优化乳杆菌高产共轭亚油酸的研究进展

共轭亚油酸(CLA)是亚油酸(LA)的一组位置和空间异构体的总称,其中具有生理活性的异构体是c9,t11-CLA和t10,c12-CLA,它们具有丰富的营养价值和医药价值。在乳球菌属和链球菌属等乳酸菌、丙酸杆菌、瘤胃细菌以及其它菌属中,分离纯化得到的亚油酸异构酶,可催化LA异构化为CLA,利用酶法合成CLA可以有效弥补传统化学合成法的缺陷。本文概述了近年来国内外利用紫外、微波、等离子体诱变、离子注入等物理或化学方法诱变、改造亚油酸异构酶,优化产酶条件和酶学特性,还阐述利用定点突变、基因敲除等基因工程方法,对生产菌株进行改造和培养条件优化,提高CLA产量的相关研究,为进一步筛选出高产共轭亚油酸菌株和CLA的产业化应用提供理论依据。     

植物乳杆菌p-8转化亚油酸为共轭亚油酸的分析

研究植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）p-8的菌体、菌体破碎液和重组亚油酸异构酶系转化亚油酸（linoleic acid,LA）为共轭亚油酸（conjugated linoleic acid,CLA）的能力和机制。结果表明：L. plantarum p-8在含有LA的MRS上清液和菌体破碎液体外催化LA时,都可以低效产生cis9,trans11-CLA（c9,t11-CLA）、trans10,cis12-CLA（t10,c12-CLA）和trans9,trans11-CLA（t9,t11-CLA）,但菌体中只有很少的t10,c12-CLA。实时聚合酶链式反应结果表明,亚油酸异构酶系的表达水平较低可能是CLA产量较低的原因。独立表达的重组亚油酸异构酶系成员、黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin denine dinucleotide,FAD）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸都存在才可完成LA转化为c9,t11-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA,转化途径与L. plantarum AUK1009一致。L. plantarum p-8的亚油酸水合酶经同源建模后有3 个结构域,底物结合位点与FAD位点位于3 个结构域连接处的疏水空腔中,M76和Y180是2 个必需基团。     

痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶在毕赤酵母中的异源表达 及其静息细胞催化合成共轭亚油酸

来源于痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）的亚油酸异构酶（PAI）是一种能够通过单酶催化,生成共轭亚油酸（t10,c12-CLA）的亚油酸异构酶。为实现PAI的高效表达,以pPink为表达载体,毕赤酵母（PichiaPinkTM Strain2）为宿主菌,构建毕赤酵母重组菌株（Pichia-pPink-His-opai）,实现了PAI在毕赤酵母中的异源表达。对毕赤酵母重组菌进行初步筛选获得蛋白表达量最高的转化子,通过单因素实验优化毕赤酵母重组菌的诱导条件。毕赤酵母重组菌最佳诱导条件为：诱导时间24 h,诱导剂甲醇体积分数2%。在最佳诱导条件下,将毕赤酵母重组菌制成静息细胞催化剂催化合成t10,c12-CLA。在28 ℃、200 r/min、亚油酸质量浓度4 g/L、反应时间6 h条件下,t10,c12-CLA产量为2.12 g/L,转化率可达53%。     

乳酸菌制备CLA的研究

我们利用从酸菜汁中分离出的一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarumL18转化亚油酸(LA)来制备共轭亚油酸(CLA)。在MRS培养基中添加0.06%(wt/vol)的LA作为诱导剂,获得制备CLA的洗涤细胞。以游离LA为底物,植物乳杆菌Lactobacillus plantarumL18的洗涤细胞为催化剂,厌氧环境有利于生成CLA。0.1M的磷酸钠缓冲液、pH7.0、LA浓度2%(wt/vol)、细胞浓度为20%(wt/vol)、30℃,反应64h,CLA的产量最高。反应液中生成的CLA产物为c9,t11/t9,c11-CLA和t10,c12-CLA异构体的混合物。     

保加利亚乳杆菌诱导产亚油酸异构酶条件研究

亚油酸异构酶可由保加利亚乳杆菌经诱导产生,可以将亚油酸(LA)转化为共轭亚油酸(CLA)。本实验对诱导保加利亚乳杆菌产亚油酸异构酶的条件进行研究,利用紫外和气质联用仪(GC-MS)检测所生成的CLA。结果表明：在培养基中添加1.5‰(V/V) LA 时所产酶的共轭亚油酸转化率最高;温度为36℃,培养36h 为较适的培养条件;单独添加0.1%(m/V)的乳糖或0.1%(m/V)的氯化钠有利于诱导产酶;在培养基中直接添加LA 的效果优于培养3至12h 后再进行添加。诱导所产酶可将LA 转化为CLA,且含有9c,11t-CLA 异构体。     

瘤胃中干酪乳杆菌的亚油酸异构酶基因的克隆与表达

以从黄牛瘤胃中分离到的一株具有将亚油酸转化为c9,t11-共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Fx为出发菌株,提取其基因组DNA,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增得到1 700 bp大小的亚油酸异构酶(linoleic acid isomerase,LAI)基因片段,将该基因片段纯化后进行TA克隆,得到重组质粒p UCm-T-LAI,将重组质粒p UCm-T-LAI和表达质粒p ET-Dsb A同时进行双酶切,连接得到重组表达载体p ET-Dsb A-LAI,经PCR鉴定和酶切后,将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中,得到具有LAI活性的重组菌株,能将亚油酸转化为c9,t11-CLA,表明从Lactobacillus casei Fx成功克隆LAI,该研究将有助于深入了解不同瘤胃细菌特异性合成不同CLA异构体的LAI基因差异。     

酶法拆分制备共轭亚油酸功能单体

研究利用Lipase AYS催化甲醇和共轭亚油酸(CLA)进行酯化反应,以期对共轭亚油酸异构体进行拆分制备共轭亚油酸功能单体。通过考察酯化反应的影响因素,确定了最优反应条件为:Lipase AYS加酶量180 U/g,反应温度40℃,CLA与甲醇摩尔比1∶1,缓冲液p H 6.5。在最优条件下反应8 h,总酯化率为49.5%,分离产物可以得到甲酯相与脂肪酸相,甲酯相中c9,t11-CLA甲酯的拆分效率达到86.2%,脂肪酸相中t10,c12-CLA的拆分效率达到80.0%,两者回收率分别为72.4%和54.2%。     

产共轭亚油酸植物乳杆菌的筛选、鉴定与诱变

从传统泡菜中筛选得到1 株乳酸菌lp15 能够合成共轭亚油酸(CLA),经16S rRNA 全序列分析法和API 系统鉴定法鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。利用人工诱变方法,以lp15 为出发菌株,采用紫外线、硫酸二乙酯(DES)依次诱变处理,经进一步液体发酵复筛获得多株突变菌株,CLA合成能力较出发菌株提高了29.3%～52.2%。其中lp15-2-1 突变菌株为CLA 生成能力最高菌株,MRS 培养液中添加0.2mg/mL LA 培养48h,CLA 产量达30.13μg/mL。经气相色谱(GC)检测分析,产物中cis9, trans11- 共轭亚油酸(c9, t11-CLA)占76.5%,trans10, cis12-共轭亚油酸(t10,c12-CLA)占23.5%。     

响应面法优化重组亚油酸异构酶产酶条件

共轭亚油酸(CLA)广泛存在于多种食物中,具有减肥、抗癌、抗动脉粥状硬化和抗糖尿病等诸多生理活性。为了获得活性CLA高产,本文将突变的亚油酸异构酶克隆到大肠杆菌中表达,单因素试验确定最优产酶条件为发酵时间18 h、IPTG诱导浓度0.2mmol/L、20%装液、培养基初始p H7、诱导前菌体生物量OD_(600)=0.4、LA浓度0.5mg/m L、离子浓度0.02%;在此基础上采用响应曲面法优化重组大肠杆菌培养条件提高生产亚油酸异构酶的能力,根据响应面法实验结果分析显示,发酵时间、诱导前生物量和LA浓度对重组亚油酸异构酶的表达有显著影响且均为正效应。三个影响因素最佳组合为发酵时间19.5h、诱导前生物量OD600=0.47和LA浓度0.57 mg/mL,此时预测亚油酸异构酶催化LA转化为CLA最大量为143.33μg/m L。验证显示,发酵CLA的产量为141.75±0.14μg/m L,与预测产量相符;通过优化设计,提高了107.5%。     

一株植物乳杆菌转化生成共轭亚油酸的特性研究

报道了一株植物乳杆菌(L.plantarumLT2-6)发酵转化亚油酸(LA)生成共轭亚油酸(CLA)的特性研究。微氧环境有利于CLA的生成;温度为37℃、初始pH为7.0、底物LA浓度为0.075%时,菌体生长及CLA生成量较高。时间曲线结果表明,接种后8h,CLA开始生成;发酵24h时,CLA生成量达到最高(0.29g/L),LA转化率为387%。生成的CLA产物主要为cis9,trans11/trans9,cis11-CLA。     

乳酸菌洗涤菌体合成共轭亚油酸的研究

为了解瑞士乳杆菌L7(Lactobacillus helveticusL7)洗涤菌体生物合成共轭亚油酸(CLA)的能力,通过单因素和正交优化研究,确定了瑞士乳杆菌L7洗涤菌体合成c9,t11-CLA的最适条件:0.05mol/LPBS缓冲液(pH5.8)、1.00mg/mL亚油酸、23℃反应12h。在最适转化条件下,c9,t11-CLA产量达到0.54mg/mL。结果表明,洗涤菌体合成CLA的产量和分批发酵相近,可以继续进行瑞士乳杆菌L7固定化细胞发酵生产CLA的研究。     

产亚油酸异构酶的乳酸菌的筛选

对16株乳酸菌产亚油酸异构酶(linoleate isomerase)的能力进行分析,紫外分光光度法和气相色谱法分析发酵液中的共轭亚油酸(CLA),筛选出产亚油酸异构酶的乳酸菌,PCR扩增筛选出菌株的亚油酸异构酶基因,并对其进行序列分析.结果显示,通过紫外分光光度法检测16株乳酸菌中有9株菌可将亚油酸(LA)转化为共轭亚油酸(CLA);气相检测6株乳酸菌的发酵液中存在cis-9,trans-11 CLA和trans-10,cis-12 CLA两种同分异构体(各占CLA总产量的50％);成功扩增出鼠李糖乳杆菌与亚油酸异构酶密切相关的肌球蛋白交叉反应抗原(MCRA)基因片段.     

乙醇胁迫提高植物乳杆菌p-8的共轭亚油酸(CLA)转化率和相关酶转录水平

该文研究了在MRS培养基中添加0.05 mg/mL LA（Linoleic acid,LA）和不同浓度的乙醇时植物乳杆菌p-8的CLA（Conjugated linoleic acid,CLA）转化率和CLA合成相关酶转录水平的差异情况。结果显示,发酵液中的三种CLA异构体转化率都是在添加0.50%乙醇时最高,其中转化cis9,trans11-CLA（t9,t11-CLA）异构体最高,为2.49%,比不添加乙醇增加2.37倍。添加不同浓度乙醇的发酵液中trans10,cis12-CLA（t10,c12-CLA）转化率都是最低的。菌体中产生的CLA非常少,但规律与发酵液的基本一致。添加0.50%乙醇菌体中t9,t11-CLA转化率最高,其转化率仅为0.05%,比不添加乙醇增加了5倍。当乙醇浓度高于0.50%时,各种不同CLA异构体的转化率却都减少。结果表明CLA是在胞液内产生后再被运转到胞外的,一定浓度范围内的乙醇胁迫通过提高CLA合成相关的酶基因转录水平,进而促进了CLA的转化,可见CLA合成相关酶基因转录水平是造成CLA转化率差异的主要原因。结果为阐明植物乳杆菌p-8产CLA的分子机制和寻找有效提高CLA生成的调控手段奠定了基础。     

共轭亚油酸异构体生理功能的差异

介绍了共轭亚油酸不同异构体在降低机体脂肪积累、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化以及免疫调节方面的研究,讨论了不同共轭亚油酸异构体,尤其是顺9,反11-共轭亚油酸(c9,t11-CLA)和反10,顺12-共轭亚油酸(t10,c12-CLA)在生理功能上的差异,以期更有效地利用不同CLA异构体实现特有的生理功能。     

高纯度共轭亚油酸的制备

以红花籽油为原料,比较了2种高纯度共轭亚油酸(CLA)的制备方法:(1)碱法异构化-尿素包合、(2)皂化-尿素包合-碱法异构化。针对每种方法确定了尿素包合和碱法异构化的最佳工艺条件,并对所得的CLA异构体组成进行了分析。研究表明:按照方法(2)先获得高纯度亚油酸(LA),再对其碱法异构化制备CLA可以得到纯度更高的产品。该方法在最佳反应条件下,制备得到的CLA的纯度为97.22%,收率为32.08%,其中c9t11-CLA含量为45.14%,t10c12-CLA含量为49.12%。     

响应面优化法尿素包合法分离共轭亚油酸2种异构体

目的优化尿素包合法,对共轭亚油酸2种主要异构体c9, t11-CLA和t10, c12-CLA进行分离(2种异构体比例近1:1)。方法在单因素实验基础上,以温度、尿素与油比例、乙醇与油比例3个因素为自变量,以t10, c12-CLA/c9, t11-CLA为响应值,利用响应面法优化了共轭亚油酸异构体的分离。结果优化后的实验条件为:在乙醇作溶剂的情况下,将共轭亚油酸、尿素和乙醇按1:2.5:5(V:V:V)配比,置于75℃水浴锅中水浴溶解,室温下搅拌冷却结晶。所得样品中t10,c12-CLA与c9,t11-CLA的比值高达2.47,且共轭亚油酸总量为97.3%。结论优化后的尿素包合法可有效分离CLA的2种异构体,提高t10, c12-CLA比例。     

含油酸培养基培养对重组解脂耶氏酵母全细胞催化合成反10,顺12-共轭亚油酸的影响

亚油酸异构酶(PAI)在解脂耶氏酵母细胞内成功表达,以添加外源c9,c12-亚油酸(c9,c12-LA)为底物,全细胞催化合成反10,顺12-共轭亚油酸(trans10,cis12-conjugated linoleic acid,t10,c12-CLA)。解脂耶氏酵母在分别含0.0(对照组)、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/L油酸的培养基中生长,收集菌体转移至磷酸盐缓液中进行全细胞催化,比较各组菌体的t10,c12-CLA产率,含5.0 g/L油酸组产物产率最高,达到1.34 g/g,是不含油酸组的1.4倍左右。通过PAI酶活分析及Western blot检测PAI表达量,结果表明,培养基中油酸含量越高,重组解脂耶氏酵母的PAI表达量越低;对比不含油酸组和含5.0 g/L油酸组全细胞催化不同时间的t10,c12-CLA产量,含5.0 g/L油酸组t10,c12-CLA产量最高点的时间比不含油酸组提前约20 h;透射电子显微镜观察2组的菌体状态,含5.0 g/L油酸组细胞壁和细胞膜间隙扩大,该变化可能增加了全细胞催化过程中底物和产物进出细胞的速率,从而提高t10,c12-CLA的转化效率。     

白地酶脂肪酶选择性酯化分离CLA异构体的研究

本文研究共轭亚油酸异构体的分离方法。利用白地霉脂肪酶(Geotrichumcandidumlipase,GCL)催化合成正丁酯的方法,考察温度、体系水分、酶用量、反应时间、底物配比对脂肪酶催化酯化率和脂肪酸丁酯中c9t11含量的影响。结果表明,经过酯化的脂肪酸丁酯层中c9t11CLA含量达到79.85%,t10c12CLA含量为4.59%;含有13.75%的油酸;c9t11CLA占共轭亚油酸两种异构体总含量的94.56%。形成c9t11CLA正丁醇酯的选择性系数平均为17.80。脂肪酸与正丁醇比例对脂肪酸酯中c9t11CLA含量具有显著性影响,在选取的范围内水分含量、酶用量的影响不显著。要得到较高c9t11CLA含量的脂肪酸产物,反应因子应选择:水分为0.50%,脂肪酸与正丁醇用量比为2.00∶1.00,酶用量为100U/g。白地霉脂肪酶对催化c9t11共轭亚油酸与正丁醇的酯化反应具有较高的选择性,因此,脂肪酶选择性酯化分离CLA异构体的方法是可行的。     

无溶剂体系酶法催化合成共轭亚油酸薄荷酯

在无溶剂体系中采用脂肪酶AY 30催化共轭亚油酸(CLA)和L-薄荷醇反应,合成共轭亚油酸薄荷酯。研究了酶用量、水用量、反应温度和反应时间对酯化率和产物共轭亚油酸薄荷酯组成的影响。结果表明:最佳酯化率的反应条件为酶用量2%,水用量8%,反应温度45℃,反应时间48h;产物中c9t,11-CLA含量最高时的反应条件为酶用量2%,水用量4%,反应温度40℃,反应时间12 h,在此条件下,产物中c9,t11-CLA含量可达86.32%。     

产共轭亚油酸菌株的筛选及其发酵性质研究

共轭亚油酸(CLA)是一类具有不同位置和几何异构体的十八碳二烯酸的总称。CLA因结构多样而具有不同的生理功能。目前研究较多的活性异构体为c9,t11-CLA和t10,c12-CLA。生物合成法因产物结构单一、安全性高而受到研究人员的青睐,然而其产量仍有待提高。本研究从内蒙古传统发酵乳中筛选鉴定到10种菌株,选择CLA产量较高的植物乳杆菌HB-01,测定其发酵性能。利用均匀设计优化发酵条件为接种量4%,LA添加量0.7 mg/mL,pH 6.5,发酵温度37℃,发酵时间32 h,4℃后熟12 h。