轮状病毒LLR疫苗株VP7基因的遗传变异研究

目的研究轮状病毒(RV)LLR疫苗株VP7基因的遗传特征,为疫苗的质量控制和发展提供依据。方法将LLR株轮状病毒毒种LLR38在原代牛肾细胞上连续传至49代。提取第38、43、44、49代病毒RNA。通过RT-PCR扩增VP7基因片段,将其克隆入质粒pGEM-T中,进行序列测定与分析。结果LLR株VP7基因全长1062bp,含编码326个氨基酸的单一的开放读码框架(ORF)。各代次病毒的VP7基因核苷酸与推导的氨基酸变化完全一致,与GenBanK中LLR参考株(L11602)同源性分别为99.9%和99.7%。与14株G10血清型RV毒株之间,核苷酸与推导的氨基酸序列同源性分别为84.3%～87.4%和92.7%～94.9%;与不同血清型RV代表株间,VP7基因核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为62.2%～76.8%和72.9%～83.1%;在A、B、C3个重要抗原表位,LLR株与同一血清型RV代表株B223氨基酸同源性高达97.5%,而与不同血清型仅为42.5%～62.5%。结论轮状病毒LLR疫苗株VP7基因具有良好的遗传稳定性,与来自不同国家同一型别的RV株VP7蛋白氨基酸序列之间无明显差异,在遗传上密切相关,从VP7基因分子水平证明LLR株毒种及其制备的疫苗是安全可靠的。     

悬浮Vero细胞快速扩增轮状病毒

目的探讨在悬浮Vero细胞中快速扩增轮状病毒(RV)的方法。方法 Vero细胞经消化后,直接接种KMG1b7株RV。采用微量滴定法、PAGE和RT-PCR等方法比较悬浮扩增、静置培养及微载体发酵培养RV的感染性滴度、基因组核酸带型和型特异VP7基因序列;采用电镜观察和Westernblot鉴定悬浮扩增RV的形态及结构蛋白的抗原性。结果悬浮细胞扩增的RV接种24h后病毒感染性滴度达峰值,为6.00lgCCID50/ml;而静置培养和微载体发酵培养分别在接种后(96±24)h和(48±6)h达峰值,分别为(6.00±0.25)lgCCID50/ml和(6.50±0.25)lgCCID50/ml。悬浮扩增的RV基因组呈典型的4-2-3-2G1血清型带型,G1型特异基因VP7序列未发生突变。悬浮扩增的RV形态和结构蛋白的抗原性未发生改变。结论在悬浮Vero细胞中扩增RV可以缩短病毒制备周期,提高病毒收获量,有利于RV疫苗的研制或生产。     

狂犬病病毒PV-2061株基因序列测定及其抗原性和免疫原性分析

目的测定狂犬病病毒(rabies virus,RV)PV-2061株全基因组序列,并分析其抗原性及免疫原性。方法 RTPCR法对RV PV-2061株基因组进行分段扩增,分别克隆至p MD18-T Simple Vector,转化感受态E.coli TOP10,挑取阳性克隆,进行测序。应用DNAstar Meg Align软件对测序结果进行拼接和分析;ELISA法检测PV-2061株的抗原性;用主种子批毒种制备的原疫苗免疫小属,检测PV-2061株的免疫原性。结果 RV PV-2061株的基因组全长11 932 bp,由3′端至5′端依次排列着N、P、M、G、L 5个结构基因,每个基因由3′端到5′端的非编码区及中间的编码区构成。与Gen Bank中已知全基因组序列的毒株比较,基因组前端3′先导序列和N基因的非编码区均无长度变化,从P基因开始,基因非编码区的长度开始出现差异,导致各毒株基因组长度不同。RV PV-2061株的抗原值为7.46 IU/ml;主种子批毒种制备原疫苗保护指数为1 585。结论确定RV PV-2061株全基因组序列为基因1型,且具有RV特有的抗原性和良好的免疫原性,为狂犬病疫苗的设计和毒株的筛选提供了实验依据。     

口服Ⅰ型Ⅲ型脊髓灰质炎减毒活疫苗的稳定性

目的考察口服Ⅰ型Ⅲ型脊髓灰质炎减毒活疫苗在不同温度和pH环境下的稳定性。方法将6批疫苗分别于2～8℃放置6个月、22～25℃放置7 d、37℃放置7 d、-20℃放置27、30、33个月,或反复冻融5次;将疫苗pH调至3. 0～10. 0。采用细胞培养半数感染量(cell culture infective dose 50%,CCID50)法检测病毒总滴度及分型滴度。结果口服二价脊髓灰质炎减毒活疫苗在2～8℃保存6个月,22～25℃保存5 d,37℃保存2 d,反复冻融5次,-20℃保存27个月,pH 3. 0～10. 0环境下,疫苗效力均符合质量标准。结论疫苗的保存温度及时间对其稳定性均有影响。     

柯萨奇病毒A组16型免疫原性及毒株间交叉保护能力的比较分析

目的对柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus groups A type 16,CoxA16)4个毒株进行免疫原性及毒株间交叉保护能力的比较分析。方法提取CoxA16 G20、KM/M08、MY08和KM208病毒RNA,PCR扩增VP1基因,并进行测序;利用MEGA4.0软件中Bootstrap Test of phylogeny→Neighbor-joining方法对13株CoxA16基于VP1基因全序列构建CoxA16种系进化树并进行基因分型,使用DNAMAN软件对4个毒株VP1核苷酸序列的同源性及其蛋白质氨基酸序列差异位点进行分析。分别用纯化灭活后的4株CoxA16免疫BALB/c小鼠,于初次免疫和二次免疫后的第14、28天采血,分离血清,Western blot法检测G20毒株免疫的小鼠血清中抗体的的特异性;微量中和试验法检测血清中和抗体效价并进行交叉中和试验。结果 G20、MY08和KM208毒株属于B2b基因型,而KM/M08毒株属于B2a基因型;4个毒株间VP1基因核苷酸序列的同源性为91.8%～99.0%;MY08与其他3个毒株相比,在VP1的第102位(N→D)、241位(E→K)和248位(T→A)上存在3个差异氨基酸位点。G20毒株的抗血清可特异识别CoxA16的VP1和VP2蛋白,具有良好的免疫原性;各实验组二次免疫后第28天中和抗体效价均高于其他检测时期,其中MY08组中和抗体效价明显低于其他3组,差异有统计学意义(P﹤0.01);G20、KM/M08、和KM208毒株间的交叉保护能力优于MY08毒株对G20、KM/M08和KM208毒株的交叉保护能力,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 4株CoxA16灭活后均能诱导机体产生相应的中和抗体和交叉保护能力,其中G20、KM/M08和KM208毒株在灭活后,显示了更好的免疫原性和毒株间交叉保护能力。     

我国流行的4株狂犬病街毒株G基因序列及分子流行病学研究

目的探讨我国流行的狂犬病毒(RV)基因差异,评价现有疫苗的适用性。方法通过RT-PCR并对其产物测序后获得4株RV街毒株的G基因序列以及G与M和L基因的区间序列。利用计算机分析软件比较4株RV与已经发表的毒株的核苷酸和推导的氨基酸序列。结果糖蛋白(GP)完整的编码基因序列长度为1575 bp。GP氨基酸序列同源性明显高于相应的核苷酸序列(除Mokola外),4株街毒与CTN的同源性高于aG株。GP不同区段比较显示,膜外区同源性高于膜内区。G-M区间核苷酸序列长度为5 bp;除广西4外,其余毒株100％同源。GL区间核苷酸序列长度为2,4 bp,越1与肥东同源性为100％。结论4株RV均属于基因I型。广西的毒株之间存在不同的来源。街毒与疫苗株之间基因存在差异。4株RV与SAD-B19进化途径相近,与PV株相差较远。越1与肥东株亲缘关系极近,可能是由同一毒株演化而来。     

新分离5株狂犬病病毒街毒株N和G基因的序列分析

目的分析我国新分离的5株狂犬病病毒(RV)街毒株基因序列及分子流行病学状况。方法采用RT-PCR法从疑似狂犬的犬脑组织内获得N和G基因cDNA的全序列并进行测序,将所得结果与已发表的国内外代表性毒株相应基因进行核苷酸和推导氨基酸序列比较。结果5株均含有完整N基因序列,3株含有完整G基因序列。与国内外发表的部分毒株比较,5株街毒N基因的核苷酸同源性在98.1%～99.9%之间,推导氨基酸同源性在99.5%～100%之间。将5株街毒与人用疫苗株3aG、PV株的N基因进行比较,核苷酸同源性在86.2%～86.7%之间,氨基酸同源性在95.1%～95.5%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在89.4%～89.6%之间,氨基酸同源性在98.2%～98.6%之间。3株街毒G基因的核苷酸同源性在98.5%～99.4%之间,推导氨基酸同源性在99.6%～100%之间。将3株街毒与人用疫苗株aG、PV和兽用疫苗株ERA的G基因进行比较,核苷酸同源性在82.8%～83.1%之间,氨基酸同源性在88.0%～90.1%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在86.7%～87.1%之间,氨基酸同源性均为92.0%。结论新分离街毒株基因未发生较大变异,与CTN的同源性高于与aG株和PV株。     

抗轮状病毒LLR株G10血清型特异性单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗轮状病毒(RV)LLR株G10血清型特异性单克隆抗体,并鉴定其特性。方法以纯化的RVLLR株(血清型为G10)为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术筛选分泌G10血清型特异性单抗的杂交瘤细胞株。采用层析法纯化单抗,常规免疫学方法鉴定单抗的特性。结果经筛选获得5G5、1H1和7F6共3株可稳定分泌高效价且具有G10血清型特异性单抗的杂交瘤细胞株。3株细胞分泌的单抗分别为IgG2a/κ、IgG2a/κ和IgG1/κ型;腹水效价均可达1.024×106;分别识别两个抗原位点;相对亲和力依次为1H1﹥7F6﹥5G5;5G5和1H1(细胞上清)均与G1～G4和G6血清型RV抗原无交叉反应;3株杂交瘤细胞分泌的单抗均识别相对分子质量约为34000的VP7蛋白,且均有不同程度的中和活性。结论已成功制备了抗RVLLR株G10血清型特异性单抗,该单抗可用于G10血清型RV的分型检测或LLR毒株的鉴别。     

甲型肝炎减毒活疫苗新疫苗候选株的选育

以甲肝减毒株的早代毒种 (L A 1) /P9,在 35℃条件下培养 ,采用人胚肺二倍体细胞 (2BS株 )连续减毒传代 ,克隆纯化 ,选育出新的疫苗候选株。该毒株经外源因子检查合格。较现行生产用毒株病毒增殖周期缩短 10d以上 ,病毒滴度可提高 1 0LogTCID5 0 ml以上 ,经恒河猴试验表明安全性与现行毒株差异无显著意义 ,而且免疫原性更好。     

轮状病毒基因重配株LD_9(G_2型)Vero细胞适应株的选育及其生物学特性

目的探讨轮状病毒基因重配株LD(9G2型)在Vero细胞上的传代适应性,选育高滴度的适应株。方法将3个轮状病毒基因重配株LD9克隆株(G2型)(LD9-1、LD9-2、LD9-3)在Vero细胞上分别以0.05、0.10、0.15和0.20MOI传代,选育出1株Vero细胞适应株,并确定其最适MOI,然后在Vero细胞上连续传代15代,检测病毒滴度及基因组核酸带型,采用nestRT-PCR法扩增其VP7基因。取第8、10、13代适应株病毒,以0.10MOI接种于Vero细胞,观察病毒的增殖动态。结果选育出的LD9-2株以0.10MOI接种Vero细胞可产生明显的细胞病变(CPE),病毒滴度随传代次数的增加先下降后升高,至4代时最低,9代后稳定于6.75lgCCID50/ml左右;连续传代15次,病毒基因组核酸带型均与原始毒株一致,且均能扩增出502bp的VP7基因。LD9-2株病毒增殖高峰期均出现在第7～8天,病毒滴度为6.00～7.00lgCCID50/ml。结论轮状病毒基因重配株LD9株(G2型)经Vero细胞适应性培养,获得了病毒表达量高且能稳定传代的疫苗候选株。     

狂犬病病毒4aG株G蛋白基因的克隆及其生物信息学分析

目的克隆狂犬病病毒(Rabies virus,RV)4aG株G蛋白基因,并与其他疫苗毒株G蛋白基因序列进行比较,为我国狂犬病疫苗的研制提供理论依据。方法从RV 4aG株中扩增G蛋白基因,并进行序列测定,利用生物信息学软件绘制系统进化树,预测G蛋白功能位点、二级结构和B细胞抗原表位,并与其他疫苗毒株进行比较。结果克隆的4aG株G蛋白基因序列与GenBank中登录的序列一致。进化树分析显示,4aG株与CVS株的进化关系较远;4aG、4aGV18、CVS、PV及RC-HL毒株跨膜区域在第460～479氨基酸之间,其他毒株在459～478氨基酸之间;PV株有5个糖基化位点,RV-97株有3个糖基化位点,其他毒株均有4个糖基化位点;G蛋白抗原表位位于氨基酸100～300及480～520之间;不同毒株G蛋白抗原位点区域有所不同,与CVS株比较,PV株抗原表位与其最为接近,4aG、4aGV18、CTN-1-31及Flury-HEP株与其抗原表位较为接近。结论4aG株G蛋白功能位点和抗原表位与CVS株相差较大,但其在Vero细胞上传代稳定,可用于制备Vero细胞纯化疫苗。     

狂犬病毒街毒株糖蛋白基因克隆、测序与表达

经实验研究证明狂犬病毒街毒株SBD0 7株具有较好的免疫原性后 ,通过RT PCR法 ,克隆了该毒株的糖蛋白 (G)基因 ,并进行了全序列测定。结果表明该株狂犬病毒G基因与疫苗株 (aG株 )的核酸及蛋白同源性分别为 85 8%和 88 5 %。以痘苗病毒为载体成功地表达了该基因 ,经小鼠实验表明能诱生较高滴度的狂犬病毒中和抗体 ,并能保护狂犬病毒致死量的攻击     

狂犬病病毒aG株糖蛋白遗传稳定性及生物信息学分析

目的研究狂犬病病毒(rabies virus,RV)aG株糖蛋白(glycoprotein,GP)的遗传稳定性,并对GP基因组进行序列测定及生物信息学分析。方法采用RT-PCR法扩增6代次aG株RV(4aGV4、4aGV5、4aGV7、4aGV11、4a-GV15、4aGV18)G区基因,分别将产物克隆入pGEM-T载体中,测定序列并进行拼接;测定6代次aG株RV的滴度、荧光滴度和毒力;应用DNAStar和Mega4.0软件包中的相应软件对基因组序列进行分析,并与我国近期分离且具有地域代表性的RV街毒株进行基因同源性分析。结果 6代次aG株RV GP基因保持高度稳定,未出现核苷酸突变位点;6代次aG株RV的滴度有所不同,但其毒力指标基本一致;RV aG株与我国街毒流行株GP抗原区具有较高的同源性,且膜外区同源性远高于跨膜区及膜内区;aG株RV第147位关键位点氨基酸与街毒流行株该位点不同,其余各关键抗原位点在各毒株间均高度同源;6代次aG株RV关键毒力位点均未出现氨基酸突变,传代稳定,aG株RV与各街毒流行株关键毒力位点均高度同源;aG株病毒信号肽结构与我国多株流行株高度同源,而其GP则与法国巴斯德原株PV2061株及分离自美国的HEP-Flury株高度同源,与我国流行街毒株亦具有较高的同源性。结论 RV aG株GP遗传稳定,且与我国近期分离的街毒株高度同源,本研究为完善该毒株的质量控制及全面评价其在我国的适用性提供了实验依据。     

细胞工厂在制备口服脊髓灰质炎减毒活疫苗中的应用

目的采用细胞工厂替代转瓶培养Sabin株脊髓灰质炎病毒,制备脊髓灰质炎减毒活疫苗。方法用细胞工厂和15 L转瓶分别培养人二倍体细胞(2BS),扩增至36代后,分别接种0.20 MOI的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎工作代毒种,待细胞病变达100%时收获病毒液,加入保护剂(4.5 mol/L氯化镁溶液),制备单价疫苗,分别将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个型别的单价疫苗按照病毒数10∶1∶6的比例混匀,制备成三价疫苗半成品,分装入1 ml西林瓶中(每瓶为10人份剂量),即为疫苗成品。采用微量滴定法测定疫苗原液及成品的病毒滴度,同时进行其他各项检定,并考察疫苗成品的稳定性。结果采用相同的感染复数接种病毒,细胞工厂制备的3个型别疫苗原液的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗原液,Ⅰ型平均滴度高0.17 log10CCID50/ml,Ⅱ型平均滴度高0.33 log10CCID50/ml,Ⅲ型平均滴度高0.27 log10CCID50/ml;细胞工厂制备的疫苗成品3个型别的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗,三价疫苗的平均滴度均高于6.24 log10CCID50/ml,符合国内外标准;疫苗原液及疫苗成品的其他各项检定均合格;细胞工厂制备的3批疫苗成品于37℃放置2 d,疫苗的总病毒含量不低于6.24 log10CCID50/0.1 ml,且病毒滴度下降未超过0.5 log10CCID50/0.1 ml,于2~8℃放置9个月,疫苗的总病毒含量仍不低于6.24 log10CCID50/0.1 ml,均符合WHO的标准要求。结论利用细胞工厂替代转瓶培养2BS细胞制备脊髓灰质炎减毒活疫苗,可获得高于转瓶培养3个型别疫苗的滴度,且工艺稳定,质量可控,可用于规模化脊髓灰质炎减毒活疫苗的生产。     

人A组和B组鼻病毒3C蛋白表达、纯化及酶切活性验证

目的在大肠埃希菌中表达人A组和B组鼻病毒(rhinovirus,RV)3C蛋白,纯化后检测其酶切活性。方法分别将A组鼻病毒RV1B和B组鼻病毒RV6的3C蛋白编码基因克隆至原核表达载体p ET-30a中,构建重组原核表达质粒p ET-30a-1B-3C和p ET-30a-6-3C,转化至E.coli BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化。利用具有3C蛋白酶切位点的15VP1-6P蛋白,分析不同温度(4和37℃)下3C蛋白的酶切活性。结果原核表达的目的蛋白为带His标签的可溶性蛋白,RV1B-3C蛋白相对分子质量约25 000,RV6-3C蛋白相对分子质量约23 000,纯度可达约70%。RV1B-3C和RV6-3C蛋白对15VP1-6P蛋白均具有酶切作用,而且在4和37℃均有酶切活性。结论在大肠埃希菌中成功表达了具有酶切活性的A组和B组鼻病毒3C蛋白,为进一步研究鼻病毒的致病机制奠定了基础。     

中国部分地区甲型肝炎病毒基因型分析

目的　分析中国部分地区甲型肝炎病毒 (HepatitisAvirus,HAV)的基因型。方法　采自辽宁 (LN1、LN2、LN3 )、上海 (Lu3 8)和云南 (YN)甲型肝炎病人的粪便标本共 5份 ,从中分离纯化HAV并提取病毒RNA ,以逆转录 半嵌套聚合酶链式反应 (RT hnPCR)合成VP1 2A交接区及VP1氨基端 ,经克隆筛选后进行测序分析。结果　所分离到的 5株HAV野毒株VP1 2A交接区 168个核苷酸 (nt)的片段与IB亚型的野毒株HM175比较 ,核苷酸差异 >7.5 % ;与IA亚型的日本野毒株AH1、AH2、AH3、FH1、FH2和FH3比较差异 <7.5 % ,因而均属IA基因亚型。但与IB亚型的野毒株MBB比较 ,LN1、LN3和Lu3 8在该区域的核苷酸差异 <7.5 %。进一步将LN1的VP1 2A交接区 3 3 9nt的片段、LN3和Lu3 8的VP1氨基端的核苷酸序列与MBB进行比较 ,核苷酸差异 >7.5 % ,表明这 3株HAV仍属IA基因亚型。结论　所分离到的HAV野毒株LN1、LN2、LN3、Lu3 8和YN均属IA基因亚型     

Walvax-2细胞基质培养甲型肝炎病毒YN5株的遗传稳定性分析

目的分析Walvax-2细胞基质培养甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)YN5株的遗传稳定性。方法将HAV YN5株在Walvax-2细胞中于35℃连续适应培养,取P24、P27、P29、P35和P40代病毒,提取RNA,以其为模板进行RT-PCR扩增,并测序。采用生物信息学软件DNAMAN、Vector NTI、BioEdit等进行序列分析,与GenBank中登录的标准株HM175(M14707)进行同源性比较。结果 5代病毒全基因组间的核苷酸序列同源性为100%。与标准株HM175比较,5代病毒基因组5′-NCR(101～200 bp)片段的124和152位发生突变,且存在134～137 bp缺失;2A(3 012～3 210 bp)片段的3 025和3 196位发生突变,其中,3 025位点A变为T,与标准株HM175 VP1/2A(3 024～3 191 bp)的差异小于7. 5%,基因亚型与其相同,均为IB型;2C(3 986～4 960 bp)片段的4 043、4 087、4 185、4 222、4 563、4 802、4 880位点发生突变。5代病毒与标准株HM175氨基酸序列同源性为99. 4%,共有29个氨基酸发生突变,主要抗原位点与标准株HM175完全一致。结论 Walvax-2细胞基质培养HAV YN5株可保持良好的遗传稳定性,有望用于甲肝疫苗的研发及生产。     

口服轮状病毒减毒活疫苗Rotarix的现状及研究进展

轮状病毒(Rotavirus,RV)是全世界范围内导致婴幼儿重症腹泻的重要病原。由于当前尚无治疗RV感染的特效药物,因此,开发安全、有效的疫苗具有重要意义。G1型RV流行范围较广,本文主要对目前国内外上市的3种RV疫苗中的G1P[8]型Rotarix疫苗的情况作一综述。     

甲肝-麻疹二联疫苗的稳定性

目的观察甲肝-麻疹二联疫苗的稳定性。方法取5批甲肝-麻疹二联疫苗于2～8℃、室温(22℃±2℃)及37℃放置不同时间后,分别进行甲肝病毒和麻疹病毒滴度测定。结果该二联疫苗于2～8℃放置22个月、室温放置4个月及37℃放置7d,疫苗中两种病毒滴度基本保持不变。结论甲肝-麻疹二联疫苗具有与其相应单价疫苗同样良好的稳定性。     

细胞色素P450BM-3热稳定性的半理性改造

为了提高细胞色素单加氧酶P450 BM-3的热稳定性,采用半理性设计策略对该酶进行了分子改造。首先采用B-FITTER软件分析了P450 BM-3晶体结构中各氨基酸残基位点的温度因子(B-factor),识别出了一个对酶的热稳定性有不利影响的关键氨基酸残基位点G46,然后以P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q/D422G)为亲本酶在该位点进行定点饱和突变构建了突变文库,并从饱和突变文库中筛选获得了一个热稳定性得到显著提高的突变酶P450BM-3(A74G/F87V/L188Q/D422G/G46S)。该突变酶(G46S)的半失活温度(T5010)比亲本酶提高了5℃(达到48℃;在50℃的半衰期t1/2比亲本酶延长了一倍。同时,突变酶的酶学性质也得到明显改善,与亲本相比,突变酶Km降低了22%,kcat提高了90%,催化效率kcat/Km(67.42 L?(mmol?min)-1)比亲本提高了1.48倍。这说明G46位点不仅影响酶的热稳定性,还影响酶对底物的结合与催化性能。G46S突变酶的获得表明,只要采用适当的半理性设计策略对正确的位点进行分子改造,可以在提高酶的热稳定性的同时,保持或甚至提高酶的催化活性。