HBV全序列的质粒pHBV中扩增HBV S抗原基因,在HBV S疏水区127和128位氨基酸序列处引入AgeⅠ酶切位点,将HCV E1和E2区保守的线性中和抗原表位及HVR1的模拟表位基因分别插入该位点,获得嵌合HCV中和抗原表位的重组HBV S基因,将该基因克隆至真核表达载体pCI-neo中,构建重组真核表达质粒pCI-HBSE1～4。将4种重组真核表达质粒转染293T细胞,间接免疫荧光和Western blot检测嵌合基因的表达。结果 4种重组真核表达质粒经双酶切证实构建正确;4种重组质粒转染的293T细胞胞浆内可见较强的绿色荧光,Western blot显示,在相对分子质量约27 000处可见蛋白条带。结论成功构建了HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合基因真核表达质粒,其在293T细胞中可有效表达,为进一步制备嵌合HCV中和抗原表位的HBV S抗原VLP,研究中和抗体对HCV假病毒颗粒(HCVpp)和JFH-1 HCV体外培养系统(HCVcc)感染的抑制作用奠定了实验基础。     

抗旋毛虫硒蛋白T单克隆抗体的制备及其对裸鼠肝癌H7402细胞的抑制效果

目的制备抗旋毛虫与肝癌H7402细胞相关抗原硒蛋白T单克隆抗体,并观察其对裸鼠肝癌H7402细胞的抑制效果。方法用纯化的旋毛虫硒蛋白T重组蛋白常规免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备其单克隆抗体;将肝癌H7402细胞经大腿内侧皮下接种BALB/c裸鼠,1×10^7个细胞/只,采用制备的高效价单抗,按20、50及100μg/只剂量接种裸鼠,隔日1次,共5次,评价单抗对裸鼠肝癌H7402细胞的抑制效果。结果成功获得了3株稳定分泌抗旋毛虫硒蛋白T的单抗的细胞株:4D4、4H2及4F1,效价均达1∶204800以上,其中4H2抗体效价最高;20、50及100μg/只剂量组的抑瘤率分别为51.6%、56.2%和80.3%。结论制备的抗旋毛虫与肝癌H7402细胞相关抗原硒蛋白T单克隆抗体对裸鼠体内肝癌H7402细胞具有明显的抑制效果。