酿酒酵母采用木糖发酵产乙醇的研究现状

酿酒酵母具有安全性好,高产量和高的抑制剂耐受性等优点,故一直在生物乙醇工业中有重要作用。然而该酵母不能使木糖发酵,而木糖是木质纤维素水解产物中重要的戊糖。为了得到利用木糖高效产乙醇的工程茵,我们通过引入初始木糖的新陈代谢和木糖的运输体来改变细胞内的氧化还原平衡．木酮糖激酶的过表达和磷酸戊糖途径来提高乙醇产率。     

异源转氢酶NNT对酿酒酵母木糖代谢的影响

表达有毕赤酵母木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)的重组酿酒酵母,能代谢木糖.但是XR和XDH分别偏好辅酶NADPH和NAD⁺,造成辅酶的不平衡和副产物的积累,所以重组酿酒酵母利用木糖产生乙醇的效率很低.转氢酶可以催化辅酶NADPH和NADH之间的相互转化,因此本实验将黑曲霉的转氢酶基因NNT转入到重组酿酒酵母中,通过实验确定了NNT基因的表达蛋白在酵母细胞内定位于线粒体中,NNT基因分别用pPGK1、pCCW12和pHXT7启动子进行表达,在微好氧的木糖发酵条件下,NNT基因的导入使酿酒酵母甘油产量下降,乙醇产率提高,在由pCCW12和pHXT7表达NNT基因的重组酿酒酵母中,木糖醇产率分别下降86.3%和49.3%,乙醇产率提高16.7%和12.7%,说明转氢酶NNT的存在改善了木糖代谢的辅酶不平衡,提高了乙醇的转化率.     

不同非氧化磷酸戊糖途径基因的过表达对酿酒酵母木糖发酵性能的影响

以双拷贝过表达木糖代谢上游途径关键酶(木糖还原酶XR、木糖醇脱氢酶XDH和木酮糖激酶XKS)的酿酒酵母菌株为背景,在过表达非氧化磷酸戊糖(PP)途径中转醛酶基因TAL1的基础上,对途径中其他基因TKL1(转酮酶)、RPE1(核酮糖-5-磷酸差向异构酶)和RKI1(核酮糖-5-磷酸异构酶)进行了不同程度的过表达,以研究PP途径基因过表达对酿酒酵母木糖代谢的影响。在不同培养基条件下对重组菌株木糖代谢进行研究,结果显示,在过表达TAL1的基础上不同组合过表达PP途径其他基因不同程度改善了酿酒酵母木糖发酵性能,重组菌株能在36~48 h耗完质量分数(下同)为5%的木糖。其中,过表达PP途径全部基因比其他过表达基因组合表现出明显的优势,在8%木糖发酵条件下其乙醇产量达到了每1 g木糖0.337 g,较对照菌株提高了7.86%。这说明同步过表达PP途径基因更有利于酿酒酵母木糖发酵。     

整合型酿酒酵母菌株强化发酵和特性比较

为了提高木糖异构酶基因在重组酿酒酵母体内的稳定性,并比较不同真菌来源的木糖异构酶在木糖或者葡萄糖-木糖培养基的发酵利用特性,分别构建来自Piromyces sp.E2和Orpinomyces sp.的木糖异构酶基因的整合表达载体,利用同源重组将其整合进入呼吸缺陷型菌株的18S rDNA非转录区,结果测得Orpinomyces的木糖异构酶酶活活力为0.72 U/mg,比Piromyces的木糖异构酶酶活高2.8倍。在木糖培养基中发酵获得乙醇的得率分别为0.40 g/g和0.48 g/g。且整合入Orpinomyces的木糖异构酶基因菌株能获得最高酶活和乙醇得率。     

木糖发酵酒精代谢工程的研究进展

木糖发酵是生物转化木质纤维素产生酒精及其他化工产品最为重要的一环,但自然界中缺少能将上述生物质有效转化为乙醇的微生物菌种. 近年来,根据代谢工程原理,利用基因工程技术对酵母和细菌进行遗传改造,或将木糖代谢途径引入传统的酒精发酵菌酿酒酵母及高酒精产生菌运动发酵单胞菌中,从而拓展其底物利用范围;或使原本可以利用多种糖底物的细菌获得选择性产生酒精的能力,构建了各种不同类型的木糖发酵重组菌株. 虽然这些重组菌株在木糖转化酒精方面均显示出良好的应用前景,但仍存在诸多问题. 有必要在对木糖代谢调控机制深入系统研究的基础上,进一步改造现有菌株,并结合生化工程技术对重组菌株发酵条件进行优化,以实现高效生物转化木质纤维素原料制取乙醇. 本工作介绍了近年来代谢工程改造微生物菌种发酵木糖生产酒精的研究进展.     

脱色树脂在木糖脱色中的应用

介绍了脱色树脂在木糖液中的脱色性能，同时提出了脱色树脂脱色的最佳工艺条件。并且脱色树脂应用于木糖液脱色，既简化了生产工艺，又降低了工人的劳动强度，具有较好的现实意义。     

低聚木糖在食品工业中的应用及发展前景

介绍了低聚木糖在饮料、保健食品、焙烤食品中的应用,概述了低聚木糖的发展前景.     

颗粒活性炭在木糖脱色中的应用

研究了颗粒活性炭对木糖液的脱色性能。考察了木糖液温度、流速等因素对脱色效果的影响。结果表明,颗粒活性炭具有脱色容量大、脱色效率高、再生速度快、抗磨损能力强等特点。颗粒活性炭对木糖一脱液的脱色效果明显,处理量为66mL／g,脱色后糖液的透光度值在70％以上。80oC时脱色和解吸效果最好,经脱色后的糖液可以满足精制木糖的制备要求。     

牛乳铁蛋白肽在酿酒酵母中的分泌表达及其活性

目的在酿酒酵母中分泌表达牛乳铁蛋白肽(bovine lactoferricin,LfcinB),并检测其活性。方法根据LfcinB的氨基酸序列,按照酿酒酵母密码子偏好性设计LfcinB基因序列,人工合成LfcinB基因,扩增后插入质粒pYES2-α中,构建重组表达质粒pYES2-α-LfcinB,转化至酿酒酵母INVSc1中,半乳糖诱导表达。采用抗生素微生物效价测定法中的管碟法一剂量法检测表达的LfcinB对大肠埃希菌DH5α和枯草杆菌的抑菌活性。对重组酵母菌的诱导时间、诱导剂浓度和诱导温度进行优化,并检测重组LfcinB的稳定性。结果重组表达质粒pYES2-α-LfcinB经双酶切和测序证明构建正确;重组酵母菌诱导表达产物可见相对分子质量分别为5 164和4 355的特异蛋白条带,每升工程菌发酵液中目的蛋白含量约为2.878 5 mg;表达的重组LfcinB对大肠埃希菌DH5α和枯草杆菌均有明显的抑菌活性;在诱导温度为26℃、半乳糖浓度为3%的条件下诱导96 h时,LfcinB的抑菌活性最高;重组LfcinB具有热稳定性,且二硫键的存在对其抑菌活性无影响。结论已成功在酿酒酵母中分泌表达了具有活性的LfcinB,为进一步研究LfcinB的生物功能及其应用奠定了基础。     

LSM蛋白增强木糖发酵重组酵母抗逆性能的研究

木质纤维素原料预处理过程中产生的弱酸、呋喃醛类和酚类化合物等对酿酒酵母的乙醇发酵有抑制作用,提高基因重组酵母对抑制物的耐受性,是利用植物秸秆水解液生产燃料乙醇的关键技术之一。研究从前期构建的戊糖、己糖共发酵重组酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae ZU-E8基因组DNA中克隆出RNA结合蛋白LSM6,将其连入含有PADH启动子的质粒构成表达载体pR-LSM,进而转入ZU-E8宿主细胞中。通过高浓度醋酸根平板筛选,得到高抗逆性木糖发酵重组酵母ZU-910。在醋酸浓度为2 g·L-1的木糖培养基中发酵96 h后,ZU-910的木糖利用率和乙醇浓度为90.2%和26.9 g·L-1,分别是出发菌株ZU-E8的8.5和10倍,并且ZU-910对糠醛和硫酸根的耐受能力也较ZU-E8大大增强。在玉米秸秆酶解液发酵中,ZU-910的木糖利用率和乙醇产量在ZU-E8基础上增加了10.5%和7.7%.证明LSM6蛋白确实能够增强木糖发酵重组酵母的抗逆能力,提高其发酵性能。该研究成果在木质纤维素替代粮食生产乙醇的产业化进程中具有良好的应用前景。     

1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD的克隆与原核表达

大肠杆菌1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶被yqhD的基因编码,能催化羟基丙醛生成1,3-丙二醇.采用PCR方法从大肠杆菌中扩增到yqhD,测序结果显示该片段大小为1164bp.将目标片段克隆到原核表达载体pET28(α )中并转化到大肠杆菌Novablue,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定,结果表明克隆得到的yqhD基因能在大肠杆菌Novablue-pET28中实现蛋白表达;在25℃条件下,IPTG诱导12h后,1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力达到124 U/mg,而野生型的酶活力仅为1.4 U/mg;重组菌全细胞发酵结果显示,产物1,3-丙二醇的产率能达到65%,而野生型仅为9.5%.     

D-呋喃木糖酯类化合物的合成及其在单料烟中的应用

利用二环己基碳二亚胺(DCC)作缩水剂,4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂,以1,2-O-异丙叉基-α-D-呋喃木糖和11种酸为原料,合成了11种具有潜在香味的木糖酯类化合物,结构经1H-NMR、13C-NMR、IR和HRMS图谱检测得到验证,并进行了卷烟加香试验.评吸结果表明,合成的该系列化合物可以提高卷烟烟气的香...     

小鼠MUC1基因的克隆及其在大肠杆菌DH5α中的表达

目的构建表达小鼠MUC1基因的工程菌,并纯化重组小鼠MUC1融合蛋白。方法通过RT-PCR扩增小鼠MUC1基因片段,连入pMAL-p2原核表达载体,并转化大肠杆菌DH5,αIPTG诱导表达,经Western blot鉴定,Amylose Resin亲和层析纯化。结果获得了小鼠MUC1 708bp DNA片段,并构建了pMAL-mMUC1表达载体。表达产物相对分子质量约为67000,经Western blot鉴定,与兔抗MBP多克隆抗体产生特异性反应。纯化的融合蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带。结论成功构建了表达小鼠MUC1蛋白的工程菌。     

木聚糖酶在制备低聚木糖中的应用进展

低聚木糖(Xylo-oligosaccharide,XOS)是一类由木糖分子连接而成的益生元化合物,具有促进双歧杆菌的生长、改善肠道菌群的组成结构、提高人体免疫力以及预防疾病等功能特性.酶法是较适合的XOS制备方法.简要阐述了木聚糖和XOS的结构,并对XOS降解酶系中木聚糖酶的结构、作用位点和酶系分类以及在制备低聚木糖...     

弱化二氢叶酸还原酶基因增进人神经生长因子β亚基在CHO细胞中的表达

目的通过弱化二氢叶酸还原酶基因(Dihydrofolate reductase,DHFR)增进人神经生长因子β亚基(β-Humannerve growth factor,β-hNGF)在CHO细胞中的表达。方法从质粒pUC18-β-NGF中扩增β-NGF基因,克隆至pMD18-T载体,构建克隆质粒β-hNGF/pMD18-T;经人工合成弱化SV40启动子与DHFR基因顺式表达元件,并插入pBudCE4.1质粒,构建质粒w-DHFR/pBudCE4.1;分别双酶切质粒β-hNGF/pMD18-T和w-DHFR/pBudCE4.1后连接,转化大肠杆菌Top10’,构建重组表达质粒β-hNGF/w-DHFR/pBudCE4.1,转染CHO-DHFR-后,筛选阳性细胞克隆,ELISA法检测阳性CHO细胞株表达β-NGF的水平,鸡背根神经节增殖法检测重组β-NGF的生物学活性。结果重组表达质粒β-hNGF/w-DHFR/pBudCE4.1经酶切和测序证明构建正确;共获得5株表达β-hNGF的CHO细胞株,且表达的β-NGF能使神经节出现明显的神经纤维,表达量为0.1μg/μl。结论通过弱化SV40启动子和DHFR基因,在CHO细胞中成功表达了β-hNGF基因,表达量增加且具有生物学活性。     

三效升降膜蒸发工艺在木糖生产中的应用

该文从节约能耗、降低成本的观点出发,对年产500t木糖生产线的蒸发工艺（热敏性）进行了研究,得出了三效升降膜蒸发新工艺。     

木糖废液制取酱色素方法及其产品的稳定性研究

以木糖生产中的废液制取食用酱色素 ,研究了各种因素对酱色素稳定性的影响。结果表明 ,一般热、光、溶液pH值对其的影响不大 ;在一般浓度下 ,Ca2 ,Na ,K ,Al3 ,Fe3 ,蔗糖 ,苯甲酸钠 ,食盐等物质对其基本无影响 ;当Mg2 ,Zn2 ,Fe3 ,抗坏血酸的含量高时对其有不利影响。     

人肌红蛋白基因的克隆、表达及其抗体制备

目的克隆、表达人肌红蛋白基因,并制备人肌红蛋白多克隆抗体。方法应用RT-PCR方法从人骨骼肌总RNA中扩增肌红蛋白基因(hMb)编码序列,克隆入原核表达载体pRSETc中,并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达。表达产物经亲和层析和凝胶层析纯化。纯化蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,并用Westernblot检测其特异性。结果测序表明RT-PCR所得的肌红蛋白基因hMb序列与GenBank(NM203377)中报道的序列一致。该基因在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化,获得电泳纯的蛋白。重组人肌红蛋白的表达水平达12.8%。每升发酵液中可获得纯化的目的蛋白6.438mg。Western blot分析表明该蛋白为融合有6个His的hMb蛋白。ELISA法测得抗体效价为1∶12800,Western blot证实其具有较好的特异性。结论已成功克隆人肌红蛋白基因,在大肠杆菌中获得了可溶性表达,并制备了抗人肌红蛋白的多克隆抗体。     

生长抑素基因在大肠杆菌pThioHis表达系统中的克隆与表达

目的　在大肠杆菌表达系统中高效表达生长抑素 (SS)基因。方法　以天然SS的氨基酸和基因序列为标准 ,将大肠杆菌使用频率较低的密码子分别更换成了使用频率较高的密码子 ,在SS基因的两端加上了合适的酶切位点 ,头部 :KpnI和NcoI;尾部 :PstI(这一酶切位点可与NsiI的切口互补 )。克隆至pThioHisA质粒的KpnI/PstI酶切位点后 ,再克隆至pThioHisA质粒的KpnI/NsiI酶切位点 ,使SS基因分别位于多克隆位点的尾部和前部。结果　重组质粒经酶切鉴定和基因序列测定证明 ,基因完全正确 ,在大肠杆菌TOP10中均得到较好的表达 ,IPTG诱导后 4h表达量基本达到最高 (37℃ ) ;在A60 0 0 .4～ 1.5之间用IPTG诱导均可获得到较好的表达 ,但以 0 .6左右为最佳诱导时机 ;在LB、TB和 2YT培养基中表达量依次为 :TB >LB >2YT ;表达的SS融合蛋白基本为水溶性的 ,具有良好的SS抗原性和免疫原性。结论　为基因工程SS大肠杆菌疫苗的研制奠定了基础     

醛酮还原酶及其在不对称合成手性醇中的应用

醛酮还原酶是氧化还原酶家族成员之一,能对很多羰基底物进行氧化还原.综述了醛酮还原酶家族的命名、结构、保守氨基酸序列、催化机制、结合辅酶方式和结合底物的特异性;阐述了醛酮还原酶生理作用的研究方法;介绍了醛酮还原酶在手性醇合成方面的应用.