鹅红细胞Cu,Zn-SOD分离纯化及部分性质的研究

经氯仿-乙醇分级分离，丙酮沉淀及DE-32纤维素柱层析的方法，从鹅红细胞中得到纯化的Cu，Zn-SOD。结果表明此酶的比活力为10656．14U／mg，提纯倍数为354．73，聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白带与活性带相对应。相对分了量约为32000，相对亚基分子量约为16000。最大紫外吸收波长为258nm，列KCN和H202敏感，最适pH为6～9，热稳定性在60℃以下。     

重组谷氨酸脱羧酶的分离纯化与酶学性质研究

利用大肠杆菌原核表达系统获得高活力重组谷氨酸脱羧酶(GAD)并对其酶学性质进行分析。结果表明,纯酶比活力为9.9 U/mg;最适p H为4.6,最适温度为40℃,重组酶有良好的热稳定性,在70℃处理30 min仍有80%活性,在0℃保存一个月基本不失活;辅酶PLP及金属离子Fe2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+对重组酶活力都有一定的促进作用,其中PLP最适浓度为0.005 mmol/L;吐温20作为非离子表面活性剂对重组GAD活力有促进作用,而阴离子表面活性剂SDS对其活力有明显抑制作用;有机溶剂异戊醇对其活力有促进作用。重组GAD的Km=23.33 mmol/L,Vmax=1.133μmol/(min·L)。     

黄瓜过氧化物酶的分离纯化及酶学性质

新鲜的黄瓜经匀浆、抽提、硫酸铵沉淀、CM-Sepharose 离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析后获得电泳纯的过氧化物酶。该酶的比活力、回收率及纯化倍数分别为64 177.67 U/mg、9.58%、61.93。该酶的分子质量为41.15 kD,亚基分子质量为40.21 kD。该酶的最适温度和最适pH值分别为60 ℃和6。在25～45 ℃及pH 5～9的范围内非常的稳定。在测定条件下测得该酶的Km值为53.79 mmol/L。硫氰化钾对该酶活力基本无影响。尿素、K+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Cu2+对该酶都具有激活作用且浓度至50 mmol/L时酶活力分别被激活至112%、127%、113%、128%、139%、199%、348%,然而十二烷基磺酸钠、抗坏血酸和草酸对该酶有强烈的抑制作用;Zn2+、甲醇、乙醇和异丙醇对该酶有一定的抑制作用。     

普鲁兰酶的分离纯化及部分酶学性质

对盐球菌(Halococcus sp.)Z1、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)所产的普鲁兰酶粗酶液的耐热耐酸性进行了比较研究,并采用(NH4)2SO4盐析、透析、DEAE-Sephadex A25阴离子交换、Sephadex G-100凝胶过滤对Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶进行分离纯化,并测定了其部分酶学性质。结果表明Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶在低于65℃和pH4.0~7.5范围内有很好的稳定性,最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0~5.4,相对分子质量为8.17×104,Km值为0.24 mg/mL。     

氨基甲酸乙酯水解酶的分离纯化及酶学性质

氨基甲酸乙酯是发酵食品生产过程中的副产物,具有致癌性和遗传毒性,影响食品安全。酶法降解氨基甲酸乙酯是一种高效安全的去毒方法。从小鼠肠道筛选得到一株具有降解氨基甲酸乙酯活性的赖氨酸芽孢杆菌。通过对其细胞破碎上清液进行硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析和凝胶层析分离纯化,得到了氨基甲酸乙酯水解酶纯酶。SDS-PAGE电泳图显示,该酶亚基分子量约为50 k Da。该酶最适反应温度为35℃,最适p H值为7.0,在10~45℃时,具有良好的热稳定性。以氨基甲酸乙酯为底物反应,其Km和Kcat分别为37.2 mmol/L和1 176.4 s-1。金属离子显著抑制酶活力,而EDTA对酶活力无影响,表明此酶为非金属酶。此外,该酶对低浓度的Na Cl和乙醇有一定的耐受性,具有在酱油和黄酒中去除氨基甲酸乙酯的应用潜力。     

低温脂肪酶的分离纯化及酶学性质

苏云金芽胞杆菌CZW001脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、超滤离心、DEAE-纤维素-52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析得到电泳纯的脂肪酶,纯化倍数为75.5倍,活性回收率为37.6%,12%SDS-PAGE电泳估计其相对分子质量约40 000。对纯化后的脂肪酶进行酶性质研究表明:酶的最适作用温度为25℃,对热敏感,60℃处理30 min仅残留30%酶活性;酶的适宜作用pH范围在7～9,最适pH为8;该脂肪酶的水解活性对Ca2+表现明显的依赖性,Al3+、Zn2+和Fe2+对脂肪酶有显著的抑制作用;脂肪酶对醇类有机溶剂的耐受性随碳链增加而减小;脂肪酶对豆油表现出显著的特异性,而蓖麻油抑制脂肪酶水解活力。     

金银花过氧化物酶的三相分离纯化及酶学性质

采用三相分离法提取纯化金银花中过氧化物酶,结果表明最优纯化条件为pH?5.60、硫酸铵质量浓度39.49?g/100?mL、提取液与叔丁醇体积比1∶1.38,在该条件下纯化倍数为5.849,回收率为87.64%。金银花过氧化物酶比活力为1 021.6 U/mg,色素清除率为92%;酶学性质研究表明:金银花过氧化物酶最适温度为30℃,热稳定范围为10~40℃;最适pH值为5,pH值稳定范围为4~7。在金银花过氧化物酶催化的双底物酶促反应中,当H_2O_2浓度一定时,酶对愈创木酚的Km值为8.12?mmol/L,vmax值为1.71?mmol/(min·L)。当愈创木酚浓度一定时,H_2O_2的Km值为0.822?mmol/L,vmax值为1.38?mmol/(min·L)。金银花过氧化物酶与底物的亲和力由强到弱依次是邻苯三酚、邻苯二酚、联甲氧基苯胺、愈创木酚。Ca~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)对金银花过氧化物酶有激活作用,Mg~(2+)、Mn~(2+)、柠檬酸、抗坏血酸、L-半胱氨酸、亚硫酸钠、偏重亚硫酸钠、十二烷基磺酸钠对金银花过氧化物酶有不同程度的抑制作用。     

藕带过氧化物酶的分离纯化及酶学性质

研究藕带中过氧化物酶(POD)的提取和纯化技术,以及温度、pH值和部分化学物质对POD酶活性的影响。结果表明:藕带中的过氧化物酶提取物经过40%饱和度的硫酸铵除杂、80%饱和度的硫酸铵沉淀、DEAE-52纤维素柱层析(100mL,0.1 mol/L NaCl的pH 7.2的磷酸缓冲溶液洗脱)、葡聚糖凝胶G-75柱层析(pH 7.2的磷酸缓冲溶液洗脱)进行分离纯化后,经SDS—PAGE鉴定为单一带,其分子量约为42kD,纯化倍数及蛋白质产率分别为32.68倍和2.11%。藕带中POD的最适温度为40℃,最适pH值为5.0。温度高于80℃基本失活,pH值小于2.0或大于8.0也基本失活。抗坏血酸对POD有明显的抑制作用;尿素、SDS、KSCN对POD具有轻微的抑制作用;草酸在低浓度时对POD具有激活作用,高于0.01 mol/L时有明显的抑制作用。     

黑曲霉-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

"绿色资源"纤维素广泛应用于能源、医药、食品等领域,β-葡萄糖苷酶(BGL)作为纤维素降解酶系的限速酶是当前研究热点之一。作者对黑曲霉利用豆渣发酵所产的胞外β-葡萄糖苷酶进行分离纯化,并对该酶进行了酶学性质表征。实验结果表明,BGL最适反应温度为55℃,最适反应p H为2.0~2.5,p H稳定范围为2.0~7.5。在最适反应条件下,K_m值为8.4×10~(-4)mol/L,kcat为16 s~(-1),催化效率k_(cat)/K_m为1.92×10~4L/(mmol·s)。相比较其他报道的BGL酶,该酶具有更好的耐酸性能,可为BGL的理论研究与酶制剂的生产应用提供一定基础。     

丝瓜多酚氧化酶的分离纯化及酶学性质

从丝瓜中分离纯化出多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）,并对其部分酶学性质进行研究。采用硫酸铵分级盐析、透析、DEAE-Cellulose DE-52离子交换层析和Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析分离纯化丝瓜PPO。纯化所得酶的比活力为957.9 U/mg,纯化倍数为28.3,酶活力回收率为18.5%;十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）检测结果显示该酶蛋白呈单一条带,为单亚基蛋白,其分子质量约为67.8 kD,且无同工酶;该酶最适pH6.0,最适温度30 ℃,以左旋多巴（L-dopa）为底物,其米氏常数（Km）为1.32 mmol/L,最大反应速率（Vmax）为0.22 OD475 nm/min。     

牛肾溶菌酶的分离纯化及部分酶学性质

将新鲜牛肾匀浆后,经由缓冲液提取,正丁醇除脂,硫酸铵分级沉淀,CM-Sepharose阳离子交换层析,Superdex-200凝胶过滤层析后得到电泳纯的牛肾溶菌酶。结果表明：该酶比活力为15 145.63 U/mg,回收率为29.13%,纯化倍数为231.05;分子质量约12.66 kD,为单亚基酶。最适反应温度为65 ℃,在65 ℃以下较稳定;最适pH 9.0,pH值在3.0～9.0范围内稳定性较好;测得最适条件下牛肾溶菌酶对溶壁微球菌的Km值为0.399 μg/mL;甲醇、乙醇、异丙醇和硫氰化钾（KSCN）对该酶有激活作用;十二烷基硫酸钠、Pb2＋、Ag＋对该酶有明显抑制作用。     

谷氨酰胺转胺酶的分离纯化及酶学性质

茂原链轮丝菌Streptoverticilliummobaraense所产生的谷氨酰胺转胺酶发酵液通过抽滤、超滤、乙醇沉淀、离心和冷冻干燥,制得粗酶粉的酶活约为1033U/g.对粗酶研究发现,该酶的最适反应温度为52℃,最适pH为6.0;粗酶的pH稳定范围在4～8,温度稳定范围在20～40℃,离子强度对该酶的活性稍有影响.粗酶经CM 纤维素层析和SephadexG 75凝胶过滤层析后得到较纯的酶,通过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检验蛋白质纯度,得到较弱的单一区带.其中,CM 纤维素层析的纯化倍数为4.5,收率质量分数约为78.8%;凝胶过滤层析纯化倍数为1.11,收率质量分数为50%;用凝胶过滤法测得谷氨酰胺转胺酶的相对分子质量为40092.     

蒜氨酸酶的分离纯化及其酶学性质测定

大蒜中功能成分含硫化合物是由蒜氨酸酶(alliinase,E C4.4.1.4)催化蒜氨酸(alliin)生成的。本实验通过提取、盐析、透析及层析,自新鲜大蒜中分离纯化出蒜氨酸酶,并测定了蒜氨酸酶的酶学性质。蒜氨酸酶的适宜分离纯化过程及条件为:pH7.0Na /K 磷酸缓冲液提取,45%饱和度NH4(SO4)2盐析,10000×g离心沉淀30min,pH6.5的Na /K 磷酸缓冲液溶解,截留1.4万分子量透析袋透析,Sephadex G-200层析,收集洗脱时间4.75h的洗脱液。蒜氨酸酶最适温度和pH值分别为30℃和6.3,Mg2 、Zn2 、Fe2 、Fe3 、EDTA-Na金属离子对蒜氨酸酶有激活作用,Fe3 激活作用最明显,Cu2 严重抑制蒜氨酸酶活性。以合成S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜为底物,蒜氨酸酶的Km为5.91mmol/L、Vmax为1.55μmol/min。     

青霉菌柚苷酶的分离纯化及酶学性质

对来源于Penicillium sp.1523的柚苷酶分离纯化工艺进行了系统分析,依次采用超滤、硫酸铵盐析和Sephadex G-200凝胶过滤层析操作对柚苷酶进行逐级纯化,通过SDS-PAGE电泳对各步骤的纯化结果进行分析鉴定,并考察了温度、pH及不同金属离子对酶活性的影响。结果显示纯化后的柚苷酶比活力达到4478.76U/mg,纯化倍数为11.99倍,活力回收率为38.10%。纯化后的柚苷酶经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定显示两条清晰的条带,说明该酶由两个亚基组成,其分子量分别为89ku和72ku;同时酶学性质研究发现最适温度为50℃,热稳定性不理想,最适pH为4.0,Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、EDTA、Cu2+对该酶酶活有促进作用,而Fe2+、SDS在低浓度时便对柚苷酶酶活表现出抑制作用。本研究为青霉菌柚苷酶的大规模生物转化及分子改性提供了实验基础。     

短短芽孢杆菌几丁质酶的分离纯化及酶学性质

探讨来源于短短芽孢杆菌FM4B的几丁质酶（chitinase）分离纯化过程及其性质。菌株FM4B摇瓶发酵液经过离心、乙醇分级沉淀及葡聚糖凝胶G-100层析纯化,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳确定其分子质量。结果获得几丁质酶纯品,酶的纯化倍数为7.19,酶活回收率为30.6%,分子质量为66 kD;酶活力在pH 5.0～9.0和80 ℃以下稳定,最适pH值为6.0,最适温度为50 ℃;Cu2+、Hg2+、Pb2+、Co2+以及Zn2+对该酶有强烈的抑制作用,Mg2+ 和Ca2+对该酶的活力具有一定的促进作用;该几丁质酶对多种霉菌有显著的抑菌效果。菌株FM4B分泌的几丁质酶稳定性好,且对多种霉菌抑制效果明显,具有较高的潜在利用价值。     

重组水稻 α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

对重组水稻α- 半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质进行研究。结果表明：该重组酶分子质量约为59kD;最适酶反应温度为45℃,最适pH 值为5.0;酶活力在0～20℃,pH4.0～7.0 最为稳定;酶学动力学常数Km 为0.78mmol/L,Vmax 为10.16mmol/(mg·min)。多数的金属离子和有机离子对酶催化作用没有影响,Hg2+、Ag+及－ SH 基团抑制剂p-chloromercuribenzoic acid(pCMB)对酶活性有强烈抑制作用。     

大豆谷氨酸脱羧酶分离纯化及酶学性质研究

对大豆中的谷氨酸脱羧酶(GAD)进行了提取、纯化及酶学性质的研究.采用硫酸铵分级沉淀技术对大豆中GAD进行了纯化,该酶被纯化了4.7倍.纯化后的大豆GAD最适温度为40℃,最适pH为5.9,大豆GAD的热稳定性较差,在80℃几乎失去活性,但该酶在pH5.0～8.0较稳定,能保持很好的酶活.大豆GAD对底物谷氨酸的Km值为19.4 mmol/L.Mg2、KCl对大豆GAD活性影响不大,但KI、Ag+、SDS对大豆GAD有抑制作用.Ca2+对大豆GAD有激活作用,当Ca2浓度为1 500 μmol/L时,对大豆GAD激活作用最强,相对酶活能达到160％.大豆GAD与其他植物GAD相比存在差异,并证实可被Ca2+激活.     

环糊精葡萄糖基转移酶分离纯化及酶学性质研究

通过筛选和诱变获得一株高产环糊精葡萄糖基转移酶芽孢杆菌菌株,研究该菌所产环糊精葡萄糖基转移酶的分离纯化及酶学性质,结果显示：发酵液经离心处理后,采用硫酸铵溶液分步盐析、DEAE-cellulose 52 离子交换层析、Sephadex G-200 凝胶过滤层析方法得到电泳级环糊精葡萄糖基转移酶,SDS-PAGE 电泳显示该酶分子量为33kD,纯化倍数为10,得率为14.4%。该酶反应的最适温度为50℃,在40～60℃基本稳定,最适pH 值为8.0,在pH6.0～10.0 范围内基本稳定。Fe2+、Cu2+、Mg2+ 对该酶活力有明显的抑制作用。     

云南莴笋尖酪氨酸酶分离纯化及酶学性质

为获得更多成本廉价且易得的酪氨酸酶来源,为云南莴笋尖酪氨酸酶抑制剂的研究提供参考,选取云南莴笋尖为实验材料,通过匀浆、缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析等方法纯化,获得电泳纯的酪氨酸酶,并对纯化后的酪氨酸酶进行部分酶学性质研究。结果表明,云南莴笋尖中酪氨酸酶的比活力为20.62 U/mg,分子质量约为995.40 k D,亚基分子质量约为65.23 k D。最适反应温度和最适反应p H值分别为60℃和8.0,在p H 6.0~8.0及20~40℃范围内较稳定。最适条件下,以左旋多巴为底物的K_m值为1.567 mmol/L,vmax为0.037 6 μmol/(min·L)。乙醇、异丙醇、正丁醇对该酶活性有不同程度的抑制作用;甲醇、Co~(2+)、Mn~(2+)、Pb~(2+)、Ag~+、Cd~(2+)、Ba~(2+)、Ca~(2+)对该酶活性有不同程度的激活作用,Co~(2+)、Mn~(2+)对该酶具有显著的激活作用,低浓度的Zn~(2+)、Cu~(2+)、草酸、抗坏血酸对该酶有激活作用,高浓度时有抑制作用。尿素、EDTA、Li~+、K~+、Mg~(2+)对该酶活性影响较小。     

海藻糖合成酶的分离纯化及部分酶学性质研究

食尼古丁节杆菌JNU-1（Arthrobacter nicotinovorus JNU-1）菌株所产胞内海藻糖合成酶，该酶能转化麦芽糖合成海藻糖，将食尼古丁节杆菌JNU-1进行大量的培养，富集发酵菌丝体，经超声破碎、浸提、离心后获得粗酶液，粗酶液经硫酸铵分级沉淀后，收集相应的活性部分，用葡聚糖凝胶进一步纯化，通过电泳来测定海藻糖合成酶的纯度和分子量。