牛Ⅱ型链球菌vanB2基因真核表达质粒的构建及其在宫颈癌HeLa细胞中的表达

目的构建牛Ⅱ型链球菌(Streptococcus bovis biotypeⅡ)van B2基因真核表达质粒,并在宫颈癌HeLa细胞中进行表达。方法以牛Ⅱ型链球菌基因组为模板,采用PCR法扩增van B2基因,克隆至真核表达载体pVAX-1中,构建重组表达质粒pVAX-1-van B2。采用FuGENE HD Transfection Reagent试剂盒将重组表达质粒转染HeLa细胞,转染48 h后,RT-PCR法检测转染细胞中van B2基因mRNA的转录;间接免疫荧光法和Western blot法检测转染细胞中van B2蛋白的表达。结果重组表达质粒pVAX-1-van B2经双酶切及测序鉴定构建正确;重组表达质粒转染HeLa细胞48 h后,荧光显微镜下可见绿色荧光表达,RT-PCR及Western blot分析分别可见570 bp及相对分子质量20 900的目的条带。结论成功构建了牛Ⅱ型链球菌van B2基因的真核重组表达质粒,并在HeLa细胞中成功表达。本实验为进一步研究牛Ⅱ型链球菌对抗生素的耐药性机制及其与van B2基因的相关性奠定了基础。     

瓣状内切核酸酶1基因重组真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建瓣状内切核酸酶1(Flap endonuclease 1,FEN1)基因重组真核表达质粒,并进行鉴定。方法提取L02细胞总RNA,逆转录合成cDNA,经巢式PCR扩增FEN1基因,定向克隆至载体pcDNA3.1,构建重组真核表达质粒,经酶切及测序进行鉴定。将鉴定正确的真核表达质粒转染293T细胞,Western blot检测FEN1蛋白的表达。结果 FEN1基因重组真核表达质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;在相对分子质量约47 000处可见目的蛋白条带,转染细胞中FEN1蛋白表达量较空载体转染组及空白细胞对照组提高约3倍。结论已成功构建了FEN1基因重组真核表达质粒,并可在293T细胞中过表达FEN1。     

牛干扰素γ蛋白在Vero细胞中的表达及其抗病毒活性

目的在Vero细胞中表达牛干扰素γ基因,并对其抗病毒活性进行鉴定。方法将牛干扰素γ全基因克隆至pcDNA3.1(+)载体,构建重组表达质粒,经PCR及双酶切鉴定,将鉴定正确的阳性质粒通过脂质体法转染Vero细胞,分别采用间接免疫荧光和Western blot法检测细胞转染效率和干扰素γ蛋白的表达,采用细胞病变抑制试验检测其抗病毒活性。结果间接免疫荧光显示绿色荧光,表明牛干扰素γ蛋白在Vero细胞中得到表达,转染效率约为50%;Western blot检测可见相对分子质量约为22 000的目的条带,进一步验证了该蛋白的表达;细胞病变抑制试验显示细胞病变明显减少,表明表达的干扰素γ蛋白具有明显的抗病毒活性。结论成功在Vero细胞中表达了牛干扰素γ蛋白,其具有明显的抗病毒作用。     

真核重组表达质粒pTT5-CTP-PTEN的构建及其在HEK 293-6E细胞中的表达

目的构建真核重组表达质粒pTT5-CTP-PTEN,并在HEK 293-6E细胞中进行表达。方法合成融合基因CTP-PTEN,定向克隆至真核表达载体pTT5中,构建重组表达质粒pTT5-CTP-PTEN,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒,进行双酶切及测序鉴定。在Lipofectamine 2000的介导下,将鉴定正确的重组表达质粒转染至HEK 293-6E细胞,Western blot法检测细胞中融合蛋白CTP-PTEN的表达。结果经双酶切及测序鉴定,证明重组表达质粒pTT5-CTPPTEN构建正确。转染48 h后,HEK 293-6E细胞中可见相对分子质量约49 700的CTP-PTEN融合蛋白条带。结论成功构建了重组质粒pTT5-CTP-PTEN,并于HEK 293-6E细胞中表达了CTP-PTEN融合蛋白。     

信号调节蛋白-α基因真核表达质粒的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建信号调节蛋白-α(signal regulatory protein-α,SIRP-α)基因真核表达质粒,并于A549细胞中进行表达。方法提取Hep G2细胞总RNA,RT-PCR扩增SIRP-α基因片段,克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)-EGFP中,构建真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP。将重组表达质粒转染A549细胞,转染24 h后,荧光显微镜下观察转染情况;转染48 h后,RT-PCR检测SIRP-α基因的转录水平;转染72 h后,Western blot法检测SIRP-α蛋白的表达。结果经双酶切和测序鉴定真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP构建正确;转染pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP的A549细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光;RT-PCR检测结果可见243 bp目的条带,Western blot检测显示SIRP-α存在。结论成功构建了真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP,并于A549细胞中有效表达,为进一步研究SIRP-α与肺癌的相关性奠定了基础。     

丙型肝炎病毒全基因重组质粒的构建及其转染细胞系的建立

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)全基因重组质粒,并建立其转染细胞系。方法双酶切质粒JFH1,回收HCVDNA,分别与真核表达载体pIRESneo和逆转录病毒载体pLNCX连接,构建重组质粒pIRESneo-HCV和pLNCX-HCV。将重组质粒pIRESneo-HCV转染BHK细胞,pLNCX-HCV转染pA317细胞,通过PCR、间接ELISA和免疫荧光试验鉴定转染细胞。结果重组质粒PCR和酶切鉴定证明构建正确。转染细胞上清经PCR检测均可见目的基因条带;ELISA结果表明,转染细胞冻融上清均可与抗HCV小鼠血清发生强的结合反应;转染细胞均可与抗HCV小鼠血清反应,产生荧光,但荧光不多且斑点不亮。结论已成功构建HCV全基因重组质粒,并建立了可表达HCV蛋白的转染细胞系,为转基因动物模型的建立奠定了基础。     

重组人降钙素原蛋白基因在sf9细胞中的表达

目的利用昆虫杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac system)在sf9细胞中表达重组人降钙素原蛋白(procalcitonin,PCT)。方法将PCT基因克隆至转移载体pFastBacTM1中,构建重组转移载体pFB-PCT,将其与野生型多角体病毒Bacmid同源重组,获得重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-PCT,采用脂质体转染法将鉴定正确的重组杆状病毒穿梭质粒转染sf9细胞,收获P1杆状病毒Bac-PCT,经扩增获得P3代杆状病毒,感染sf9细胞,Western blot法检测重组PCT的抗原活性。结果重组杆状病毒穿梭质粒经PCR及测序鉴定证明构建正确;已成功转染人sf9细胞,P3杆状病毒滴度为1.2×108pfu/ml;重组人PCT可被小鼠抗降钙素原单克隆抗体特异性识别,在相对分子质量约13 000处可见特异性条带。结论已在sf9细胞中成功表达重组人PCT,表达产物具有抗原性。     

高表达转录因子ZNF191基因的慢病毒颗粒的构建及鉴定

目的构建转录因子ZNF191基因的慢病毒颗粒,为进一步研究ZNF191的生物学功能及其在肿瘤基因治疗方面的应用奠定基础。方法从HEK293细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增ZNF191基因,亚克隆至pLVX-AcGFP-N1质粒中,经酶切及DNA测序鉴定正确后,将含有ZNF191基因的重组质粒pLVX-ZNF191结合辅助质粒转染HEK293T细胞,包装重组慢病毒,Western blot检测感染的293T细胞内ZNF191蛋白的表达。结果酶切及测序鉴定pLVX-ZNF191质粒构建正确,Western blot检测重组慢病毒能显著提高293T细胞的ZNF191蛋白表达水平。结论已成功构建了ZNF191基因重组慢病毒表达载体pLVX-ZNF191,为进一步研究ZNF191的生物学功能及肿瘤的基因治疗奠定了基础。     

miRNA-21对肺癌A549细胞抑癌基因PTEN表达的调控

目的探讨miRNA-21对肺癌A549细胞抑癌基因PTEN表达的调控作用。方法人工合成miRNA-21序列,插入到质粒pGenesil-1中,构建重组真核表达质粒,并转染至肺癌A549细胞,采用RT-PCR和Western blot分别检测细胞PTEN基因mRNA转录水平和蛋白的表达水平。结果经酶切和测序鉴定,表明重组真核表达质粒构建正确。转染重组真核表达质粒的A549细胞PTEN基因mRNA转录水平与未转染组相比,差异无统计学意义,蛋白表达水平较未转染组明显降低。结论miRNA-21可能主要在翻译水平调控PTEN基因的表达。     

中国流行株HIV-1Gag蛋白在重组鸡痘病毒的表达及鉴定

目的 以鸡痘病毒为载体,表达ＨＩＶ－１　Ｇａｇ蛋白,进而研制ＡＩＤＳ疫苗。方法 以鸡痘病毒２８２Ｅ４株 非必需区ＴＫ基因为侧翼,插入ＶＶ突变型Ｐ７．５串联启动子和牛痘病毒Ａ包涵体晚期启动子与２０个串联的突变型 早期痘苗病毒Ｐ７．５启动子组成复合启动子及ＬａｃＺ报告基因构建重组表达质粒ｐＵＴＡＬ。在ＡＴ１－Ｐ７．５复合启动子 下游,插入编码中国流行株 ＨＩＶ－１　Ｇａｇ基因（Ｂ亚型）,构建了重组表达质粒ｐＵＴＡＬ－Ｇａｇ。重组质粒Ｇａｇ与ＦＰＶ共 转染ＣＥＦ细胞,进行同源重组。通过ＢＵｄＲ加压筛选,Ｘ－ｇａｌ染色,获得重组鸡痘病毒ｖＵＴＡＬＧ,用于感染ＢＨＫ细胞 并免疫小鼠。结果　经Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测,重组病毒表达了Ｇａｇ蛋白相对分子质量分别为５５０００、４８０００、２４０００和 １７０００,为Ｇａｇ蛋白的Ｐ５５、Ｐ４８、Ｐ２４和Ｐ１７蛋白。重组病毒免疫小鼠可诱导产生特异性抗体。结论　所重组的病毒 成功地表达了目的蛋白并进行了正确加工。     

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Vasostatin的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Vasostatin并检测其在真核细胞内的表达水平。方法将带有信号肽的Vasostatin基因片段克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析证明构建成功后,以脂质体介导法转染293T细胞,通过Westernblot法,检测其在293T细胞内的表达水平。结果所构建的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Va-sostatin转染293T细胞后,在其裂解的上清液中,检测到目的基因的表达。结论已成功构建了pcDNA3.1(+)-Vasostatin表达载体,并在真核细胞中表达了目的蛋白。     

HIV-1 DNA疫苗的构建及免疫原性

目的构建稳定表达HIV-1Gag-Pol蛋白的DNA疫苗,提高目的基因的表达效率。方法对HIV-1野生型Gag-Pol基因序列进行优化,使用本室构建的表达载体VR,构建重组质粒VR-GPCINS。将构建的重组质粒VR-GPCINS转染HEK293细胞,Western blot鉴定表达产物。用构建的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,Western blot检测体液免疫反应。结果成功构建能稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的VR-GPCINS质粒,Western blot在免疫小鼠的血清中检测到抗p24的特异性抗体。结论含优化Gag-Pol基因序列的质粒DNA疫苗VR-GPCINS在细胞表达和体液免疫方面均明显优于含野生型Gag-Pol基因序列的质粒DNA疫苗VR-GP。     

人黏蛋白1串联重复区基因真核表达载体的构建及其在动物细胞中的表达

目的构建人黏蛋白1串联重复区(MUC1 VNTR)17重复序列肿瘤抗原真核表达载体,并在COS-7、HeLa和Lewis细胞中表达。方法设计1对分别含SalⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,PCR法合成1重复MUC1 VNTR片段,克隆入pGEM-Teasy载体,依据SalⅠ和XhoⅠ酶切产生相同黏性末端的特性,依次连接,构建17重复MUC1 VNTR(17m),再亚克隆至VR1012真核表达载体,构建真核表达质粒VR1012-17m。分别转染COS-7、HeLa和Lewis细胞,并进行检测。结果酶切鉴定和序列分析证实,构建的重组质粒含17m序列,经转染的COS-7、HeLa和Lewis细胞,RT-PCR检测均有17m mRNA转录,Western blot检测均有17m蛋白的表达,并与MUC1 VNTR单抗产生特异性反应。结论已成功构建17m肿瘤抗原真核表达载体,并在COS-7、HeLa和Lewis细胞中得到表达,可用于MUC1疫苗和肿瘤生物学治疗的进一步研究。     

人源阳离子抗菌肽hCAP-18真核表达载体的构建与表达

目的构建人源性阳离子抗菌肽hCAP-18的真核表达载体pcDNA4/Myc-His-hCAP-18,转染真核细胞,并检测其表达。方法以正常人外周血中性粒细胞的总RNA为模板,用RT-PCR技术钓取hCAP-18编码序列的全长cDNA,并克隆至pcDNA4/Myc-His真核表达载体上,转染真核细胞株HeLa。RT-PCR及Western blot方法检测目的基因的表达。结果所构建的真核表达载体pcDNA4/Myc-His-hCAP-18,经酶切鉴定所释放片段大小与预期相符,基因序列与GenBank上登录的序列一致,目的基因在转染细胞中获得高水平表达。结论已成功构建真核表达载体pcDNA4/Myc-His-hCAP-18,并在转染细胞中高效表达。     

牛坏死杆菌43K OMP单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备牛坏死杆菌43KOMP单克隆抗体,并鉴定其生物学特性.方法 经IPTG诱导表达重组43KOMP,纯化后免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗43K OMP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗43K OMP单克隆抗体进行效价、亚类、免疫原性及特异性鉴定.结果 获得3株稳定表达抗43...     

Lipocalin-2基因表达产物对人胚肾细胞增殖的影响

目的构建Lipocalin-2(Lcn-2)基因真核表达质粒PL-2,并检测其及前期原核表达的重组Lcn-2蛋白对人胚肾细胞HEK293增殖的影响。方法利用RT-PCR从鼠巨噬细胞RAW264.7中扩增Lcn-2基因,克隆入真核表达质粒pEGFP-C1中,构建重组质粒PL-2。转染HEK293细胞,通过荧光观察和RT-PCR鉴定Lcn-2基因的表达。将重组质粒PL-2和前期原核表达的重组Lcn-2蛋白作用于HEK293细胞,通过MTT法检测细胞增殖情况,Westernblot法检测细胞增殖核抗原(PCNA)的表达。结果重组真核表达质粒PL-2经酶切和测序鉴定,证明构建正确。经荧光观察和RT-PCR鉴定,转染重组质粒PL-2的HEK293细胞中有Lcn-2基因的表达。加入重组Lcn-2蛋白后,HEK293细胞较对照组明显增殖,细胞中PCNA的表达也较对照组明显升高,而重组质粒PL-2对HEK293细胞增殖以及细胞中PCNA的表达均无影响。结论已成功构建了Lcn-2基因真核表达质粒,其对HEK293细胞的增殖无影响,而原核表达的重组Lcn-2蛋白对HEK293细胞的增殖有一定的促进作用,推测Lcn-2基因的表达产物可能通过与细胞膜受体结合促进HEK293细胞的增殖。     

HIV-1表面糖蛋白gp120 DNA疫苗质粒的构建与表达

目的 构建含HIV-1表面糖蛋白基因的真核表达质粒,并在Hela细胞内表达。方法 在核酸疫苗载体质粒 pVAX1中插入gp120基因,构建真核表达质粒pVAXGP。在体外用脂质体法将重组质粒转染Hela细胞,并用间接免疫荧光试验、免疫印迹试验和Dot-ELISA对表达产物进行检测。结果 间接免疫荧光试验结果显示,转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。免疫印迹试验和Dot-ELISA结果均显示,重组质粒转染细胞的裂解物中存在表达的gp120蛋白。结论 已成功地构建了真核表达质粒,且表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性。