人叉头转录因子O亚型3基因重组表达质粒的构建及鉴定

目的构建人叉头转录因子O亚型3(forkhead box class O3,FOXO3)基因重组表达质粒,并检测其在人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的表达。方法利用3对引物从人cDNA中分别扩增大小为382、829和891 bp的3个目的片段,胶回收后进行拼接,获得hFOXO3的CDS片段,与pcDNA3.1(+)载体连接,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-hFOXO3,转染人PBMC,采用Real-time PCR和Western blot分别检测hFOXO3基因mRNA水平及蛋白表达水平。结果重组表达质粒经双酶切及测序证实构建正确;转染PBMC后,pcDNA3.1(+)-hFOXO3组hFOXO3基因mRNA的水平分别为转染试剂对照组和pcDNA3.1(+)组的2 599.7和2 377.8倍,且差异均有统计学意义(P0.001);pcDNA3.1(+)-hFOXO3组hFOXO3蛋白的表达水平分别为转染试剂对照组和pcDNA3.1(+)组的2和1.8倍,且差异均有统计学意义(P0.01);而转染试剂对照组和pcDNA3.1(+)组间hFOXO3基因mRNA水平和蛋白的表达水平差异均无统计学意义(P0.05)。结论成功构建了pcDNA3.1(+)-hFOXO3重组表达质粒,其在人PBMC中能进行hFOXO3基因mRNA的转录及蛋白的表达,为进一步研究hFOXO3的生物学功能及其作用机制奠定了基础。     

人Rac1基因shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的构建人Rac1基因shRNA表达质粒,为提高卵巢癌放化疗的敏感性奠定基础。方法根据GenBank中登录的人Rac1基因序列,应用shRNA设计软件设计并合成用于构建shRNA表达质粒的oligo DNA,构建shRNA重组质粒。将阳性Rac1基因shRNA重组质粒经脂质体介导转染卵巢癌Skov3细胞,48 h后经RT-PCR筛选有效的shRNA重组质粒。结果经限制性内切酶BamHⅠ和PstⅠ酶切鉴定出阳性Rac1基因shRNA重组质粒,序列比对分析结果与理论序列完全一致。RT-PCR检测显示,转染pGPU6/GFP/Rac1-524的Skov3细胞Rac1基因mRNA的转录水平下降。结论已成功构建人Rac1基因shRNA表达质粒,并筛选出有效的干扰质粒pGPU6/GFP/Rac1-524。     

人泛素特异性蛋白酶42在肿瘤组织中的表达及其shRNA干扰重组质粒的构建

目的 评价人泛素特异性蛋白酶42(ubiquitin-specific protease 42,USP42)在不同肿瘤组织中的表达水平,并构建其shRNA干扰重组质粒。方法 通过网络数据库GEPIA和Ualcan分析USP42在不同肿瘤组织中的表达水平。以人USP42 mRNA为靶序列设计合成含有shRNA序列的寡核苷酸,克隆至真核表达载体pGPU6/Neo,构建重组质粒USP42-shRNA。采用Neofect^?DNA转染试剂将重组质粒转染至人结肠癌细胞HCT116(干扰组),同时设对照组(转染NC-shRNA),Western blot法检测USP42表达的干扰效果,Transwell小室试验检测USP42对结肠癌细胞迁移和侵袭功能的影响。结果 经GEPIA和Ualcan数据库分析发现,USP42在胆管癌、胃癌、胸腺癌和结肠癌等肿瘤组织中呈高表达。测序鉴定证明重组质粒USP42-shRNA构建正确。与对照组比较,干扰组HCT116细胞中USP42蛋白表达水平明显降低(t=16.97,P <0.001),且能显著抑制HCT116细胞的侵袭和迁移能力(t分别...     

人Makorin环指蛋白1基因shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建人Makorin环指蛋白1(MKRN1)基因shRNA真核表达质粒,并检测其对HEK293细胞MKRN1基因表达的影响。方法设计并合成特异性针对人MKRN1基因的小干扰片段,定向克隆至带有卡那霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切鉴定及DNA序列分析,并用脂质体将其转染到HEK293细胞中,观察其对细胞MKRN1基因mRNA转录和蛋白表达水平的影响。结果经酶切鉴定和序列分析证明,3个人MKRN1基因shRNA真核表达质粒及其阴性对照质粒构建正确,转染HEK293细胞后,3个shRNA真核表达质粒在mRNA水平对细胞MKRN1基因的抑制率分别为52.4%、26.2%和42.9%,在蛋白水平对细胞MKRN1基因的抑制率分别为69.1%、27.9%和50.0%。结论已成功构建了人MKRN1基因的shRNA真核表达质粒,为进一步研究MKRN1基因的功能及其与人端粒酶逆转录酶的关系奠定了基础。     

稳定表达人MCPH1基因shRNA的宫颈癌Caski细胞系的建立

目的建立稳定表达人MCPH1基因shRNA的宫颈癌Caski细胞系,并观察shRNA对Caski细胞中MCPH1基因表达的影响。方法将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSUPERRetro中,构建携带人MCPH1基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER-shRNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生重组逆转录病毒,感染宫颈癌细胞株Caski,经puromycin筛选稳定的细胞克隆,实时荧光定量PCR和Westernblot法检测细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确;逆转录病毒感染Caski细胞后可筛选出稳定的细胞克隆;pSUPER-shRNA-MCPH1组细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平明显低于阴性对照组及正常对照组。结论已成功建立了稳定表达人MCPH1基因shRNA的Caski细胞系,shRNA能明显抑制MCPH1基因的表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

人干扰素λ1基因启动子荧光素酶报告基因质粒的构建及其转录活性分析

目的构建人干扰素λ1(interferonλ1,IFNλ1)基因启动子荧光素酶报告基因载体,并探讨仙台病毒及质粒IRF3-5D和HA-IRF7对其转录活性的影响。方法提取BEAS-2B细胞基因组DNA,以其为模板,PCR扩增IFNλ1基因启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-enhancer,构建IFNλ1基因启动子荧光素酶报告基因质粒IFNL1-luc,将其转染293T细胞,同时用质粒IFNβ-luc和pGL3-enhancer转染作为对照。转染24 h后感染仙台病毒,于感染前和感染后4、12、18和24 h收集细胞,进行双荧光素酶活性检测;用质粒IRF3-5D或HA-IRF7与质粒IFNL1-luc共转染,36 h后收集细胞,进行双荧光素酶活性检测。结果 IFNλ1基因启动子荧光素酶报告基因质粒IFNL1-luc经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;分别转染质粒IFNL1-luc和IFNβ-luc的细胞感染仙台病毒后,荧光素酶活性倍数均随时间延长呈明显上升趋势,至18 h达到峰值(分别为1 000倍和2 300倍),转染质粒pGL3-enhancer的细胞感染仙台病毒后,不同时间点收集的细胞,荧光素酶活性倍数一直处于较低水平;质粒HA-IRF7或IRF3-5D对IFNL1-luc的活化倍数明显高于pGL3-enhancer(P0.05)。结论成功构建了IFNλ1基因启动子荧光素酶报告基因质粒IFNL1-luc,仙台病毒及质粒IRF3-5D和HA-IRF7均能激活IFNL1-luc的转录,为进一步研究调控IFNλ1表达的信号转导通路奠定了基础。     

JTV1基因真核表达质粒的构建及其在K562细胞中的表达

目的 构建JTV1基因真核表达质粒并稳定转染人白血病细胞系K562,检测转染细胞中JTV1基因mRNA和蛋白的表达水平及其对K562细胞增殖的影响。方法从人外周血单个核细胞中克隆JTV1基因,并将其插入pcDNA3.1表达载体中,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1-JTV1,经脂质体介导转染K562细胞,采用RT-PCR和Western blot法鉴定转染细胞中JTV1基因mRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测JTV1稳定表达对K562细胞增殖的影响。结果重组表达质粒pcDNA3.1-JTV1经双酶切及测序证实,目的基因已插入质粒中;人JTV1基因能在K562细胞中稳定表达;JTV1具有抑制K562细胞增殖的作用。结论已成功构建了JTV1基因真核表达质粒,并获得了稳定表达人JTV1基因的K562细胞克隆,为进一步研究人JTV1基因的功能及其与白血病细胞增殖及凋亡的相关性提供了细胞模型。     

FOXC1蛋白基因shRNA干扰质粒对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

目的探讨FOXC1蛋白基因RNA干扰质粒对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。方法采用RT-PCR及Westernblot法检测SGC-7901细胞和胃黏膜上皮细胞GES-1中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。构建3个FOXC1基因shRNA真核表达质粒pshRNA-FOXC1a、pshRNA-FOXC1b、pshRNA-FOXC1c,分别转染SGC-7901细胞,并设pGenesil-1空质粒转染组和未转染的细胞对照组,RT-PCR及Western blot法分别检测转染细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;MTT法检测转染细胞的增殖活力;流式细胞术检测转染细胞的细胞周期。结果 SGC-7901细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均显著高于GES-1细胞(P<0.05)。pshRNA-FOXC1a组、pshRNA-FOXC1b组和pshRNA-FOXC1c组SGC-7901细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均显著低于pGenesil-1组和SGC-7901组(P<0.01);细胞增殖抑制率显著高于pGensil-1组(P<0.05)。处于G1、G2期的细胞比例显著高于SGC-7901组(P<0.01),S期细胞比例显著低于SGC-7901组(P<0.01)。结论成功构建了FOXC1蛋白基因shRNA真核表达质粒。FOXC1在胃癌细胞SGC-7901中呈高表达,抑制其表达后,细胞周期被阻滞在G1～G2期,细胞增殖受到抑制。     

小鼠Fancd2os基因真核表达质粒的构建及其对人胚肾上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的构建小鼠Fancd2os基因的真核表达质粒,并分析Fancd2os基因对人胚肾上皮细胞(HEK293T)增殖和凋亡的影响。方法以小鼠睾丸组织DNA为模板扩增Fancd2os基因c DNA全长片段,并克隆至真核表达载体p3×FLAG-CMV-14,构建重组真核表达质粒p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os。经Lipofectamine TM 2000将重组真核表达质粒瞬时转染HEK293T细胞,分别采用RT-PCR及Western blot法检测转染细胞中Fancd2os基因m RNA转录及蛋白表达情况;经CCK8法和流式细胞术分别检测过表达Fancd2os对HEK293T细胞增殖能力及紫外线诱导HEK293T细胞凋亡的影响。结果经双酶切及测序鉴定,重组真核表达质粒p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os构建正确;转染p3×Flag-CMV-14-Fancd2os的HEK293T细胞可见Fancd2os基因m RNA转录及其蛋白表达;过表达Fancd2os的HEK293T细胞的增殖活性显著下降(P0.05);过表达Fancd2os可显著促进紫外线诱导的HEK293T细胞凋亡(P0.01)。结论成功构建了重组真核表达质粒p3×Flag-CMV-14-Fancd2os,过表达Fancd2os可抑制HEK293T细胞的增殖,促进其凋亡。     

瓣状内切核酸酶1基因重组真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建瓣状内切核酸酶1(Flap endonuclease 1,FEN1)基因重组真核表达质粒,并进行鉴定。方法提取L02细胞总RNA,逆转录合成cDNA,经巢式PCR扩增FEN1基因,定向克隆至载体pcDNA3.1,构建重组真核表达质粒,经酶切及测序进行鉴定。将鉴定正确的真核表达质粒转染293T细胞,Western blot检测FEN1蛋白的表达。结果 FEN1基因重组真核表达质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;在相对分子质量约47 000处可见目的蛋白条带,转染细胞中FEN1蛋白表达量较空载体转染组及空白细胞对照组提高约3倍。结论已成功构建了FEN1基因重组真核表达质粒,并可在293T细胞中过表达FEN1。     

靶向Pin1基因的shRNA干扰质粒的构建及其对大肠癌SW620细胞Pin1基因的抑制作用

目的构建靶向Pin1基因的短发夹RNA(shRNA)干扰真核表达质粒,并检测其对大肠癌SW620细胞Pin1基因的抑制作用。方法设计合成特异性针对人Pin1基因的寡核苷酸序列,退火后与pGenesil-1载体连接,构建靶向Pin1基因的shRNA真核表达质粒pGenesil-1-Pin1(+),利用脂质体转染大肠癌SW620细胞,以质粒pGenesil-1-Pin(-)转染细胞和未转染细胞为对照。利用荧光显微镜观察转染后细胞表达的绿色荧光蛋白,估算转染效率;应用实时荧光定量PCR和Western blot检测其对SW620细胞Pin1基因mRNA转录及蛋白表达的影响。结果所构建的特异Pin1shRNA真核表达质粒经酶切及测序证明构建正确,转染SW620细胞的转染效率为64%。shRNA对SW620细胞Pin1基因mRNA的抑制率在转染后72h最高,为70.2%,蛋白抑制率为60%。结论已成功构建了靶向Pin1基因的shRNA干扰真核表达质粒,可抑制SW620细胞Pin1基因mRNA的转录及蛋白的表达。     

神经纤毛蛋白1基因RNA干扰质粒对胃腺癌细胞SGC7901增殖和凋亡的影响

目的探讨神经纤毛蛋白1(Neuropilin1,NRP1)基因RNA干扰质粒对胃腺癌细胞SGC7901增殖和凋亡的影响。方法构建NRP1基因特异性shRNA表达质粒,经脂质体介导转染入人胃腺癌SGC7901细胞。采用Western blot法检测细胞中NRP1蛋白的表达水平,应用流式细胞术和Annexin-V-FITC/PI法检测细胞的增殖水平和凋亡率。结果经酶切及测序鉴定证明,shRNA-NRP1质粒构建正确,转染SGC7901细胞48h后,能有效抑制NRP1蛋白的表达,G0/G1期细胞百分比显著升高,S期细胞显著减少,细胞凋亡率增加。结论 shRNA-NRP1质粒能有效抑制胃腺癌SGC7901细胞株NRP1蛋白的表达,细胞周期阻滞在G0/G1期,从而降低细胞的增殖水平,诱导细胞进入凋亡期。     

血管内皮生长因子受体3和神经纤毛蛋白2对胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨分别阻断和联合阻断血管内皮生长因子受体3(Vascular endothelial growth factor receptor 3,VEGFR3)及神经纤毛蛋白2(Neuropilin 2,NRP2)基因的表达对人胃癌SGC-7901细胞株增殖和凋亡的影响。方法将SGC-7901细胞株分为3大组,VEGFR3阻断组、NRP2阻断组和VEGFR3+NRP2阻断组,各大组中又包含空白对照组、脂质体转染组、无义链转染组(NSODN组)和不同浓度反义链转染组(ASODN组)。转染后的各组SGC-7901细胞株经RT-PCR法检测VEGFR3-mRNA及NRP2-mRNA的转录水平。分别采用MTT法和流式细胞术检测细胞的增殖和凋亡情况。结果反义链转染组VEGFR3-mRNA和NRP2-mRNA的转录水平明显低于其各自的空白对照组、脂质体转染组和NSOND组,表明该组成功阻断基因VEGFR3和NRP2的表达。各组细胞的增殖和凋亡情况差异有统计学意义(P<0.05),并呈剂量和时间依赖性。在相同条件下,单独转染VEGFR3-ASODN组对胃癌细胞增殖的抑制及促凋亡作用优于单独转染NRP2-ASODN组,而联合转染组对细胞增殖的抑制及促凋亡作用最明显。结论阻断VEGFR3基因的表达对细胞增殖凋亡的影响大于阻断NRP2基因,联合阻断两个基因的表达,对细胞增殖和凋亡的影响明显大于单独阻断组。     

人C-反应蛋白重组真核表达质粒的构建及其对人脐静脉内皮细胞LOX-1和TF表达的影响

目的构建人C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)重组表达质粒pTracer CMV2-CRP,并观察其在人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelical cells,HUVEC)中的表达及其对凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(Lectin-type oxidizedLDL receptor-1,LOX-1)、组织因子(Tissue factor,TF)表达的影响。方法以质粒pCR-BluntⅡ-TOPO-CRP为模板,PCR扩增CRP基因CDS序列,克隆至pTracer CMV2载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α,构建重组表达质粒pTracer CMV2-CRP,转染HUVEC,设实验组(转染pTracer CMV2-CRP)、阴性对照组(转染pTracer-CMV2)及正常对照组,各组细胞经G418抗性筛选,RT-PCR及Western b1ot检测CRP基因的过表达效应及CRP的表达对HUVEC中LOX-1和TF转录及蛋白水平的影响。结果重组真核表达质粒pTracer CMV2-CRP经双酶切鉴定及测序证明构建正确。实验组细胞中,CRP基因过表达,且LOX-1和TF基因的转录及蛋白水平明显高于正常对照组和阴性对照组(P<0.05)。结论已成功构建人CRP基因重组真核表达质粒pTracerCMV2-CRP,并在HUVEC中过表达CRP,且明显上调HUVEC中LOX-1和TF的表达,为进一步阐述CRP在动脉粥样硬化形成过程中的作用提供了新的实验依据。     

Alpha 1 Antitrypsin Regulates Trophoblast Syncytialization and Inflammatory Factor Expression

The serine protease inhibitor alpha1-antitrypsin (A1AT) may possess protective functions of impaired organs in a manner independent of its protease inhibitor activity. A1AT expression has been shown to fluctuate in patients with pregnancy-induced hypertension, which suggests that A1AT may play a role in the syncytialization of villous trophoblasts. A1AT expression was knocked down in primary trophoblasts. RNA was extracted from these cells and subjected to RNA-sequencing analysis to determine the levels of expression of markers of syncytialization and inflammation. In addition, A1AT protein was localized in trophoblastic cells in placental tissues. Knockdown of A1AT upregulated the expression of FOSL1 and markers of syncytialization, as well as cell fusion, whereas overexpression of A1AT had the opposite effects. FOSL1 overexpression stimulated syncytialization, similar to the effects of A1AT knock down. Inhibitors of p38MAPK and JNK reduce the expression of inflammatory factors, whereas a p38MAPK inhibitor suppressed FOSL1 expression. Collectively, these findings indicated A1AT may negatively regulate inflammatory responses by controlling the activation of p38MAPK and JNK, and that p38MAPK mediates trophoblast syncytialization by altering FOSL1 expression. Therefore, a dysfunction in A1AT could be responsible for abnormal placental formation and pregnancy-associated disorders.