热稳定性脂肪酶生产菌的筛选及其酶学性质研究

采用平板透明圈法从不同来源土壤样品中分离得到31株脂肪酶生产菌株,经复筛得到一株脂肪酶产量较高的菌株Mhy-1。根据培养特征、生理生化分析及16S rDNA序列同源性分析,初步鉴定菌株Mhy-1为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida),该菌的最适生长温度及初始pH分别为35℃和pH7.0,最适产酶温度及初始pH分别为30℃和pH9.0。采用硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换层析从菌株Mhy-1的发酵上清液中分离纯化了脂肪酶,酶的分子量约为34ku,最适作用温度为45℃,最适作用pH8.0。该酶在pH7.0~9.0和温度30~70℃的范围内稳定,在70℃条件下能维持80%以上酶活力,是一热稳定酶,纯化后的酶可用于生物柴油的催化合成。     

内生黑曲霉产脂肪酶条件研究及其粗酶酶学特性

针对新疆酿酒葡萄中获得的1株产脂肪酶的内生黑曲霉菌株C2J6,研究了该菌株的产酶条件及酶学特性。结果表明,该菌适宜的产酶条件为1%的乳糖为碳源,1%的蛋白胨为氮源,培养基初始pH值为8.0,培养温度35℃,培养时间约72h,此时所产脂肪酶的活力可达18.75U/mL。该菌所产脂肪酶粗酶液的最适反应温度为40℃,最适反应pH值为7.0,为中温中性酶;在50℃保温1h酶活力保留54.55%,具有良好的热稳定性;在pH值3.0~7.0范围内较稳定,有一定的耐酸性。金属离子Mn2+对酶活力有促进作用,Zn2+、Fe2+、Cu2+对酶活力有抑制作用,K+、Ca2+、Na+、Mg2+对酶活力影响不大。该酶在以葵花油和谷物调和油为底物时,酶活分别为228%和180%,明显高于橄榄油和油烟机废油。     

褶皱假丝酵母产脂肪酶条件及酶学性质研究

对一株来源于海洋有产脂肪酶能力的褶皱假丝酵母产酶条件进行研究,探讨了碳源、氮源、pH、培养温度对该菌产脂肪酶的影响。结果显示:在摇瓶培养条件下,其最适产酶条件为:蔗糖5 g/L,橄榄油5 g/L,MgSO4·7H2O1 g/L,K2HPO41 g/L,(NH4)2SO410 g/L,起始pH为7.0,接种量10%,在30℃、200 r/min下培养36 h,产酶能力达到4 351.6 U/mL。该菌所产脂肪酶的最适反应pH为7.0,最适反应温度为37℃,Ca2+、Mg2+对酶活有一定的促进作用。     

Burkholderia sp.JXJ-16低温耐有机溶剂脂肪酶产酶条件优化及粗酶酶学性质

以Burkholderia sp.JXJ-16为出发菌株,对其低温耐有机溶剂脂肪酶的产酶条件进行单因素实验并研究其粗酶酶学性质。该菌株的最佳产酶条件为:蔗糖3.75 g/L、尿素11.25 g/L、K_2HPO_42 g/L、(NH4)2SO_41 g/L、Mn SO_40.25 g/L、猪油乳化液体积分数2.5%,初始p H9.0、培养温度30℃、装样量20 m L/250 m L、接种量3%、发酵时间20 h。JXJ-16脂肪酶粗酶对中链对硝基苯酚酯有最大水解活力,最适底物为对硝基苯酚辛酸酯;该粗酶在35℃、p H8.5~9.0时酶活力最高,且具有较好的温度(30~60℃)和p H(5.0~10.5)稳定性;Na~+、Mg~(2+)、Ca~(2+)、Mn~(2+)、EDTA对粗酶活力具有激活作用,Zn~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)对粗酶活力具有抑制作用,K~+对粗酶活力没有显著性影响;除乙醇和乙腈外,该粗酶在一定体积分数的异丙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、二甲苯和正己烷中具有良好耐受性,且处于激活状态。综上,该菌株能利用廉价易得的培养基原料达到最佳产酶效果,其所产脂肪酶为低温碱性脂肪酶,具有较好的温度和p H稳定性,对多数供试有机溶剂具有良好耐受性。     

来源于Rhodohalobacter barkolensis的昆布多糖酶RbLam16的重组表达及生产条件优化

为实现昆布多糖酶的异源表达以及提高工程菌的产酶水平,将来源于Rhodohalobacter barkolensis的昆布多糖酶RbLam16基因经密码子优化后克隆至pPIC9K质粒,并重组到毕赤酵母GS115中。分泌表达的重组酶经镍柱纯化后对其酶学性质进行表征;为提高酶的表达量,对重组毕赤酵母菌的发酵条件进行了优化。结果表明:Rb Lam16能够在毕赤酵母GS115中高效分泌表达;以来源于海带的昆布多糖作为水解底物时,RbLam16最适反应温度及p H分别为55℃和p H 7.0;通过热稳定性及pH稳定性研究发现,RbLam16在55℃保温30 min后,残留酶活力在90%以上;在50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中保存24 h后残留酶活力高达90%;金属离子Mn2+和Co2+对酶活力有促进作用,而Cu2+、乙二胺四乙酸和十二烷基硫酸钠可严重抑制酶活力。发酵条件优化结果显示,在发酵液初始p H为6.0、培养温度为28℃以及每24 h添加体积分数1.5%的甲醇条件下发酵120 h,发酵上清液中酶活力达到27.42 U/m L,与初始酶活力相比提高了26.42%。R...     

乙酸异戊酯高产菌脂肪酶的特性研究

以乙酸异戊酯高产菌株Loq-c为试验材料,从菌体中提取制备脂肪酶,研究其酶学特性,结果表明：该酶催化反应的最适温度在30 ℃左右,在40 ℃以下具有良好的热稳定性;催化体系的pH在6.0～7.0时,酶的相对活力和稳定性较高,而当pH≤4.0时酶表现得不稳定,酶活力低。金属离子Mg2+和Ca2+能明显促进酶的催化能力,Cu2+和Ag+能明显抑制酶的催化能力,Na+、K+和Zn2+对酶催化的影响不显著。正交试验结果表明,菌株Loq-c脂肪酶最佳酶活条件为：温度在30 ℃,pH值为7.0,Mg2+浓度为5.0 mmol/L。在此最佳条件下,酶活力高达535.8 U/mL。     

一株深海来源苏云金芽孢杆菌SWJS07所产蛋白酶的分离纯化及性质研究

利用超滤、硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析、Sephadex G-75分子筛柱层析对一株南海深海来源菌苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)SWJS07所产蛋白酶进行分离纯化,纯化后经SDS-PAGE鉴定达到电泳纯,相对分子质量为37.0 k Da,酶的比活力提高了6.39倍,回收率为37.14%。研究其酶学性质表明,该蛋白酶最适催化温度为55℃,在30℃~45℃下稳定性较高,保温300 min残留酶活在80%以上;最适p H 6.5,在p H 6.0~9.0蛋白酶稳定,4℃放置24 h残留酶活在80%以上;2 m M Ca2+、Mn2+对蛋白酶有不同程度的激活作用,而Hg2+、Cd2+、Al3+则强烈地抑制蛋白酶活;当在蛋白酶中添加2 m M Ca2+、Mn2+时,其最适催化温度分别为60℃和55℃,蛋白酶活分别提高了32.86%和28.35%,60℃保温30 min相对酶活基本保持不变,与纯酶(相对酶活残留21.02%)相比蛋白酶的热稳定性显著提高;EDTA-Na2可强烈抑制蛋白酶活,推测该蛋白酶属于金属蛋白酶。     

Burkholderia sp.JXJ-16低温耐有机溶剂脂肪酶产酶条件优化及粗酶酶学性质

以Burkholderia sp.JXJ-16为出发菌株,对其低温耐有机溶剂脂肪酶的产酶条件进行单因素实验并研究其粗酶酶学性质。该菌株的最佳产酶条件为:蔗糖3.75 g/L、尿素11.25 g/L、K₂HPO₄2 g/L、（NH4）2SO₄1 g/L、Mn SO₄0.25 g/L、猪油乳化液体积分数2.5%,初始p H9.0、培养温度30℃、装样量20 m L/250 m L、接种量3%、发酵时间20 h。JXJ-16脂肪酶粗酶对中链对硝基苯酚酯有最大水解活力,最适底物为对硝基苯酚辛酸酯;该粗酶在35℃、p H8.5⁹.0时酶活力最高,且具有较好的温度（30⁶0℃）和p H（5.0¹0.5）稳定性;Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、EDTA对粗酶活力具有激活作用,Zn²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺对粗酶活力具有抑制作用,K⁺对粗酶活力没有显著性影响;除乙醇和乙腈外,该粗酶在一定体积分数的异丙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、二甲苯和正己烷中具有良好耐受性,且处于激活状态。综上,该菌株能利用廉价易得的培养基原料达到最佳产酶效果,其所产脂肪酶为低温碱性脂肪酶,具有较好的温度和p H稳定性,对多数供试有机溶剂具有良好耐受性。      

米曲霉As-W6脂肪酶的分离纯化及酶学性质研究

米曲霉As-W6的脂肪酶发酵上清液经硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-52纤维素离子交换层析和Sephadex G-75葡聚糖凝胶过滤层析纯化后得到电泳纯的脂肪酶,纯化倍数为86.7倍,回收率为23.2%,相对分子质量为40.8 ku,酶学性质研究结果表明,该脂肪酶最适反应温度和最适p H分别为40℃和7,在40℃以下和p H6⁸之间有较好的稳定性;Ca2+、Mg2+和丙酮能够明显促进提高脂肪酶的活性,而Cu2+、Fe2+、Mn2+和SDS对其有显著抑制作用;当大豆油作为底物时该脂肪酶的酶活力最高,表明其对大豆油具有显著的特异性。      

中国蛤蜊内源酶性质的研究

研究了中国蛤蜊的肌肉与消化腺中内源酶的性质。结果表明:1中国蛤蜊肌肉中蛋白酶最适温度为60℃,最适p H为7.0与9.0,可能存在同工酶;Pb2+对蛋白酶活力有激活作用;Ca2+对酶活力有抑制作用;Mg2+与Cu2+在5mmol/L时,对酶活力有激活作用,随着浓度升高对酶活力有抑制作用;Mn2+在5~15 mmol/L时,对酶活力影响不大,在20 mmol/L时对酶活力有激活作用。2消化腺中蛋白酶最适温度为60℃,最适p H 8.0;Pb2+对蛋白酶活力有激活作用;Mn2+对酶活力有抑制作用;Mg2+与Ca2+在5 mmol/L时,对酶活力有抑制作用,随着浓度升高有促进作用。Cu2+在5~15 mmol/L时对酶活力有促进作用,当浓度为20 mmol/L时,对酶活力有抑制作用。3肌肉中淀粉酶最适温度为40℃,最适p H 10.0;Mn2+、Ca2+对淀粉酶活力有促进作用;Pb2+在5~10 mmol/L时对酶活力有促进作用,在15~20 mmol/L时对酶活力有抑制作用;Mg2+在5~10 mmol/L时对酶活力有抑制作用,在15~20 mmol/L时对酶活力有促进作用;Cu2+在5 mmol/L时对酶活力有促进作用,随着浓度升高,对酶活力有抑制作用。4消化腺中淀粉酶最适温度为40℃,最适p H为9.0;Ca2+在20 mmol/L时对淀粉酶活性有促进作用,低于此浓度有抑制作用。Pb2+、Mg2+、Cu2+和Mn2+对淀粉酶活性皆有不同程度的抑制作用。     

一株产酸性α-淀粉酶产生菌的分离鉴定及所产酶学特性的初步研究

从食醋厂内土壤中分离得到一株产酸性α-淀粉酶能力较强的菌株,通过形态学和ITS区基因序列分析的手段对其进行鉴定,对其生长温度及发酵液初始p H值等生物学特性进行分析,并对其所产酶的特性进行研究,研究结果表明:通过形态学及分子生物学鉴定为黑曲霉,并命名为Aspergillus niger ZTL;菌株最适生长温度为35℃;最适产酶温度为40℃;最适生长p H值为6.0,最适产酶p H值为5.0;所产α-淀粉酶在p H值4.5~7.0时酶活性保持在80%以上;该酶的最适作用温度范围是40~50℃;通过测定该酶的热稳定性表明,在40~50℃时酶较稳定,但在60℃时保温一段时间后,酶稳定性显著下降;Ca2+对该酶有一定的激活作用,Na+对该酶的活性作用不明显,而Mg2+、Fe2+和Cu2+对酶的活性均有比较明显的抑制作用;该酶的Km值为4.52×10-3g/L。从而确定该菌株所产的α-淀粉酶具有具有很大的开发价值。     

嗜冷菌对牛乳货架期的影响

采用Azocasein法和碱式滴定法对嗜冷茵产蛋白酶和脂肪酶的活力进行了测定.研究了嗜冷茵在原料乳中的生长规律.结果表明,嗜冷茵产蛋白酶和脂肪酶的最佳pH值为7.0,最适培养温度在30℃,产酶高峰分别出现在30 h和24 h,在最适培养条件下嗜冷茵数的动态增加与蛋白酶和脂肪酶活力变化趋势大致相同.原料乳在低温贮藏过程中,嗜冷茵数与蛋白质、脂肪、水分、密度、pH值也存在有数学相关性.     

重组脂肪酶X12-5的大规模发酵及其酶学性质研究

实验室保藏的一株产脂肪酶基因工程菌X12-5,经过摇瓶发酵,测得酶活力为65U/mL。为进一步提高酶活力,应用于工业生产,将其进行上罐（180L）发酵。大规模发酵后,酶活高达220000U/g,实现了脂肪酶的高效表达。对其酶学性质研究表明,最适温度和pH分别为45℃和7.0;pH在4.0～7.0,温度在50℃以下酶活相对稳定;Mg2+、Mn2+、Ca2+对酶活有明显促进作用。由该脂肪酶的酶学性质初步判断其在制革工业上具有潜在的应用价值。      

天山冰川假单胞菌产低温脂肪酶发酵条件优化及酶学性质研究

针对一株从天山一号冰川沉积层中得到的假单胞菌T1-39,优化其产低温脂肪酶发酵条件,研究低温脂肪酶部分酶学性质,采用p-NPP法测定酶活力,设计产酶培养基成分及培养条件。确定产酶培养基成分为:葡萄糖5 g/L、胰蛋白胨5 g/L、(NH4)2SO4 5 g/L、K2HPO4 2 g/L、橄榄油乳化液50 mL/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。优化后培养条件为250 mL摇瓶装液量为20 mL,培养温度15℃,初始pH为9。在优化发酵条件下,菌株发酵液低温脂肪酶酶活力可达到9.77 U/mL,较优化前(3.14 U/mL)提高了3.11倍。粗酶液最适反应温度为30℃,在60℃处理30 min后仍有40%的酶活,最适pH值为9,Mg2+、Zn2+、Ni2+、Ba2+对粗酶液有激活作用,而Sn2+、Cu2+对酶活均有不同的抑制作用。     

碱性脂肪酶产生菌的筛选及产酶条件的优化

通过固体平板法从含油脂土样中筛选出一株产碱性脂肪酶活力较高的菌株 ,鉴定为解淀粉芽孢杆菌。此菌最佳产酶条件为 :1%淀粉为碳源 ,2 %黄豆粉和 2 %玉米粉为氮源 ,培养基起始 pH 7.0 ,3 0℃培养 72h。对发酵液性质进行初步研究发现 ,此酶最适反应温度为3 7℃ ,最佳反应 pH为 8.5。 0 .0 1mol/LCa2 + 和K+ 对酶有激活作用 ,而Cu2 + 和Fe3 + 则对该酶有抑制作用。     

金鲳鱼内脏脂肪酶的初步纯化及鱼皮酶法脱脂的工艺优化

以金鲳鱼内脏为原料,采用磷酸盐缓冲液提取,硫酸铵分级沉淀的方法,初步纯化得到内脏粗脂肪酶;分别探讨了不同反应温度和p H对上述粗脂肪酶活力的影响;研究了酶在罗非鱼皮脱脂中的应用,并通过单因素实验和响应面实验优化了鱼皮酶法脱脂工艺。结果表明,经硫酸铵分级沉淀后,金鲳鱼内脏粗脂肪酶的比活力达12.60 U/mg,纯化倍数为6.06,纯度达81.65%;其最适温度为45℃,最适p H为8.0,在0~50℃及p H6.0~11.0的范围内酶活力较稳定。金鲳鱼内脏粗脂肪酶对罗非鱼皮脱脂实验结果表明,在酶添加量90 U/g,p H7.5,温度37℃,作用时间60 min的条件下,罗非鱼皮脱脂率达67.02%±1.61%,说明粗脂肪酶能在温和条件下有效脱除鱼皮脂肪。本研究为金鲳鱼加工废弃物的高值化利用提供了一定的理论依据。      

理性设计提高华根霉脂肪酶对不饱和长链脂肪酸的底物特异性及其在大豆油水解中的应用

为了提高华根霉脂肪酶在大豆油水解制备脂肪酸中的应用效果,通过理性设计的方法改造脂肪酶的脂肪酸特异性。对突变酶的酶学性质进行了研究,并通过单因素实验优化脂肪酶催化水解大豆油的反应条件。结果表明:利用定点突变技术获得了一系列脂肪酸特异性改变的脂肪酶,其中突变酶HQL增强了对不饱和长链脂肪酸的特异性,并且对p-NPP(C16)的水解活力相比野生型提高了2.72倍;所有突变酶的最适温度和最适p H均为40℃和8.0,与野生型脂肪酶一致;得到脂肪酶催化水解大豆油的最适反应条件为反应时间24 h、水油质量比1∶1、加酶量500 U/g(以油质量计)、p H 8.0、温度40℃,在最适反应条件下,野生型酶催化大豆油水解率仅为80%,而突变酶HQL由于增强了对长链不饱和脂肪酸的底物特异性,对大豆油水解率提高到98%。     

恶臭假单胞杆菌肌酐酶在大肠杆菌中的表达及其酶学特性分析

肌酐酶(Creatininase)是肌酐酶法检测的一个关键酶,将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)肌酐酶基因(Cre)克隆至原核表达载体p ET-28a(+),通过IPTG的诱导,实现了肌酐酶Cre在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)的可溶性表达。表达产物经60℃加热处理、Ni-NTA亲和层析和Sephadex G-200分子筛层析,分离纯化出重组肌酐酶,回收率为29.3%,其比酶活达到489.17 U/mg,是已有文献中报道中的最高水平。进一步进行酶学特性分析,结果表明其最适反应温度为60℃,50℃以下可以稳定保存,具有良好的热稳定性;最适p H值为7.0,在p H 7.0~8.0条件下比较稳定;Cu2+会抑制肌酐酶的活性;Mn2+、Zn2+和Co2+对肌酐酶有明显的激活作用;EDTA、SDS、Tween-20、Tween-80和Trinton-100几乎对酶活力没影响;Na N3不影响酶的活力。以肌酸为底物时,酶动力学常数Km值为47.38 mmol/L。本研究在大肠杆菌系统成功实现肌酐酶的可溶性表达,进行分离纯化并测定其酶学性质,为肌酐酶的表达和潜在工业化应用提供理论基础。     

碱性果胶酯裂解酶的异源表达与性质研究

目的:异源表达、纯化特异性降解高甲酯化果胶的碱性果胶酯裂解酶,研究其酶学性质。方法:采用PCR方法从枯草芽孢杆菌7-3-3中扩增到编码碱性果胶酯裂解酶的结构基因pel B,将去信号肽基因序列连接甲醇诱导型质粒p PIC9K,得到重组质粒p PIC9K-pel B,并转入毕赤酵母GS115进行表达,对该表达产物进行酶学性质分析。结果:纯化得到Pel B及其糖基化蛋白,糖基化不影响Pel B的酶活力。该酶可降解甲酯化程度为85%的果胶,比酶活达2 746 U/mg。在最适反应温度60℃,最适反应p H 9.0,45~65℃和p H 8.5~9.5范围具较高的酶活力。在40℃以下,p H 7.0~10.6的碱性范围,酶具有较高的稳定性。结论:Pel B蛋白对高度甲酯化的果胶底物具有高解聚能力,在碱性条件下稳定,提示其具有良好的应用价值。     

一株碱性脂肪酶产生菌的分离、鉴定及其酶学性质研究

从富油土壤样本中分离出一株耐碱性脂肪酶产生菌A6,初步确定为耶尔森氏菌属。酶学性质研究表明,该酶反应的最适反应温度为40℃,最适p H值为9.0。在p H值7.0~9.2的范围内,酶活性仍维持在80%以上,为碱性脂肪酶。