狂犬病病毒抗原定量检测方法的建立

目的建立狂犬病病毒抗原的定量检测方法,用于疫苗生产过程中病毒含量的监测。方法用狂犬病病毒aG株免疫豚鼠,制备抗狂犬病病毒多克隆抗体,纯化后以辣根过氧化物酶进行标记。采用双抗体夹心ELISA法建立检测系统。以狂犬病疫苗国家参考品为定量标准,建立剂量反应曲线,确定该方法的灵敏度,并对该方法的精密性、特异性和适用性进行验证。结果制备的多克隆抗体高峰效价为1∶105,纯化后的抗血清蛋白含量为6.45mg/ml。建立的ELISA方法对狂犬病病毒抗原的最低检出量为5.3mIU/ml,最佳定量区间为10～110mIU/ml,相关系数为0.9983,精密性和特异性较好。用该方法对狂犬病疫苗进行抗原定量,与NIH法测定的疫苗效力具有一定的相关性;检测市售的不同毒株和细胞系生产的狂犬病疫苗,其结果在2.4～9.9IU/ml之间。结论已建立了狂犬病病毒抗原的定量检测方法,可对来自不同毒株和不同细胞系的狂犬病疫苗进行快速定量检测,为疫苗生产中的质量控制提供了简便的监测手段。     

我国狂犬病疫苗生产用毒株糖蛋白氨基酸序列及其抗原位点分析

目的分析我国狂犬病疫苗生产用毒株aG(PG)株和CTN株糖蛋白结构及抗原位点的差异。方法登录GenBank搜寻aG株和CTN株糖蛋白的氨基酸序列,用Vector NTI Suite8软件分析两毒株糖蛋白的同源性;用DNAStar5分析两毒株糖蛋白的二级结构和潜在的抗原位点。结果aG株和CTN株的糖蛋白氨基酸序列的同源性为88·2%,特征性二级结构的位置与数量相似,主要的抗原位点均为13个。结论两毒株的糖蛋白氨基酸序列虽然存在一定的差异,但生产的狂犬病疫苗均能产生较好的保护效果,提示某些表位是产生中和抗体的关键。     

狂犬病病毒抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用

目的建立狂犬病病毒(Rabies virμs,RV)抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法,以应用于疫苗生产过程中RV含量的监测。方法将RV aGV株纯化抗原经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,制备抗RV单克隆抗体,纯化后以HRP进行标记,建立双抗体夹心ELISA检测方法。以狂犬病疫苗(效力检定用)国家标准品为定量标准,建立剂量-反应曲线,确定该方法的灵敏度,并对该方法的专属性、精密性及适用性进行验证。结果制备了2株针对不同抗原位点的单克隆抗体1E9和2H1,间接ELISA法测定腹水效价为1∶105～1∶107,纯化后蛋白含量分别为10.285和7.64 mg/ml。建立的ELISA法对RV抗原的最低检出限为1.03 mIU/ml,标准曲线的最佳线性范围为1.03～66 mIU/ml,相关系数为0.991 9。该方法对检测过程中可能遇到的杂质和添加物(人血清白蛋白、牛血清、Vero细胞培养上清)的检测结果均为阴性;检测3个浓度(20、12.50和3.13 mIU/ml)狂犬病疫苗(效力检定用)国家标准品的试验内和试验间变异系数的平均值分别为7.78%和14.0%;用该方法检测不同毒株、不同细胞生产的狂犬病疫苗的RV抗原含量的平均值在0.67～4.86 IU/ml之间。结论成功建立了RV抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法,可对来自不同毒株、不同细胞的狂犬病疫苗的RV抗原进行快速定量检测,为疫苗生产中的质量控制提供了简便的监测手段。     

百日咳毒素兔多克隆抗体的制备及其ELISA定量检测方法的建立和验证

目的 制备百日咳毒素（pertussis toxin,PT）兔多克隆抗体（简称多抗）,建立定量检测PT抗原含量的双抗体夹心ELISA法,并进行验证及应用。方法 采用传统方法,用PT免疫青紫蓝兔制备PT兔多抗。优化ELISA系统反应条件,建立PT双抗体夹心ELISA定量检测方法,并进行特异性、线性、准确性、精密性、灵敏度验证。采用建立的方法对脱毒过程样品及其他百日咳抗原纯化过程样品菌毛蛋白（fimbriae proteins,FIM）原液中PT抗原含量进行检测。结果 PT抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的工作条件为PT兔多抗包被浓度为1μg/mL,酶标抗体稀释度为1∶8 000。此检测系统能与PT纯化蛋白发生特异性反应,而与百日咳丝状血凝素、白喉类毒素、破伤风类毒素均未发生交叉反应;建立的双抗体夹心ELISA法线性检测范围在25～400 ng/mL之间;PT高、中、低浓度回收率分别为103.27%、91.48%、103.52%;酶标板内和板间的变异系数（CV）均小于10%;该方法的灵敏度为20.719 ng/mL,检测下限为41.438 ng/mL。检测5种不同脱毒工艺条件下、不同取...     

狂犬病病毒抗原ELISA检测方法的建立及其应用

目的建立狂犬病病毒抗原ELISA检测方法,并进行初步应用。方法采用狂犬病病毒CTN-1V纯化抗原免疫家兔,制备多克隆抗体,作为酶标抗体,马抗狂犬血清纯化抗体作为包被抗体,建立双抗体夹心ELISA法。对该方法进行验证,检测狂犬病病毒原液毒力和疫苗效力,并与小鼠(NIH)法检测结果进行对比。结果双抗体夹心ELISA检测方法的最低检出限为0.17 IU/ml,最佳线性范围为0.17～2.00 IU/ml,相关系数R>0.97;批间及试验内变异系数均小于10%,特异性、稳定性均良好;检测20批病毒原液毒力及疫苗效力,结果与NIH法相比,差异无统计学意义。结论已建立狂犬病病毒抗原ELISA检测方法,可用于生产过程中狂犬病疫苗原液和半成品的检定。     

狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立及初步应用

目的建立狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法,用于不同株狂犬病疫苗免疫后抗体水平的检测。方法用市售的不同狂犬病疫苗株抗原免疫NIH小鼠,制备免疫血清,用不同的疫苗株抗原包被酶标板,分别测定小鼠血清抗体效价,并通过不同株抗原抗体的交叉中和实验,分析抗原的差异性;在此基础上,将不同毒株抗原按不同比例混合包被酶标板,分别测定阳性血清样本,并与快速免疫荧光抑制试验(RFFIT)检测结果比较,确定包被抗原模式,建立狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法,绘制标准曲线,确定最佳定量范围及灵敏度,确定Cut-off值;并对其特异性、精密性、准确性及稳定性进行验证;用建立的方法与其他市售狂犬病病毒抗体检测试剂分别检测血清样品,分析检测结果的一致性及相关性。结果狂犬病病毒抗原AG∶CTN-1=4∶1为最适包被抗原模式,试剂经优化后,检测抗体效价范围在535.00～33.44 mIU/ml之间,具有良好的线性关系(r>0.99),最低检出限为8.36 mIU/ml,Cut-off值为0.735 mIU。该方法检测人血清白蛋白、破伤风阳性血清、乙肝表面抗原阳性血清、白喉阳性质控血清均未发生反应;试验内变异系数在6.68%～7.84%之间;回收率在97.25%～104.50%之间;试剂置37℃3 d,与4℃保存试剂测定结果差异无统计学意义(P>0.05)。该方法检测血清样品与市售狂犬病病毒抗体检测试剂比较,均具有良好的一致性;与RFFIT测定结果比较,二者差异无统计学意义(P>0.05),回归方程为Y=-0.475+3.246 X,相关系数为0.801。结论已建立了狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法,可用于大规模狂犬病病毒抗体的筛查。     

鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA诊断试剂盒的研制

目的研制鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA诊断试剂盒,并进行验证。方法用纯化的鼠疫菌F1抗原作为包被抗原,HRP标记的F1抗原作为酶标抗原,建立鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA检测方法,连续制备3批诊断试剂盒,并建立内部质控品。对试剂盒进行板内板间精密性、敏感性、特异性、准确性和稳定性验证。结果鼠疫菌F1抗原的最佳包被浓度为0.6μg/ml,HRP标记的F1抗原的最佳工作浓度为1︰7 000。制备的试剂盒检测精密性质控品的板内变异系数为6.5%,板间变异系数为7.1%;检测高、中、低浓度内部质控品和精密性质控品的回收率在95%¹12%之间;检测阳性血清和阴性血清的敏感性为100%;与正常人血清、正常兔血清、正常小鼠血清、兔抗假结核耶尔森菌血清、小鼠抗假结核耶尔森菌血清均无交叉反应;试剂盒稳定性良好,有效期至少为1年。结论成功制备了鼠疫菌F1抗体双抗原夹心ELISA诊断试剂盒,达到了体外诊断试剂的注册要求,可用于鼠疫的临床监测、诊断及预后判断。     

狂犬病病毒CVS-11株全基因序列测定及分析

目的对狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11株进行全基因序列测定,并就主要抗原位点与我国现用狂犬病疫苗生产毒株进行比较,评价CVS-11株作为抗狂犬病病毒中和抗体检测毒株的适用性。方法将CVS-11全基因组RNA分成8段进行RT-PCR扩增,分别将产物克隆入pGEM-TEasy载体中,测定全序列;用DNAStar软件包中的相应软件对基因全序列进行分析,并与5株生产用狂犬病病毒(CTN-1、aG、FluryLEP、PM和PV)进行基因比对分析和主要抗原位点比较。结果 CVS-11株基因组全长11927bp,其结构基因排列与已知其他狂犬病病毒相同,但G和M基因的非编码区偏长。CVS-11株与我国现用疫苗株的序列同源性在84.3%～99.5%之间。以相对保守的N基因作进化树分析,CVS-11株与PM株同源性最高,与CTN-1和aG株的亲缘关系较其他疫苗株远。各毒株G蛋白抗原位点存在一定的氨基酸差异。结论 CVS-11株与我国现用疫苗株具有较高的同源性;CVS-11株与不同疫苗株G蛋白抗原位点的差异可能对不同疫苗免疫效果评价产生不同程度的影响。     

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒糖蛋白抗原(Gn)定量检测方法的建立及验证

目的建立发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV)糖蛋白抗原(Gn)的定量双抗体夹心ELISA检测方法,并进行验证,以用于疫苗生产过程中SFTSV糖蛋白抗原含量的监测。方法用SFTSV糖蛋白抗原分别免疫新西兰兔及BALB/c小鼠,制备抗SFTSV多克隆抗体和单克隆抗体。以抗SFTSV多克隆抗体作为包被抗体,经辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体作为酶标抗体,建立SFTSV糖蛋白抗原(Gn)定量双抗体夹心ELISA检测方法,确定该方法的线性范围、定量限,并对该方法的特异性、精密度、准确性、稳定性、适用性进行验证。结果建立的ELISA方法的线性范围为0.125~4.000μg/ml,定量限为0.125μg/ml,线性相关系数R2的平均值为0.994 1;该方法可特异性检测SFTSV病毒株,而与布尼亚病毒属其他病毒、Vero细胞培养上清及其他生产辅料均无交叉反应;该方法检测不同浓度SFTSV样品的变异系数小于15%,回收率在85%~115%之间;该检测试剂于37℃放置3 d对样品进行检测,变异系数小于15%;该方法检测SFTSV原液制备过程中不同阶段样品,随着工艺过程的不断推进,样品中单位蛋白的抗原含量呈上升趋势,可有效反映抗原纯化过程。结论建立了SFTSV糖蛋白抗原(Gn)的定量检测方法,具有较高的广谱性、灵敏度、特异性和稳定性,为疫苗生产工艺过程的质量控制奠定了基础。     

鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA诊断试剂盒的研制

目的研制鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA诊断试剂盒,并进行验证。方法用鼠疫菌F1抗原免疫家兔制备抗血清,经50%饱和硫酸铵盐析2次后,再经Sephacryl S-300凝胶柱层析纯化,作为包被抗体;制备鼠疫菌F1抗原单克隆抗体腹水,并进行纯化,用HRP标记单抗,作为酶标抗体;建立鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA检测方法,连续制备3批诊断试剂盒,并建立内部质控品。对试剂盒进行板内板间精密性、灵敏度、线性范围、特异性、重复性、准确性和稳定性验证。结果制备的试剂盒检测精密性参比品的板内变异系数为5.2%,板间变异系数为8.23%;试剂盒的线性范围为3.91⁶2.5 ng/ml,最低检测限为3.0 ng/ml;试剂盒检测鼠疫菌菌液的结果为阳性,而与近缘假结核耶尔森菌无交叉反应;试剂盒检测高、中、低3种浓度F1抗原含量的变异系数为4.54%62.5 ng/ml,最低检测限为3.0 ng/ml;试剂盒检测鼠疫菌菌液的结果为阳性,而与近缘假结核耶尔森菌无交叉反应;试剂盒检测高、中、低3种浓度F1抗原含量的变异系数为4.54%⁸.4%,回收率在104%8.4%,回收率在104%¹08%之间;试剂盒稳定性良好,有效期至少为1年。结论成功制备了鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA诊断试剂盒,为鼠疫的临床诊断及流行病学监测提供了一种快速检测手段,也为新型鼠疫组分疫苗F1抗原含量的检测提供了方法。     

狂犬病毒aG株糖蛋白在CHO细胞中的表达

目的克隆狂犬病毒aG株糖蛋白(Glycoprotein)基因,构建重组真核表达载体,在CHO细胞中表达aG株糖蛋白。方法采用RTPCR,从狂犬病毒aG株基因组RNA中扩增GP基因,并将该基因克隆至真核表达载体pCIdhfr上,以脂质体介导法转染CHOdhfr-细胞。用MTX筛选的抗性克隆经ELISA、免疫荧光及Westernblot检测GP蛋白的表达。结果克隆到狂犬病毒aG株糖蛋白全长基因,并在CHO细胞中进行表达。结论成功地在CHO细胞中表达了狂犬病毒aG株的糖蛋白,为进一步开发狂犬病毒基因工程疫苗打下基础。     

抗狂犬病病毒抗体的制备及酶联免疫法的建立

目的制备具有中和活性的抗狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)抗体,并建立检测RV抗原的ELISA法。方法以RV全病毒免疫2只新西兰家兔,制备抗RV多克隆抗体。以RV全病毒免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,建立稳定分泌抗RV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。以小鼠中和试验(MNT)检测抗体的中和活性。以ELISA双抗体夹心法和ELISA竞争法检测RV抗原。结果2只家兔的多克隆抗体ELISA效价分别为1∶6.0×103和1∶1.2×104,纯化的兔抗RVIgG中和活性分别为46.3和29.2IU/ml。获得了9株稳定分泌抗RV的单克隆抗体杂交瘤细胞株,属于IgG1或IgG2b亚型,腹水的抗体ELISA效价为1∶1.0×105~1∶1.0×107。单克隆抗体3E5、4C2和4F8具有中和活性,Westernblot分析提示,单克隆抗体4C2是针对RV糖蛋白线性表位的抗体。以单克隆抗体4C2作为捕捉抗体,兔多克隆抗体作为检测抗体,建立了ELISA双抗体夹心法,检测RV抗原。同时建立了另一种ELISA竞争法,加入固定工作浓度的单克隆抗体4C2,与RV病毒液孵育,以ELISA间接法检测RV病毒抗原。结论所获得的狂犬病毒多克隆和单克隆抗体具有中和活性,可在ELISA中用于检测RV抗原。     

浙江新分离狂犬病病毒街毒株与国内外疫苗株G基因的比较分析

目的对浙江新近分离的2株狂犬病病毒街毒株的G基因进行遗传学分析,并比较其与国内外使用的狂犬病疫苗株间的差异。方法以直接免疫荧光法和双抗体夹心ELISA法检测伤人犬脑组织,乳鼠接种分离病毒,RT-PCR扩增G基因片段,直接测序后进行遗传学分析。结果在2份伤人犬脑组织(编号LH和ZJCA1)中均检出狂犬病病毒,与其他浙江街毒株相比,G基因核苷酸和氨基酸序列同源性均为98.7%～99.2%。与当前国内外使用的多种疫苗株相比,与CTN疫苗株同源性最高,G基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.5%～86.1%和86.8%～94.1%。结论浙江新分离的2株狂犬病病毒街毒株属于基因1型,与当前使用的多种疫苗株相比,与CTN疫苗株属于同一分支,二者的亲缘关系最近。     

狂犬病毒aG株核蛋白和糖蛋白双表达质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的构建狂犬病毒aG株核蛋白(NP)和糖蛋白(GP)双表达重组质粒,在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中表达核蛋白和糖蛋白。方法提取狂犬病毒RNA,应用RT-PCR方法扩增NP和GP基因,分别将其克隆到pIRES载体上,获得同时含有NP和GP基因的双顺反子重组质粒pING,并以脂质体介导法转染CHO-K1细胞,G418筛选,用ELISA和IFA检测NP和GP的表达。结果限制性内切酶分析表明重组质粒pING含有NP和GP基因片段,长度分别为1353bp和1575bp。应用ELISA和IFA方法,在转染细胞中均检测到NP和GP的表达。结论重组双表达质粒可在CHO细胞中同时表达NP和GP,为进一步开发重组狂犬病疫苗奠定了基础。     

WuTac血药浓度双抗体夹心定量ELISA检测方法的建立及其临床应用

目的建立WuTac血药浓度双抗体夹心定量ELISA检测方法,并进行初步临床应用。方法建立双抗体夹心ELISA法,定量检测血清中WuTac浓度,筛选最佳抗体包被浓度和酶标抗体稀释度,绘制标准曲线,并对该方法进行验证;应用该方法对36名健康志愿者单次注射不同剂量WuTac(0.05、0.1和0.2mg/kg)前后14个时间点的临床血清标本进行检测。结果最佳抗体包被浓度为0.2μg/ml,最佳酶标抗体稀释度为1∶15000,标准曲线的线性相关系数r≥0.99,线性范围为3.9～125ng/ml。高浓度WuTac标准品的变异系数小于15%;准确性为99.05%±5.00%(92.43%～110.02%);特异性良好。临床血清检测结果表明,WuTac在0.05～0.2mg/kg范围内呈线性药代动力学特征。结论已建立了WuTac血药浓度双抗体夹心定量ELISA检测方法,该方法的灵敏度、精密性和准确性均符合我国生物制品药代动力学研究的要求。     

狂犬病病毒核衣壳抗原诊断试剂盒实验室内的质控方法

目的探讨狂犬病病毒核衣壳抗原诊断试剂盒实验室内质控方法。方法以ELISA双抗体夹心法检测狂犬病病毒抗原为例,采用“Levey-Jennings”和“即刻法”质控法进行对比。结果“Levey-Jennings”质控图中所有测定结果均处于“在控状态”,而“即刻法”质控图中一次测定结果处于“失控状态”。结论宜采用双质控方法进行狂犬病病毒核衣壳抗原诊断试剂盒实验室内质控。