四价流感病毒裂解疫苗在成人及3岁以上儿童中的免疫原性和安全性评价

目的 评价四价流感病毒裂解疫苗在成人及3岁以上儿童中的免疫原性及安全性.方法 采用单中心、随机、双盲、阳性疫苗对照的非劣效试验,在云南省西双版纳傣族自治州勐海县和普洱市澜沧县选择成人及3岁以上儿童共2 400名,按照1 ∶ 1∶1接种1剂试验疫苗(四价流感病毒裂解疫苗)或2种对照疫苗(上市的三价流感疫苗和含另一谱系B型...     

宫颈癌疫苗（HPV）研究进展

据悉，目前国外开发成功的官颈癌疫苗主要是2种预防性疫苗：一种是美国Merck公司研制的四价疫苗Gardasil，主要针对宫颈癌的两个HPV高危型HPV-16、HPV-18和引起生殖器尖锐湿疣（CA）的两个HPV低危型HPV-6、HPV-11；另一处是英国GSK公司研制的2价疫苗，针对HPV-16和HPV-18。     

两种重组人乳头瘤病毒52型免疫原性检测方法相关性的比较

目的比较两种重组人乳头瘤状病毒52型(human papilloma viruses type 52,HPV52)免疫原性检测方法的相关性。方法分别采用假病毒体外中和试验(pseudovirus based neutralization assay,PBNA)及酶联免疫吸试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测免疫后小鼠血清中HPV52型中和抗体滴度,比较两种检测方法的相关性。结果重组四价HPV疫苗免疫小鼠血清中,HPV52型中和抗体滴度与抗体滴度的Spearman相关系数为0. 765,P 0. 01;不同状态HPV52型VLP蛋白颗粒免疫小鼠血清中,HPV52型中和抗体滴度与抗体滴度的Spearman相关系数为0. 809,P 0. 01。结论采用PBNA法检测的HPV52型中和抗体滴度与ELISA法检测的抗体滴度具有较高的相关性。     

已上市人乳头瘤病毒疫苗的概况及其在国内的临床研究进展

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤,人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是诱发该病的主要病原。HPV疫苗是全球首个预防癌症的疫苗,已在多个国家广泛应用。目前成功上市的宫颈癌疫苗有默沙东公司研发的4价和9价Gardasil及葛兰素史克公司(GSK)研发的Cervarix;在我国,HPV疫苗于2016年7月上市。本文就上述疫苗的基本情况、安全性、保护效果及免疫原性作一综述,并对HPV疫苗在国内的临床研究现状进行简介。     

不同蛋白载体制备A、C、Y、W_(135)群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的免疫原性

目的探讨以破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)及白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)为载体的A、C、Y、W_(135)群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的免疫原性。方法将A、C、Y、W_(135)群流脑多糖经溴化氰(CNBr)活化后,以1,6己二酰肼(1,6-adipic acid dihydrazide,ADH)作为衍生剂制备相应的衍生物,分别与TT及DT在碳二亚胺[N-(3-Dimethylami-nopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]作用下结合,经Sepharose 4FF凝胶层析纯化后,加入冻干保护剂进行冻干,制备成A、C、Y、W_(135)群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗。用两种蛋白载体疫苗分别按1及2.5μg两个剂量(各型多糖的含量为1和2.5μg)免疫小鼠,经腹部皮下注射,于0及14 d各免疫1次,于首次免疫后第28天经静脉采血,分离血清,ELISA法检测血清各型抗体水平。结果 1及2.5μg两个剂量组的阳转率均高于80%,2.5μg免疫组的阳转率优于1μg免疫组;总体上来说,以TT为蛋白载体结合疫苗的阳转率高于以DT为载体的结合疫苗,对A和W_(135)群脑膜炎球菌多糖结合疫苗较明显。结论以TT及DT为载体制备的A、C、Y、W_(135)群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗均具有良好的免疫原性,TT略优于DT。     

重组人乳头瘤病毒疫苗免疫原性检测方法的比较

目的评价重组人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)疫苗免疫原性2种检测方法的相关性。方法应用间接酶联免疫吸附(ELISA)法和假病毒中和(pseudovirion-based neutralization assay,PBNS)法对26份阴性血清样本、34份自然感染HPV16或HPV18的血清样本及30份接种HPV16/18型双价疫苗后7个月的血清样本进行抗体滴度检测,并采用Pearman进行相关性分析。结果 3组样本的抗HPV16型和HPV18型抗体滴度的2次检测结果比值显示,试验室内重复性较好;2种方法检测血清样本抗HPV16型抗体滴度的总体相关系数为0.826,抗HPV18型为0.921;自然感染HPV的血清样本抗HPV16型抗体滴度的相关系数为0.519,抗HPV18型为0.613;接种HPV16/18型双价疫苗后的血清样本抗HPV16型抗体滴度的相关系数为0.671,抗HPV18型为0.879。结论间接ELISA法和PBNS法在检测血清样本中抗HPV16/18型抗体滴度时均具有较好的重复性和相关性,其中以接种疫苗后的血清样本中抗体滴度相关性最佳,为HPV疫苗免疫原性的检测及剂量探索试验提供了参考依据。     

高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法测定四价脑膜炎球菌多糖疫苗的多糖含量

目的采用高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法(high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detector,HPAEC-PAD)测定四价脑膜炎球菌多糖疫苗中A、C、Y、W135群多糖含量,并对该方法进行验证。方法用三氟乙酸对四价脑膜炎球菌结合疫苗进行水解,得到各群多糖的水解产物:唾液酸、葡萄糖、半乳糖、6-磷酸葡萄糖胺(ManN-6-P),采用HPAEC-PAD法,CarboPac PA10分离柱分别测定缓冲提取液中的总唾液酸、葡萄糖、半乳糖、ManN-6-P的含量,利用归一化的峰面积计算相应唾液酸系数,再计算C群脑膜炎球菌唾液酸含量。对HPAEC-PAD法进行验证,并与传统火箭电泳法检测结果进行比较。结果四价脑膜炎球菌结合疫苗水解后得到的4群单糖均呈良好线性,分离度和峰形均良好;HPAEC-PAD法检测4群糖的日内和中间精密性的RSD均小于5%;各群多糖峰面积的回收率均在80%¹20%之间;3批四价脑膜炎球菌多糖疫苗水解后,经HPAEC-PAD法测定的各群多糖含量与传统火箭电泳法测定结果相当。结论 HPAEC-PAD法检测四价脑膜炎球菌多糖疫苗中的A、C、Y、W135群多糖含量准确、简便、快速、可靠,对控制该疫苗的质量具有重要意义。     

人类乳头瘤病毒特异性抗体单一稀释度ELISA检测方法的建立、验证及初步应用

目的建立人类乳头瘤病毒(human papillomaviruses,HPV)特异性抗体单一稀释度ELISA检测法,并进行方法验证及初步应用。方法以HPV16及HPV18 L1病毒样颗粒蛋白作为包被抗原,血清样品采用单一稀释度稀释(未免疫血清及免疫后血清分别进行100及500倍稀释),建立HPV特异性抗体的单一稀释度ELISA检测法,并验证方法的特异性、准确性、线性范围、检测限度及精密性。采用建立的方法检测自然感染HPV及接种疫苗后的血清样本(各28份),并与假病毒中和试验(pseudovirus-based neutralization assay,PBNA)检测结果进行比较。结果 100份阴性血清样本HPV16及HPV18 IgG抗体均为阴性;HPV16及HPV18抗体滴度的平均回收率分别为74%和73%;HPV16及HPV18抗体的定量检测范围分别为0. 049～0. 370 IU/mL及0. 030～0. 231 IU/mL;该方法重复性CV在2. 9%～6. 6%之间,日间精密性CV在7. 7%～11. 9%之间。接种疫苗后的血清样本检测值显著高于自然感染样本(P 0. 05),接种疫苗后的血清样本检测值与PBNA法检测结果具有显著相关性(HPV16和HPV18抗体检测结果的r值分别为0. 727和0. 800)。结论成功建立了HPV特异性抗体的单一稀释度ELISA检测法,且具有较好的特异性、准确性、精密性,可用于HPV疫苗免疫效果评价及疫苗上市后抗体水平的监测。     

流感病毒疫苗株在MDCK细胞中增殖条件的优化

目的 优化四价流感裂解疫苗中 H1N1(IVR-180)、H3N2(IVR-186)、BV(.NYMC BX-69A)、BY(B/Phuket/3073/2013)亚型疫苗株在MDCK细胞中的增殖条件.方法 以血凝滴度和半数组织感染剂量(median tissue culture infective dose,TCID...     

宫颈癌筛查女性对人乳头瘤病毒疫苗认知及接种意愿的调查

正人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是一种无包膜的双链小DNA病毒,有极强的嗜上皮细胞属性,可引发皮肤及黏膜病变。HPV感染是常见的性传播疾病之一,持续感染16、18等高危型HPV可导致宫颈浸润癌~[1]。研究证明,接种HPV疫苗可有效预防特定亚型的HPV感染,并可减少70%左右的宫颈癌发生~[2]。HPV疫苗在美国上市已近10年,国产疫苗也有望在不久的将来应用于临床。本文调     

人乳头瘤病毒疫苗的研究进展

宫颈癌是全球妇女恶性肿瘤中仅次于乳腺癌的第二种最常见的恶性肿瘤。人乳头瘤病毒(Human papillo-mavirus,HPV)与宫颈癌的发生密切相关,利用分子生物学方法构建的HPV疫苗对宫颈癌具有预防和治疗作用。目前,HPV疫苗的研究得到了迅速发展,并涌现出许多新的开发策略。本文对HPV疫苗的研究进展和前景作一综述。     

治疗性HPV疫苗的研究进展

人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)主要经性接触传播,可引起宫颈、肛门、生殖器等部位的恶性肿瘤。在世界范围内,宫颈癌发病率目前居女性癌症的第二位,研制疫苗有效预防和治疗HPV感染具有重要意义,而治疗性HPV疫苗是目前研究的热点。本文对目前治疗性HPV疫苗的研究进展作一综述。     

反相高效液相色谱法检测重组类病毒颗粒疫苗原液中二硫苏糖醇的残留量

目的反相高效液相色谱法(reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)检测重组类病毒颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗原液中二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)的残留量,并对方法进行验证及初步应用。方法按设定的色谱条件对检测重组VLPs疫苗原液中DTT含量的RP-HPLC法进行专属性、精密性、准确性验证,确定方法的最佳线性范围及最低检测限,用该方法检测3批重组HPV单价疫苗原液中的DTT残留量。结果该方法检测DTT时,不受溶液中溶剂和蛋白的干扰;线性范围为1.5~15.0μg/ml(R~2=0.997),最低检测限为1.5μg/ml;该方法检测不同浓度DTT的平均相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均<5%;重组HPV疫苗原液分别加入3、5、10μg/ml的DTT对照品溶液后,经该方法检测的回收率在80%~120%之间。3批次重组HPV单价疫苗原液中的DTT含量均小于1.5μg/ml。结论本实验的RP-HPLC法专属性、精密性良好,且准确可靠,可用于重组HPV疫苗原液中DTT残留量的检测。     

人乳头瘤病毒(HPV)18型晚期蛋白L1 DNA疫苗的免疫原性及安全性

目的对HPV18型DNA疫苗的免疫原性和安全性进行初步评价。方法将HPV18L1基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建DNA疫苗质粒pcDNAL1。使用脂质体将重组质粒转染COS7细胞,用Westernblot检测体外瞬时表达的抗原。将重组质粒pcDNAL1肌肉注射BALBc小鼠(100μg只),加强免疫3次后分别采集血清,用ELISA法和Westernblot法检测抗体,实时荧光定量PCR法检测质粒的组织分布。采用ELISA法检测DNA疫苗免疫后抗核抗体和抗双链DNA抗体的效价。结果重组质粒可在真核细胞中有效地转录和表达HPV18L1蛋白。小鼠免疫后可检出较高滴度的抗HPV18L1抗体和特异条带。免疫后质粒主要分布在注射部位,且随着时间延长被清除;未检测到抗核抗体和抗双链DNA抗体。结论HPV18L1重组质粒可诱导小鼠产生特异的体液免疫反应,且该DNA疫苗是安全的,为进一步研制开发HPVDNA疫苗打下了基础。     

四川地区宫颈癌患者组织中部分高危HPV亚型感染及E6基因序列分析

目的调查四川地区宫颈癌患者组织中高危人乳头瘤病毒(HPV)33、52和58亚型的感染状况及E6基因突变特性,为制备适合中国人群的HPV疫苗提供流行病学资料。方法采用PCR技术,并结合基因测序分析。结果对四川地区2003~2004年60份宫颈癌患者癌组织DNA进行HPV检测,获得HPV52和HPV58亚型各4份,检出率为6·7%;HPV33亚型1份,检出率为1·7%。对所获得的各份HPV33、52和58E6基因测序,均有碱基突变。结论HPV52型感染率在四川地区相对较高。与GenBank标准株相比,四川地区发现的HPV33和HPV52E6基因有多处突变,与日本发现的HPV33和HPV52突变株相近。     

人乳头瘤病毒16型晚期蛋白L1基因重组MVA病毒的构建及鉴定

目的研制预防人乳头瘤病毒(HPV)感染的重组修饰的Ankara痘病毒(MVA)活载体疫苗。方法将HPV16L1基因插入MVA病毒转移载体psc11M2的P7·5启动子的下游,构建转移质粒psc11M2-L1,与MVA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组。通过9轮蓝斑筛选,以PCR和Westernblot鉴定重组病毒。结果获得的含目的片段的重组MVA病毒,表达产物与鼠抗人HPV16L1抗体发生阳性反应,目的蛋白相对分子质量约为55000。结论已成功地构建了可正确表达HPV16L1基因的重组MVA病毒株。     

人乳头瘤病毒18型L1蛋白在毕赤酵母中的表达及其病毒样颗粒的免疫原性

目的在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒18型(Human papilomavirus 18,HPV18)L1蛋白,纯化病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs),并检测其免疫原性。方法将含HPV18 L1基因的酵母表达质粒pHPV18 L1电转化毕赤酵母X-33,甲醇诱导表达,重组HPV18 L1蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析后,经离子交换层析、分子筛层析纯化,采用SEC-HPLC分析纯度;动态光散射和透射电镜分析粒径分布和结构;并通过小鼠半数有效剂量(ED50)和大鼠抗体滴度测定分析其免疫原性。结果 HPV18 L1蛋白在毕赤酵母中获得了有效表达,相对分子质量约为55 000,可与小鼠抗HPV18 L1单抗特异性结合;经纯化的HPV18 L1 VLPs纯度为99%,且颗粒大小均一,直径约50 nm;经吸附铝佐剂后,免疫小鼠的ED50为0.006 68μg;并可诱导大鼠产生较高的抗体滴度。结论 HPV18 L1可在毕赤酵母中高效表达并自动形成VLPs,该VLPs经纯化、吸附铝佐剂后具有良好的免疫原性,为工业化生产HPV18 L1疫苗奠定了基础。     

截短型人乳头瘤病毒58型L1蛋白在昆虫细胞中的表达

目的利用昆虫细胞杆状病毒表达系统构建含截短型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)58型主要衣壳蛋白L1基因的重组杆状病毒,并在Sf9细胞中表达。方法从NCBI中获得HPV 58 L1基因序列,应用Clustal X2软件进行序列比对后,确定相对保守的目的基因序列;人工合成HPV 58 L1基因片段,PCR法获得截短型HPV58 L1-1基因,克隆至p Fast Bac-1载体中,构建重组供体质粒p FB-HPV 58 L1-1,转化大肠埃希菌DH10Bac,构建重组Bacmid-HPV 58 L1-1,转染Sf9细胞,获得第1代(P1)重组杆状病毒BV-HPV 58 L1-1,扩增后采用快速滴定法测定病毒滴度;将重组杆状病毒感染Sf9细胞,表达HPV 58 L1-1蛋白,并进行Western blot分析和透射电镜观察。结果Bacmid-HPV 58 L1-1经PCR及测序鉴定构建正确;P2重组杆状病毒的滴度可达1.0×108 pfu/ml;HPV 58 L1-1在Sf9昆虫细胞中的表达产物经Western blot检测,可见相对分子质量约55 000的特异性反应条带,电镜观察可见L1蛋白自组装形成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)。结论成功在昆虫细胞中表达了HPV 58 L1-1蛋白,并自组装为VLPs,为预防型HPV疫苗的研究奠定了基础。     

人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1在大肠埃希菌中的表达

目的探讨在大肠埃希菌中不同因素对高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)L1蛋白表达的影响,为研发针对多型别HPV的低价、广谱疫苗奠定基础。方法通过采用非融合、不同融合蛋白形式,不同基因型HPV L1序列,以及同一基因型但不同序列特征等构建HPV L1非融合及融合表达重组质粒及HPV L1谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione-S-transferase,GST)融合表达质粒,转化不同宿主菌(大肠埃希菌DH5α、BL21),在不同的温度下(37、20℃)进行IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE分析融合蛋白的表达及其可溶性,Western blot鉴定表达的融合蛋白。结果 HPV 16 L1蛋白在GST融合蛋白形式下获得了高效表达,而非融合表达或硫氧还蛋白融合表达未见明显目的条带;不同的宿主菌未对GST融合蛋白表达水平产生明显影响;在37℃培养条件下,表达的GST融合蛋白以包涵体形式存在,而在20℃培养条件下,部分表达的蛋白以可溶性形式存在;HPV 16 L1基因不同序列获得了类似的表达水平;经酵母密码子优化的HPV 18 L1与HPV 58 L1基因均能以GST融合表达形式获得与HPV 16 L1相似的高效表达。结论在大肠埃希菌中以GST融合形式可获得多基因型别HPV L1蛋白的高效可溶性表达,为病毒样颗粒体外折叠制备奠定了基础,也为其他外源基因在大肠埃希菌中的高效表达提供了参考。     

人乳头瘤病毒预防性疫苗的研究进展

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤,严重威胁着女性健康及生命。在导致女性死亡的原因中,宫颈癌排第2位,世界范围内每年约有493 000例宫颈癌发生,其中273 000例死亡。流行病学数据显示,70%的宫颈癌与16、18两种人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)基因型有关。宫颈癌的发病率很高,且与HPV感染的相关性非常明确,因此大部分HPV疫苗集中在预防宫颈癌上。目前已上市的3种HPV疫苗可有效预防90%与宫颈癌有关的HPV感染。本文对全球市场上HPV疫苗的现状以及未来的发展方向作一综述。