圆弧青霉碱性脂肪酶发酵和纯化的研究

圆弧青霉变异株ＰＧ３７产酶最适条件：碳源用豆油;氮源用豆饼粉;装液量５０ｍｌ／５００ｍｌ三角瓶,摇瓶转速２５０ｒ／ｍｉｎ,培养温度及时间分别为２８℃和９６ｈｒ,起始ｐＨ７．５。发酵至第３６、５４和７２ｈｒ各流加０．４％豆油,发酵结束脂肪酶１５００Ｕ／ｍｌ。经过滤,硫酸铵盐析以及Ｐｈｅｎｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃｌ－４８Ｂ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｏｌｗ和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７     

圆弧青霉PG37碱性脂肪酶的发酵工艺条件

研究了圆弧青霉PG3 7碱性脂肪酶的发酵工艺条件 ,优化了PG3 7的摇瓶最适产酶条件 .其中 ,发酵培养基的组成为 (g/dL) :豆饼粉 3 .0 ,玉米浆 3 .0 ,磷酸氢二钾 1 .0 ,硫酸镁 0 .1 ,大豆磷脂0 .5,柠檬酸钠 0 .0 5,花生油 0 .2 ;发酵培养基起始 pH 7.5,发酵温度 (2 9± 1 )℃ ,摇床转速 2 50r/min ,发酵周期 96h ,发酵期间于 3 6,54,72h分别流加 0 .4 g/dL花生油 .在此条件下 ,PG3 7的脂肪酶产率为 2 0 60 μmol/ (min·mL) .PG3 7在 2 5L的实验室小罐中的产酶水平为 1 90 0 μmol/ (min·mL) .     

圆弧青霉脂肪酶基因序列的生物信息学分析

从圆弧青霉PG37中克隆了碱性脂肪酶(Lip I)基因,并采用生物信息学分析了PG37 Lip I基因携带的遗传信息.序列分析结果表明:Lip I DNA序列全长1 480 bp,不存在重复序列,含有5个内含子,5' 端存在TATA box和多个转录因子结合位点;cDNA序列全长1 128 bp,包含了转录起始位点、5' 和3' 非编码区及858 bp的开放阅读框架;Lip I编码区对TGC、GAC、TTC、CAC、AAG、AAC和TAC这7种密码子使用频率最高;比对Lip I基因与Pichia pastoris基因组中的密码子使用频率,其中有21个密码子使用频率的比值相差较大.     

圆弧青霉脂肪酶基因的克隆和表达

圆弧青霉PG37总RNA甲醛变性电泳呈现真核生物所特有的 2 8SrRNA和 18SrRNA条带 .根据PG37所产碱性脂肪酶 (LipPC)N末端氨基酸残基序列和真核生物mRNA在 3’端具有poly(A)等所提供的生物信息 ,采用RT PCR技术扩增了LipPC成熟肽和 3’非编码区的cDNA片段 ,并将该PCR产物直接克隆至pUCm T载体中 .序列分析表明 ,LipPC含有 2 5 8个氨基酸残基 ,其中保守的五肽序列为Gly His Ser Leu Gly .进一步采用ClonTech公司的SmartTM PCRcDNA文库构建试剂盒 ,扩增、克隆和测定了自转录起始点至编码区的cDNA片段 ,从而完成了LipPC完整cDNA的分析测定 .最后将编码完整脂肪酶蛋白质的cDNA克隆至 pGEX 5X 3表达载体中 ,SDS PAGE检测结果表明 ,大肠杆菌BL2 1所表达的GST LipPC融合蛋白质分子质量约为 5 3ku .     

圆弧青霉产碱性脂肪酶的中试发酵

圆弧青霉PG3 7是碱性脂肪酶的高产菌 ,在摇瓶和 2 5L发酵罐小试的基础上进行 3M3发酵罐中试 .适合的发酵条件为 :发酵培养基 (% )　豆饼粉 3 .0 ,玉米浆 3 .0 ,磷酸氢二钾 1 .0 ,硫酸镁0 .1 ,大豆磷脂 0 .5,柠檬酸钠 0 .0 5,花生油 0 .2 ;发酵起始 pH值为 8.0 ,发酵温度 2 9± 1℃ ,接种量8%～ 1 0 % ,通风量 0 .8L/ (L·min) ,搅拌转速 2 4 0r/min ,发酵周期 72h ,期间于 3 0、4 2、54h分别各流加 0 .4 %花生油 .在上述条件下 ,圆弧青霉PG3 7发酵酶活达 2 0 0 0 μmol/ (min·mL)     

碱性脂酶测定方法的研究

通过对ＰＧ３７圆弧青霉所产碱性脂肪酶及同类酶的测定方法研究和比较，对碱性脂肪 测定提出了新的方法，该方法较原有方法简单，并能节省部分实验材料，可为国内碱性脂肪酶测定标准的制定提供一定的理论基础。     

圆弧青霉BD26碱性脂肪酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),以圆弧青霉BD26总RNA为模板,扩增出774 bp cDNA片段,将该基因片段克隆到表达载体pET-28a(+)上并转化Escherichia coil BL21(DE3),得到重组菌株BL21/ Lip PD。经IPTG诱导,菌体在固体琼脂显色平板上形成明显透明圈。SDS-PAGE电泳显示该脂肪酶分子质量约为27 ku。表达条件优化结果表明,当工程菌培养至OD_(600)为0.5时,加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L,在32℃诱导培养1 h,比酶活达29.30 U/mg。     

碱性脂肪酶测定方法的研究

通过对PG37圆弧青霉所产的碱性脂肪酶及同类酶的测定方法的研究和比较,对碱性脂肪酶的测定提出了新的方法。该方法较一般方法简单,并能节省部分实验材料。为国内碱性脂肪酶测定标准提供了一定的理论基础。     

碱性脂肪酶高产菌的平板筛选模型

通过研究三丁酸甘油酯和丁酸对圆弧青霉白色变株PI4 2生长及产脂肪酶的影响 ,建立了碱性脂肪酶高产菌的平板筛选模型。以该模型对PI4 2进行自然分离 ,从中得到一株遗传性状稳定的高产菌 ,脂肪酶产率提高了 85%。该菌株在 2 5L罐中采用流加发酵工艺培养 72h ,发酵产酶水平达到 550 0U/mL。     

用筛选抗性突变株法选育碱性脂肪酶的高产菌

以圆弧青霉白色变株ＰＢ２２７ 为出发株⒙通过多次诱变⒙筛选抗真菌抗生素的抗性株和抗底物、底物结构类似物或分解产物的抗性株⒙获得一株己酸抗性突变株ＰＧ３７⒙其产酶水平比出发株ＰＢ２２７ 菌株提高了１．５ 倍⒙达到５５７ μｍ ｏｌ／⒉ｍ ｉｎ·ｍ Ｌ⒕．ＰＧ３７ 所产脂肪酶的最适作用ｐＨ 为１０．０⒙最适作用温度为２５ ℃⒙在ｐＨ ７．０～１０．５ 范围内稳定．     

重组毕赤酵母发酵生产扩展青霉碱性脂肪酶的优化

通过毕赤酵母工程菌表达碱性脂肪酶,对表达条件进行了优化。先进行单因素实验,筛选出对碱性脂肪酶表达影响较大的4个因素:诱导时间、初始pH、甲醇添加量和接种量;在单因素实验的基础上设计四元线性回归实验,利用SPSS18数据处理软件进行数据优化,结果表明,诱导时间为96h、初始pH为6.0、甲醇添加量为0.5%、接种量为150mL时有最佳的表达效果,碱性脂肪酶活力为242.7U/mL。     

海洋青霉碱性脂肪酶液态发酵和部分酶学性质研究

从海洋菌中分离筛选到1株碱性脂肪酶产生菌H-19,对该菌产脂肪酶的液态发酵条件进行了优化,优化后的培养基组成(%):葡萄糖0.5,大豆油1.0,蛋白胨1.0,(NH4)2SO40.5,NaCl 2.75,KCl 0.1,MgCl20.5,MgSO4.7H2O 0.2,CaCl20.05;发酵培养基起始pH8.0,发酵温度28℃,摇床转速180 r/min,发酵周期48 h,脂肪酶的活力可达17.43 IU/mL。酶的最适反应pH为9.4,最适温度36℃,半失活温度为60℃。     

碱性脂肪酶预防高血脂的实验研究

脂肪酶（Lipase）是脂类化合物分解、合成及交互脂化的生物催化剂，已广泛应用于脱脂、化工产品生产及医药等行业[1-3]。从1996年开始国产碱性脂肪酶投入批量生产，并应用于洗涤剂行业，但其他应用有待开拓，为了探讨在预防高血脂症的效果，我们进行了研究。实验中进行了大鼠血脂水平的测定和血液粘度和红细胞聚集性等的检测，以期取得确切的实验结果，为国产碱性脂肪酶在保健食品、医药卫生中的应用提供依据。1材料和方法1．1动物分组及饲养采用白求恩医大实验动物部提供的Wistar健康雄性大鼠，体重230。209，按体重随机分成3组，每组10只…     

液体碱性脂肪酶稳定性的化学动力学研究

从多方面考察了碱性有肪酶超滤浓缩液的稳定性，推导出液体碱性脂肪酶失活动力学方程，得到了液体碱脂肪酶的失活级数为１．３６级。     

易错PCR技术改造扩展青霉脂肪酶

利用易错PCR技术,建立脂肪酶基因随机突变文库,将随机突变脂肪酶基因转化毕赤酵母GS115,初步筛选了4000株突变菌株,对300株较优突变株进行酶的活力、耐热性、耐酸性的摇管复筛,进一步摇瓶复筛后获得优良突变株ep3,所产突变脂肪酶(ep3-GS)的适宜pH为9.4,适宜作用温度为35℃,与野生重组脂肪酶(PEL-GS)一致,该温度下酶的比活为3440 U/mg,比野生型脂肪酶提高17%。     

戊二醛交联法固定扩展青霉脂肪酶的研究

以海藻酸钠为载体,戊二醛为交联剂,采用交联吸附法固定扩展青霉脂肪酶。通过单因素试验和正交试验考察固定化主要因素对固定化酶活力的影响,优化固定化条件。结果表明,海藻酸钠浓度为3%、氯化钙为1%、戊二醛浓度为2.5%的条件下,酶浓度为0.03g/mL,pH为10.0,固定温度为40℃,固定时间为30min,该条件下固定化酶活最高为22895u/g,酶活回收率达到67.57%。在有机体系中,固定化脂肪酶的酯化能力明显高于游离态脂肪酶。在重复利用9次后,固定化脂肪酶的酶活降为初始状态的50%。     

碱性脂肪酶产生菌扩张青霉变株（Penicillium expansum）特性及其酶学特性的研究

研究了扩展青霉碱性脂肪酶高产菌株W－1520与W－1633的菌株特性及二者所产脂肪酶的纯化、酶学性质的研究，得出以下结果：扩展青霉W－1633的孢子生长速度、斜面生长速度与摇瓶生长速度均比W－1520快。菌株同工酶电泳的结果表明：W－1633酯酶同工酶带数比W－1520的多。对两种脂肪酶酶学性质也做了初步研究。